Name: 표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리 전의 VIVO 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 학습하세요 인간 피부 생검에서 피부 거주 T 세포를 효율적으로 분리하는 방법을. 기계적 및 효소적 분해를 통해 단일 세포 현탁액을 제조하고 유동 세포측정법으로 분석합니다. 이 프로토콜은 피부 면역학 연구에 필수적인 생존 가능한 림프구를 충분히 확보합니다.

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건선 환자의 피부 조직 검사는 친절 박사 안드레아스 Koerber 과학적인 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 (에센, 독일의 대학 피부과 부서)에 의해 제공되었다. XH도 NSFC 61263039과 NSFC 11101321에 의해 지원됩니다.

참고 : 건강한 사람에서 피부 조직 검사가 과학적 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 선택 과목 성형 수술을받은 개인의 복부 피부에 남은에서 얻었다. 인간의 피부의 사용은 승인 된 Radboud 대학 의료 센터, 네이 메헨, 네덜란드, 독일 에센 대학의 인간 연구를위한 의료 윤​​리위원회가 설정 한 규정에 따라한다. 인간의 피부에서 단일 세포 현탁액 1. 준비 (흐름 캐비닛에서 작업 멸균 이후 세포 배양 경우 필수) <ol><li> 세포 배양 배지를 준비 : 없음 혈청 RPMI 1640 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (ml의 최종 농도 100 단위 / 100 μg의 / ㎖, 각각) + 피루 베이트 (0.02 밀리미터)와 루타 (0.02 mM)을 추가. </li><li> 완전 배지 준비 : 배양액 단계 1.1 + 10 % 인간 혈청 풀 (HPS)에서 제조; 4 ℃에서 저장한다. 우리 앞에 20 ° C ± 2 중간 가져와ING. </li><li> 4mm 라운드 생검 펀치기구를 사용하여 피부 조직 검사를 구하여 최대 4 시간 동안 4 ° C ON에서 20 ° C ± 2에서 RPMI1640 전체 문화 매체에 보관합니다. 실험실에 도착하면 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다. 참고 : 피부의 이상 저장 셀 수율 및 세포 생존에 영향을 미칠 것이다. </li><li> 푸른 덮인 해리 튜브 레이블과 레이블이 튜브에 5 ml의에게 완전한 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 멸균 6 웰 배양 판 (총 3 웰)를 각 웰에 완전 배지 2 ㎖를 추가합니다. 따라서 세 린스의 총을 달성, 단일 잘으로 조직 검사를 배치 린스, 두 번째 아니라 그것을 통해 이동하고이 단계를 한 번 더 반복 살균 도구를 사용합니다. </li><li> 멸균 페트리 접시로 잘 헹구고 피부 생검 전송 생검의 위에 완전 배지 100 ㎕를 추가하고, 신중 스테인리스 일회용 무균 메스를 이용한 피하 지방층을 긁어. 참고 : 목하는 중요한 단계입니다. </li><li> 멸균 페트리 접시에 4 작은 조각으로 각각의 피부 조직 검사를 잘라. 전송 샘플 (튜브 당 최대 4mm 생검 네) 완전 배지 5 ㎖를 함유하는 제조 해리 튜브. </li><li> 단단히 캡 튜브를 닫고, 자동화 된 조직 dissociator의 소매에 거꾸로 연결합니다. 