3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

이 절차의 전반적인 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부 등가물을 구축하고 자동화된 상처 제거 장치를 사용하여 멸균 상태에서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 1차 인간 진피 섬유아세포를 콜라겐 1 하이드로겔에 삽입함으로써 이루어집니다. 다음으로, 1차 인간 표피 각질세포는 피브로넥틴으로 코팅된 하이드로겔 상단에 위치합니다.

그런 다음 모델을 수중 조건에서 배양한 다음 공기 액체 계면 아래에서 피부 성분과 다층 표피로 구성된 3차원 전체 두께 피부 등가물이 형성됩니다. 마지막으로, 무균 환경에서 표준화된 상처가 생성됩니다. 궁극적으로, 면역조직화학 염색 및 현미경 검사는 상처 입은 전체 두께 피부의 조직학적 구조를 평가하는 데 사용됩니다.

예를 들어, 동물 모델과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 전체 두께의 피부 등가물이 1차 인간 세포로 구성되어 있다는 것입니다. 따라서 자동 상처 장치와 함께 표준화된 상처를 생성할 수 있으므로 자동화된 상처 장치는 인간화된 환경에서 피부 상처 치유 과정에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 뼈 조직 공학과 같은 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 방법은 생물학적 과정, 기저 피부 복구, 표피와 피부 구성 요소 사이의 세포 누화와 같은 상처 치유의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 콜라겐을 0.1% 아세트산으로 최종 농도인 밀리리터당 6mg까지 용해합니다. 2 X dmm 232.5 밀리리터, FCS 7.5 밀리리터, 3 몰 히스 7.5 밀리리터, 밀리리터당 5 밀리그램 2.5 밀리리터를 혼합하여 겔 중화 용액을 준비합니다.

콘드로이틴 설페이트 플레이스를 24웰 플레이트의 웰에 삽입하여 인간 피부 섬유아세포 또는 HDFS를 분리하고 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리합니다. 270G에서 세포를 계수하고 5분 동안 1, 200, 000 HDF의 Eloqua를 원심분리합니다. 270G에서 스내트를 제거하고 4ml의 냉각된 젤 중화 용액을 사용하여 기포를 일으키지 않고 HDF를 조심스럽게 재현탁시킵니다.

그런 다음 8ml의 콜라겐 용액으로 용액을 재현탁시킵니다. 다음으로, 다단계 피펫을 사용하여 각 삽입물에 500마이크로리터의 콜라겐 세포 혼합물을 추가합니다. 24웰 플레이트에서 겔이 겔이 응고될 수 있도록 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 20분 동안 겔을 배양합니다.

그런 다음 2ml의 DMM과 웰당 10%FCS를 사용합니다. 젤을 담그려면 24시간 동안 젤을 배양하십시오. 초순수를 사용하여 인간 피브로넥틴 단백질을 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도로 용해시킵니다.

피부 등가 젤을 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거합니다. 25마이크로리터의 피브로넥틴 용액을 사용하여 각 피부 등가물을 덮고 젤을 30분 동안 배양합니다. 그 동안에, KGM 2 플러스 5%FCS를 가진 인간적인 표피, keratinocytes 또는 HKS를 리터 씨 당 1백만개의 세포, 각 젤의 위에 100만개의 heeks의 마지막 농도에 resuspend

그런 다음 kgm 2 ready plus 5% FCS를 사용하여 세포가 부착되도록 45분 동안 겔을 배양하고 세포를 침수시키고 배양을 계속합니다. 2-3일 동안 배양한 후 배지를 2% FCS로 교체한 다음 FCS가 없는 배지로 교체하고 2-3일 후에 배지를 교체합니다. 7일차, 매체를 완전히 제거합니다.

멸균 집게를 사용하여 각 삽입물을 6웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 그런 다음 웰당 1.5ml의 에어 리프트 매체를 추가합니다. FTSC의 표면이 젖지 않도록 주의하십시오.

2-3일마다 배지를 교체하여 14일 동안 추가로 사용합니다. 멸균 집게를 사용하여 작업 영역을 소독하기 위해 70% 에탄올과 자외선을 사용하여 자동 상처 장치를 준비합니다. 스킨 등가물을 오토클레이브 샘플 캐리어 플레이트의 지정된 영역에 놓습니다.

샘플 캐리어 플레이트를 드릴 헤드 아래의 소켓에 넣습니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 다음과 같이 상처 매개변수를 설정합니다. 스핀 속도 15, 000 RPM 침투, 1.5 밀리미터.

추진 장치 100 헤르츠. 상처 매개변수를 자동 상처 장치로 전송합니다. 완료되면 상처 절차를 시작하십시오.

소켓에서 샘플 캐리어 플레이트를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 상처 입은 FTSE를 배양에 사용되는 삽입물로 다시 옮깁니다. 실험적 평가가 있을 때까지 상처 입은 FTSE를 배양합니다. 그의 조직학적 분석을 위해 언제든지 모델을 사용하십시오.

분리된 HDFS 및 HKS는 FTSE에 사용하기 전에 면역조직화학적 염색을 특징으로 했습니다. HDF는 섬유아세포의 표지자인 멘톤(menton)에 대해 양성이며, 일차 HEK는 조기 분화 단백질인 CYTOKERATIN 14를 높게 발현하지만, 후기 각질세포 분화 단백질인 CYTOKERATIN 10은 거의 발현하지 않습니다. FTSE는 수중 매체 조건에서 7일 동안 배양한 후 공기 액체 계면에서 14일 동안 배양했습니다.

이 과정에서 FTSC는 21일 이내에 크게 축소됩니다. HEK는 모델의 표면이 공기에 노출되는 방식으로 중간 수준을 변경함으로써 확산되고 있습니다. 그리고 칼슘 농도를 증가시킴으로써, HKS는 각질세포의 여러 중요한 세포층으로 구성된 다세포 표피로 분화하도록 자극됩니다.

D 분화와 심방 각막의 다른 상태에서. FTSE의 헤마틴 및 에오신 염색을 토착 인간 피부와 비교하면 FTSE가 피부의 조직학적 구조를 모방한다는 것이 명백해집니다. 콜라겐 원 하이드로겔의 HDF는 비멘틴에 대한 1차 항체로 염색할 수 있습니다.

또한, 각질세포는 사이토케라틴 14 양성 세포와 후기 분화 마커로 구성된 표피층을 형성합니다. CYTOKERATIN 10은 슈퍼 기저층에서 발현됩니다. 또한, St.Stratum cornium은 개발 후 RIN에 양성입니다.

이 기술은 피부과 분야의 연구자들이 피부 상처 치유와 인간 피부를 밀접하게 모방한 표준화된 체외 설정을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.