Lepr

이 실험 절차의 전반적인 목표는 당뇨병성 LEP R DB 마우스로부터 생존 가능한 췌도(islet)를 얻고, 라이브 셀-포톤 이미징(live cell to photon imaging)을 통해 췌도 내 베타 세포의 인슐린 분비 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 췌장 소화를 위한 효소 혼합물, 췌도 배양을 위한 배양 배지, 그리고 이광자 분석(two photon assay)을 위한 세포외 완충액과 같은 시약들을 준비합니다. 그다음, 안락사시킨 마우스의 복부를 절개하고 췌장에 효소 혼합물을 주입하여 장기를 소화시킵니다.

그런 다음 아일렛(eyelet)을 췌장 소화물로부터 분리하여 배양합니다. 마지막으로, 이광자 현미경을 사용하여 아일렛 내 베타 세포의 단일 인슐린 과립 융합을 이미지화합니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 연구자들이 건강한 상태와 질병 상태에서 인슐린 분비가 어떻게 조절되는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

아일렛 분리 기술의 주요 개선 사항은 아일렛의 수율과 생존율을 높이기 위해 혼합 효소를 사용하는 것입니다. 이광자 이미징 기술은 현재 손상되지 않은 아일렛 내의 여러 세포로부터 인슐린 분비를 기록할 수 있는 유일한 방법입니다. 췌장 아일렛 분리를 위한 효소를 준비하려면 liase TL 5 mg이 들어있는 바이알 하나를 DM EM 26 mL로 희석하고, Hank's buffer로 collagenase type four를 0.5 mg/mL 농도로 준비한 후, 앞서 준비한 liase TL 및 collagenase 용액을 다음과 같이 혼합하여 보충합니다.

부피 비율 4:1로 효소 혼합물을 각각 2.5 mL씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. RPMI 분리 배지를 준비하려면 1 L의 물이 담긴 대형 원추형 플라스크에 RPMI 1640 분말 1바이알을 넣고 상온에서 용해시킨 후, 중탄산나트륨 2 g과 HEPES 4.02 g을 첨가하십시오. 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조절한 다음, 여과 멸균하여 4 °C에서 보관하십시오.

이광자 이미징용 RPMI 분리 배지에 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하여 RPMI 배양 배지를 만듭니다. 다음 시약들을 사용하여 나트륨 풍부 세포 외 버퍼를 준비합니다. 세포 외 염색약을 준비하려면, 8 mM SRB 스톡을 만들어 세포 외 버퍼 분량을 작은 튜브에 나누어 담고 -20 °C에서 보관합니다.

작동 농도를 맞추기 위해, 신선한 세포 외 버퍼를 사용하여 SRB 스톡 용액을 1:10으로 희석하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 희생시킨 후 70% ethanol로 마우스 몸 전체에 충분히 분무하고, 머리가 수술자 쪽을 향하고 꼬리가 반대쪽을 향하도록 동물을 배치하십시오. 복부 피부와 복막을 통해 두 번의 긴 측면 절개를 가하여 V자형 플랩을 만드십시오.

피부 플랩을 들어 올려 복강 전체를 노출시킵니다. 장을 옆으로 밀어두고, 접힌 조직을 이용해 간을 고정하여 총담관이 드러나게 합니다. 다음으로, 주입된 효소가 십이지장으로 들어가는 것을 막기 위해 십이지장 벽의 팽대부에 혈관 클램프를 적용합니다.

이는 췌장 효소가 췌관으로 역류하는지, 주입 부위로 새어 나오는지, 아니면 십이지장으로 진입하는지를 결정하는 중요한 단계입니다. 31 gauge 바늘을 사용하여 총간관과 담낭관의 접합부 근처에서 총담관에 캐뉼라를 삽입하고, 두 번째 주입을 위한 공간을 남겨둡니다. 첫 번째 시도에서 췌장 관류에 실패한 경우, 약 2 mL의 차가운 효소 혼합물을 마우스 총담관에 천천히 주입하십시오.