모든 샘플 재료는 회 전자의 지역에 위치하고 있는지 확인합니다. </li><li> &quot;프로그램 m_spleen의 _01&quot;56 초에 해당하는 회전 속도로 조직 검사를 해리 (첨부 된 프로그램 카드 기기의 내부 메모리 또는 제공하는 미리 정의 된 프로그램)을 실행하여 해리 프로세스를 시작합니다. </li><li> 처리 후, dissociator에서 분리 튜브를 분리하고 모든 해리 물질이 튜브의 바닥에서 수집되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 37 진탕 수조에서 분리 튜브에 콜라게나 IA (80 ㎎ / ㎖) μL (150)를 추가하고 샘플을 품어60 분 동안 C를 °. thedissociation 튜브에의 DNase I 100 ㎕ (5 MU / ㎖)를 추가, 잘 섞는다. 주 : 콜라게나 제 또는 세포 생존을 변경한다 긴 배양 시간의 고농도. </li><li> 자동화 된 조직 dissociator의 슬리브로 분리 튜브를 연결하고 조직 검사를 한 번 더 해리하려면 &quot;프로그램 M_ 비장 _01&quot;를 실행합니다. </li><li> 50 ㎖의 팔콘 튜브의 상단에 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 놓습니다. 세포 덩어리 / 조직 파편을 제거하기 위해 셀 스트레이너에 해리 샘플 자료를 적용합니다. </li><li> 완전한 배지 5 ㎖로 한 번 셀 스트레이너를 씻으십시오. 20 °에서 원심 분리기 C ± 2, 10 분, 흡인 상층 액 450 XG. </li><li> 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 전체 문화 매체의 300 μL에 재현 탁 세포 펠렛. 단일 세포 현탁액은 추가 분석을 위해 준비; 생체 세포 배양을위한 프로토콜을 계속하거나 분석 유동 세포 계측법. </li><li> 상기 난 경우ntracellular 사이토 카인 염색은 37 ℃에서 4 시간 동안 PMA (12.5 NG / ㎖), 이오 노마 이신 (500 ng의 / mL) 및 Brefeldine A (5 μg의 / ml)로 세포를 자극하고, 5 % CO 2 인큐베이터 플로우를 실행하기 전에 4 시간 동안 세포 계측법 분석. </li></ol> 피부 주민 T 세포의 2 클론 활성화 (예 생체 세포 배양) <ol><li> 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 100 μL 분취 단일 세포 현탁액 (1.15 단계에서 제조). 주 : 4mm 피부 생검 각각에 대해 획득 된 단일 세포 현탁액을 96- 웰 플레이트 중 적어도 두 개의 우물로 분할 될 수있다. </li><li> 항 -CD3 / 항 CD28 단클론 항체 - 코팅 된 마이크로 비드 (웰 당 25,000 비드), 재조합 인간 사이토 카인 RIL -2- (최종 농도 25 U / ml) 및 RIL-1β (50 ng의 최종 농도 / ㎖)을 추가한다. </li><li> 5 % CO 2에서, 100 % 습도, 37 부화 잘 표지 접시 뚜껑 배양 플레이트 커버 C 배양기를 °. 중간 색상이 노란색으로 변합니다 때 매체를 변경합니다. <br/&gt; 참고 : 투명 세포 식민지가 세포 배양의 날 (8)에서 관찰 할 수있다. </li></ol> 3. 주요의 유동 세포 계측법 분석 / 배양 된 피부 주민 T 세포 <ol><li> PBS + 0.2 % BSA : FACS 버퍼를 준비합니다. </li><li> V 바닥 96 웰 플레이트에 관심의 세포를 전송합니다. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는. </li><li> PBS 100 ㎕에서 펠렛을 재현 탁. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는. </li><li> (: PBS를 사용하여 1,000 희석 1) 4 ° C에서 30 분 동안 고칠 가능성 염료를 결합 준비 eFluorescence780 100 ㎕와 얼룩 세포. 20 ° C ± 2, 450 2 분 XG 및 대기음 뜨는에 FACS 버퍼, 원심 분리기 100 μl를 추가합니다. </li><li> , 필요한 세포 표면 마커 모노클로 날 항체를 선택 예를 들면 : CD45-BV421 (HI30 1:20), CD3-ECD (UCHT1 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1 : 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1 : 400), CD14-FITC (TUK4 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188 1:50), CD25-PeCy7 (BC96 1:50)의 CD11c-PeCy7 (BU15 1:10), 및 CD1c-APC (AD5-8E7, 1시 10분) 시험 각 단클론 항체 희석 배수에 의한 FACS 완충액을 사용하여 모노클로 날 항체 - 혼합물을 제조한다. 비 얼룩 샘플과 함께 항체의 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 게이트 설정을 정의합니다. </li><li> 각 웰에 준비 단클론 항체 - 혼합물의 25 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호, 20 ° C ± 2시 20 분을 품어. </li><li> 20 ° C ± 2, 450 2 분 XG 및 대기음 뜨는에 FACS 버퍼, 원심 분리기 100 μl를 추가합니다. </li><li> 단지 세포 표면의 얼룩을 필요로 샘플 단계 3.16를 계속합니다. </li><li> Foxp3의 세포 내 염색시 : <ol><li> 희석제 3 부를 농축액의 일부를 혼합하여 고정하고 permeabilization 버퍼를 준비한다. </li><li> 1 배 permeabilization 버퍼를 준비 : 멸균 H 2 O 1 부 10 배의 permeabilization 버퍼 + 9 부 </li></ol></li><li> 고정 및 permeabili 100 ㎕에 재현 탁 펠릿zation 버퍼는, 잘 혼합, 4 부화 30 분 동안 C를 °. </li><li> 450 2 분 동안 실온에서 XG 및 대기음 뜨는에서 각 웰, 원심 분리기 100 μL permeabilization 버퍼를 추가합니다. </li><li> permeabilization 버퍼를 한 번 더와 세포를 씻으십시오. </li><li> 예를 들어 필요한 세포 내 모노클로 날 항체를 선택 Foxp3를-eFluo450 (PCH101 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1 1:50) 및 IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1 : 400). 각 시험 단클론 항체 희석 인자에 따라 2 % 정상 쥐의 혈청을 함유 permeabilization 완충액을 사용하여 모노클로 날 항체 혼합물을 준비한다. 비 얼룩 샘플과 함께 항체의 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 게이트 설정을 정의합니다. </li><li> 각 웰에 준비 단클론 항체 - 혼합물의 20 μl를 추가합니다. 4 품다 빛으로부터 보호 30 분 동안 C를 °. </li><li> 30 분 부화 후, 각 웰에 permeabilization 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는. </li><li> permeabilization의 buffe와 세포를 씻으십시오R 한 번 더. microFACS 튜브에 110 FACS 완충액 μL 및 전송 세포 현탁액에 재현 탁 펠릿. 참고 : 샘플 10 색 유동 세포 계측법 사용하여 측정을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 필요한 정확한 세포 수의 경우, 즉시 유동 세포 계측법 사용하여 측정을 수행하기 전에 각 샘플에 fluorospheres의 잘 혼합 된 균일 한 현탁액의 10 μl를 추가합니다. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

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여기서는 효율적으로 인간의 피부 생검으로부터 피부 상주 T 세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 장점은 가능한 림프구의 상대적으로 높은 수의 분리이고, 관련 표면 마커를 발현. 식별 된 셀의 서브 세트가 있었다 :하는 CD11c + 수지상 세포, CD4 + 및 CD8 + T 세포와 Foxp3의 + CD25 + 세포를 포함한다. 중요한 것은, 절연 피부 상주 T 세포의 생체 외 배양 잘 실현 후속 기능적 분석 하였다. 인간의 피부 조직의 구조적 일체 성을 유지하는 기능 외 부착 단백질의 분해 효소로 분해 기계적 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. 표피 및 진피의 디스 파제 기질 층 분리 이들 각 스킨 층의 세포 침투를 결정하기 위해 널리 사용되는 방법이지만, 우리는 디스 파제 처리 t 주도 눈치OA CD25 및 CD27의 세포 표면 발현...

피부는 몸과 환경 사이의 기본 인터페이스로, 외부의 물리적, 화학적 및 상처, 자외선 및 미생물 등의 생물 모욕에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 피부는 두 개의 주요 구획, 표피 및 진피를 포함하고, 랑게르한스 세포, 대 식세포, 수지상 세포, 및 약 200 억 메모리 T 세포를 포함하여 면역 세포의 다양한 전체 혈액량 한 거의 두 배가 존재를 포함 2. 증가하는 데이터 기관은 피부 조직의 항상성 동안 다양한 병리 적 상태 모두에서 중요한 면역 기능이 개념을 지원한다. 정상 피부에 상주 면역 세포 immunosurveillance 3을 수행하는 것으로 생각되고, 이러한 4 건선 같은 염증성 질환의 발달에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 건선 병변 피부에서 CD4 +와 CD8 + 모두 T 세포가 OBS했다 침투erved하고는 CD4 및 CD8의 비율은 질병 상태 (5)에 따라 다르다는 것을 나타내었다. 그러나, 이러한 세포의 집단은 기존의 기술은 단지 소수의 세포를 분리 할 수​​ 있기 때문에 연구하기가 어렵다. 인간 피부 T 세포의 분리를위한 현재 널리 사용되는 기술은 효소 처리로 기계적 피부 분리를 결합한다. 인간의 피부 조직 검사는 광범위하게 다진 및 트립신, 콜라게나 제 및 / 또는 EDTA 6-8와 같은 효소와 함께 배양한다. 피부 인장력 기계적 세분화에 매우 내성이 배리어 티슈 인 것을 고려하면, T 세포의 분리의 설정 방법은이 세포 집단 어렵고 생체 외 세포 배양한다 거의 세포 및 생존 세포의 더 낮은 수를 생산 도전적인. 여기, 우리는 mechan을 결합하여 건강하고 참여 모두 건선 인간의 피부에서 림프구를 분리하는 수정 방법을보고효소 소화 콜라 사용과 함께, 자동화 조직 dissociator 닦지 않고 광범위의 기존 방법을 사용하여 피부의 iCal 해리. 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포 생존 서브 세트는 단일 세포 현탁액을 제조 한 후 관찰되었다. 중요한 것은 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8의 발현이 잘 보존되었다. 이와 같이 제조 된 세포를 생체 외 세포 배양 또는 유세포 분석에 사용하기위한 준비가되어있다. 이 프로토콜은 성공적 건선 환자의 피부 병변에서 유래 된 단일 피부 생검 (4 ㎜)의 분석을 위해 사용되어왔다. 결과는 피부 거주 환자의 T 세포가 건강한 지원자 9 비교하여 IL-17, IFNγ와 같은 더 많은 염증성 사이토 카인을 생산 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>일회용 생검 펀치</td><td>카이 유럽</td><td>BP-40F</td><td>4mm</td></tr><tr><td>일회용 멸균 메스</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>파란 모자, 해리 튜브로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>gentleMACS 해리기</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>자동 조직 해리기. 피부 생검의 해리를 위해 "프로그램 spleen_01"을 사용합니다.</td></tr><tr><td>세포 여과기&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &마이크로; m 나일론</td></tr><tr><td>96-웰 U-바닥 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인간 세포</td> 배양에 적합한 <td>사내에서 준비</td><td></td><td></td>된</tr><tr><td>콜라겐분해효소 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A,</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>고정성 생존도 염료(FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>에 적합한 통합 혈청(HPS)65-0865-18</td><td>세포 고정 전에 죽은 세포를 염색; 1:1,000</td></tr><tr><td>고정/투과화 농축액</td>에서 PBS로 희석 <td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>고정/투과화 희석제</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>투과화 완충액 (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 마우스 anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>클론: 하이30; 희석 인자 1:50</td></tr><tr><td>FITC 마우스 anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>클론: TUK4; 희석 인자 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>클론: MOC-1; 희석 인자 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>클론: UCHT1; 표면 염색을 위한 희석 인자 1:50; 세포 내 염색을 위한 희석 인자 1:25.</td></tr><tr><td>PC5.5 마우스 안티-휴먼 CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>클론: 13B8.2; 희석 인자 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 마우스 안티-휴먼 CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>클론: BU15; 희석 인자 1:50</td></tr><tr><td>APC 마우스 안티-휴먼 CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>클론: AD5-8E7; 희석 인자 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 마우스 안티-휴먼 CD8</td><td>Beckman - 쿨터</td><td>A66332</td><td>복제: B9.11; 희석 계수 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 마우스 반인간 CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>복제품: J3-119; 희석 계수 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 마우스 반인간 CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>복제품: BC96; 희석 계수 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; PE 쥐 항-인간 CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>클론: HECA-452; 희석 인자 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 쥐 항-인간 Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>클론: PCH101; 세포 내 염색; 희석 인자 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 마우스 항인간 IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>클론: eBio64DEC17; 세포 내 염색; 희석 인자 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 마우스 항인간 IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>클론: 4S. 나3; 세포 내 염색; Dilution Factor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>카운팅 비드, 유세포 분석용</td></tr></tbody></table>

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 vivo</em&gt; 세포 배양

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

인간의 피부는 중요한 장벽 기능을 가지고 있으며, 병원균에서 조직의 항상성 및 보호에 기여하는 다양한 면역 세포가 포함되어 있습니다. 피부 액세스 비교적 용이하기 때문에, 이는 주변 면역 조절 메카니즘을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공한다. 면역 상주 건강한 피부 실시 immunosurveillance 세포 있지만는 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발달에서 중요한 역할을한다. 새로운 통찰력에도 불구하고, 다양한 염증성 피부 질환의 기초가되는 생물학에 대한 우리의 이해는 여전히 제한된다. 피부 생검 샘플로부터 분리 된 양질의 (하나의) 세포 집단이 필요하다. 지금까지 분리 절차 심각한 생존 세포의 충분한 수를 얻기의 부족에 의해 방해되어왔다. 분리 및 후속 분석 인해 수득 현재 분리 절차에 의해 야기되는 기계적 및 화학적 스트레스, 면역 세포 계통 마커의 손실에 의해 영향을받은단일 세포 현탁액. 여기서는 자동 조직 dissociator 및 콜라게나 제 처리를 사용하여 기계적 피부 분리를 조합하여 건강 관련 건선 모두 인간 피부 T 세포를 분리하는 개질 방법을 설명한다. 이 방법은 단일 세포 현탁액의 준비 시점에 CD4, CD8, Foxp3의와의 CD11c 대부분의 면역 계통 마커의 발현을 유지합니다. 성공적인 CD4 + T 세포의 분리 및 후속 표현형 및 기능 분석의 예는 도시된다.

여기에 제시된 프로토콜은 단일 4mm 피부 조직 검사를 사용하는 경우 760 ± 178,000까지 615 (± SEM, 건강한 지원자의 피부를 평균) ± 2,200 사이는 인간의 피부에서 가능한 림프구 (± SEM, 건선 환자의 피부 병변을 의미) 얻을 것입니다. CD45 + 세포의 종류는 CD4 + T 세포 (~ 45 %), CD8 + T 세포 (~ 30 %)을 포함 건강한 사람의 피부에서 유래 된 단일 세포 현탁액의 식별과의 CD11c + 수지상 세포 (~ 5 %했다 ) 몇 B 세포 (CD19 +의), NK 세포 (CD56 + CD3 반면, -), 또는 단핵구 / 대 식세포 (CD14 + 또는 CD1c +)가 관찰되었다 (도 1A). 이 방법은 인간의 피부 생검에서 C...

우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

본 절차의 전반적인 목적은 인간 피부 생검 조직으로부터 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 원형 생검 펀치를 사용하여 인간 피부 생검 조직을 채취합니다. 그다음, 각 피부 생검 조직을 페트리 접시에서 4개의 작은 조각으로 절단합니다.그 다음, 피부 조직을 기계적 및 효소적으로 분해하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 마지막으로, 피부 상주 림프구를 유세포 분석기로 분석하고 ex vivo 배양합니다. 결과적으로, 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 분리하여 면역 염색 및 FACS 분석으로 분석할 수 있습니다.이 방법은 피부과 및 피부 종양 면역학의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 피부 내 상주 T 세포가 질환에 어떻게 기여하는지와 같은 질문들입니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 Xuehui He이 맡아 진행하겠습니다.텍스트 프로토콜에 따라 배양 배지를 준비한 후, 멸균된 6웰 배양 플레이트의 3개 웰에 완전 배지 2 mL를 첨가합니다. 그다음, 4 mm 원형 생검 펀치를 사용하여 피부 생검 조직을 채취합니다. 이를 RPMI 1640 완전 배양 배지에 넣고 상온에서 최대 4시간 동안 두거나, 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.생검 조직을 배양하는 동안, 파란색 캡이 있는 해리 튜브에 라벨을 붙이고 완전 배양 배지 5 mL를 넣습니다. 다음으로, 멸균 도구를 사용하여 생검 조직을 첫 번째 웰에 넣어 세척합니다. 조직을 두 번째 웰로 옮겨 세척한 후, 세 번째 웰에서 이 과정을 한 번 더 반복합니다.충분히 헹군 피부 생검 조직을 멸균 페트리 접시에 옮기고, 샘플 위에 완전 배양 배지 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 그런 다음, 일회용 멸균 스테인리스 스틸 메스를 사용하여 피하 지방 조직을 조심스럽게 긁어냅니다. 새로운 멸균 페트리 접시에서 각 피부 생검 조직을 4개의 작은 조각으로 자릅니다.그런 다음 샘플을 5 mL의 완전 배지가 들어 있는 준비된 해리 튜브로 옮깁니다. 튜브 캡을 단단히 닫고 자동 조직 해리기의 슬리브에 거꾸로 부착합니다. 모든 샘플 물질이 로터 영역에 위치해 있는지 확인하십시오.다음으로, program M spleen zero one을 실행하여 해리 과정을 시작합니다. 생검 조직을 적절한 회전 속도로 56초 동안 해리합니다. 처리가 완료되면 해리 튜브를 해리 장치에서 분리하고, 해리된 모든 물질이 튜브 바닥에 수집되었는지 확인하십시오.해리 튜브에 150 µL의 collagenous one A를 첨가하고 37 °C의 진탕 수조에서 60분 동안 샘플을 배양합니다. 그 다음, 해리 튜브에 100 µL의 DNase를 첨가하고 잘 섞어줍니다. 해리 튜브를 자동 조직 해리기의 슬리브에 장착하고 프로그램 M spleen zero one을 실행하여 생검 조직을 한 번 더 해리합니다.그 다음, 50 mL falcon tube 위에 70 µm 나일론 셀 스트레이너를 놓고, 해리된 샘플 물질을 셀 스트레이너에 통과시켜 세포 덩어리와 조직 파편을 제거합니다. 5 mL의 완전 배지를 사용하여 셀 스트레이너를 한 번 세척합니다. 그런 다음, 여과액을 450 ×g, 20 °C ± 2 °C에서 10분 동안 원심 분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.세척 단계를 한 번 더 반복한 후, 300 µL의 완전 배양 배지를 사용하여 세포 펠렛을 다시 부유시킵니다. 이제 단일 세포 부유액이 추가 분석을 위한 준비가 되었습니다. 세포 내 사이토카인 염색을 수행하려면 PMA, ionomysin 및 brefeldin A를 사용하여 세포를 자극하고, 유세포 분석을 수행하기 전 37 °C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양하십시오.피부 상주 T 세포의 다클론 활성화를 수행하려면, 단일 세포 현탁액 100 µL를 라운드 바텀 96웰 플레이트에 분주합니다. anti-CD3, anti-CD28 항체가 코팅된 마이크로비드와 재조합 인간 사이토카인인 IL-2 및 IL-1B를 첨가합니다. 웰이 표시된 밀폐 뚜껑으로 배양 플레이트를 덮고 37 °C, 5% CO2, 100% 습도 조건에서 배양합니다.그 후, 배지의 색상이 노란색으로 변하면 배지를 교체합니다. 세포 배양 8일째에 투명한 세포 콜로니를 관찰할 수 있습니다. FACS 분석을 수행하려면, 분석 대상 세포를 V-bottom 96-well 플레이트로 옮깁니다.450 G, 20 °C(±2 °C)에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 흡입하여 제거합니다. 준비된 100 µL의 형광 780 접합 고정 가능 생존 염색 시약을 사용하여 4 °C에서 30분 동안 배양함으로써 세포를 염색합니다.그 다음, 100 µL의 FACS buffer를 첨가하고 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이어서 텍스트 프로토콜에 제공된 목록에서 세포 표면 마커 단일클론 항체를 선택한 후, FACS buffer를 사용하여 항체 용액을 준비합니다. 게이트 설정을 정의하기 위해 항체의 isotype control을 비염색 시료와 함께 사용하십시오.이제 준비된 마우스 항체 혼합물 25 µL를 각 웰에 넣고 빛을 차단합니다. 20 °C에서 20분 동안 배양합니다. FACS 버퍼 100 µL를 넣고 원심 분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.텍스트 프로토콜에 따라 foxp3 염색용으로 준비된 버퍼를 사용하여, 펠렛을 재부유시키기 위해 고정 및 투과화 버퍼 100 µL를 추가합니다. 잘 혼합한 후 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 각 웰에 투과화 버퍼 100 µL를 추가하고 원심분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.세포를 한 번 더 세척하고 적절한 항체를 선택한 후, 준비된 단클론 항체 혼합물 20 µL를 각 웰에 넣고 빛을 차단한 상태에서 4 °C로 30분 동안 배양합니다. 투과화 버퍼(permeabilization buffer)를 사용하여 세포를 한 번 더 세척합니다. 그런 다음, 110 µL의 FACS 버퍼를 사용하여 펠릿(pallet)을 재부유시키고, 세포 현탁액을 마이크로 FACS 튜브로 옮깁니다.마지막으로, 정확한 세포 수가 필요한 경우, FACS 측정 직전에 각 샘플에 잘 혼합된 균일한 플루오러스피어(flurospheres) 현탁액 10 µL를 첨가합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 건강한 개인의 피부에서 유래한 단일 세포 현탁액에서 다양한 유형의 CD45 양성 백혈구가 확인되었습니다. 여기에는 CD4 양성 T 세포, CD8 양성 T 세포 및 CD11c 양성 수지상 세포가 포함됩니다.반면 B 세포, NK 세포 또는 대식세포는 거의 관찰되지 않았습니다. 또한, 이 방법론을 통해 인간 피부 생검 조직 내의 CD4 양성 CD25 양성 foxp3 양성 세포를 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 고정과 투과화 후 세포 내 염색을 이용하면 CD25 양성 T 세포에서 전사 인자인 foxp3의 발현을 입증할 수 있습니다.여기서 입증된 바와 같이, 배경 자가형광 및 자가형광 세포 집단을 피하기 위해 림프구 집단의 게이팅에는 brilliant violet 421 형광색소가 결합된 anti-human CD45 마우스 항체를 사용하는 것이 권장됩니다. 이 그림은 인간 피부 내 상주 세포의 대부분이 CD3 양성 T 세포임을 보여줍니다. 세포 생존율 분석의 경우, 살아있는 세포와 죽었거나 죽어가는 세포를 구별하기 위해 고정 가능한 생존 염색약(fixable viability dye)의 사용을 권장합니다.추가적인 기능 분석을 위해, 건선 환자의 병변 피부에서 채취한 4mm 단일 피부 생검 조직을 사용하여, 생검 유래 T 세포가 IL-17a와 인터페론 감마를 생성함을 확인하였습니다. 이는 brefeldin A가 존재하는 상태에서 PMA ionomycin으로 4시간 동안 자극을 준 결과입니다. 마지막으로, 이 그림은 건선 환자의 T 세포가 건선 관련 사이토카인인 IL-17a와 인터페론 감마를 생성하는 능력이 훨씬 더 높다는 것을 보여줍니다. 인체 조직 및 실험실 시약을 다루는 작업은 위험할 수 있음을 유의하십시오.항상 안전 조치를 고려하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을...

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다.  이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 원고는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하기 위한 FACS 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이는 시험관 문화를 우회 하 고,이는 일반적으로 사용 되는 격리 프로토콜을 통해 명시적으로 불가피 한 것 이었습니다. 발산 된 섬유 아 세포 서브 세트는 기능적으로 구별 되 고 진 피 내에서 차별적 유전자 발현 및 국 소화를 표시 한다.

형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

학습하세요 인간 피부 생검에서 피부 거주 T 세포를 효율적으로 분리하는 방법을. 기계적 및 효소적 분해를 통해 단일 세포 현탁액을 제조하고 유동 세포측정법으로 분석합니다. 이 프로토콜은 피부 면역학 연구에 필수적인 생존 가능한 림프구를 충분히 확보합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리

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