클램프가 올바른 위치에 있다면 췌장이 빠르게 관류될 것입니다. 췌장이 관류되면 즉시 장기를 꺼내 유리 바이알에 넣고 37 °C 항온 수조에서 약 19분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 약 20 mL의 차가운 분리 배지를 첨가하여 소화 과정을 중단시킵니다.

바이알을 가볍게 흔들어 췌장을 분쇄한 후, 공극 크기가 1 mm인 일반 T sieve를 통해 멸균된 50 mL 튜브에 붓습니다. 분리 배지를 사용하여 튜브를 채우고 400 G, 4 °C에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리를 멈춘 후, 펠릿에 분리 배지를 추가하여 용해합니다.

그 다음 현탁액을 두 개의 15 milliliter 튜브로 옮기고 다시 한 번 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 각 펠릿에 6 milliliter의 밀도 구배 세포 분리 배지를 추가하고 피펫팅 또는 볼텍싱하여 재현탁합니다. 그 후 튜브 벽면을 따라 밀도 구배 분리 배지 위에 약 6 milliliter의 분리 배지를 조심스럽게 첨가하고, 100 G, 4 °C에서 15분 동안 원심 분리합니다.

분리된 조직을 상층, 중층, 하층의 세 가지 층으로 나누어 각각 별도의 디쉬에 수집합니다. 그다음 해부 현미경 하에서 피펫을 사용하여 세 디쉬에 들어있는 안구절(eyelets)을 수작업으로 선택해 수집합니다. 대부분의 안구절은 효소 소화 과정으로부터 회복되는 단계인 중층에서 발견될 것입니다.

10 mM glucose가 포함된 6 mL의 RPMI 배양액이 담긴 25 cm 페트리 접시에 40개의 아일렛(eyelets) 그룹을 준비하여 2일 동안 배양합니다. 인슐린 분비를 측정하기 위한 간접 분석법인 이광자 이미징(two photon imaging)을 수행하기 위해 매일 배지를 교체합니다. 우선, 2일 동안 배양한 아일렛을 3 mM glucose가 포함된 세포외 완충액에서 사전 배양하는 것으로 시작합니다.

용액 누출을 방지하기 위해 현미경 스테이지에 그리스를 도포하고, 유리 슬라이드가 들어 있는 온도 조절 챔버를 현미경 스테이지에 장착하여 30분 동안 유지합니다. 그 다음, 0.8 millimolar의 SRB와 다양한 농도의 glucose가 포함된 extracellular buffer 500 µL를 사용하여 챔버를 채웁니다. 이어서, 미리 배양된 eyelet을 챔버 중앙에 배치하고 eyelet의 3~4개 세포층 깊이에서 초점을 맞춥니다.

설치류의 섬(eyelets)에서 인슐린 면역 염색을 통해 대부분의 세포가 베타 세포임을 확인합니다. 그다음, 60배 오일 침수 렌즈를 장착한 이광자 현미경을 사용하여 작은 형광 점이 갑자기 나타나는 것을 통해 단일 엑소시토시스(exo acidic) 이벤트를 식별합니다. 마지막으로, 스캔 이미지 소프트웨어에서 야생형 생쥐의 관심 영역(ROI)에 대한 형광 신호의 급격한 상승기를 통해 이벤트 발생을 확인합니다.

이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하면 약 200개의 안구체(eyelets)를 얻을 수 있을 것으로 예상됩니다. 건강한 안구체는 밝고 둥근 모양이며 경계가 매끄럽게 보입니다. 반면, 소화가 덜 된 분리 배치는 대개 작고 솜털 같은 모양의 안구체와 아사르(asar) 세포가 부착된 안구체를 포함합니다.

과소화된 배치는 포도당이나 고농도 칼륨과 같은 자극에 반응하여 두 광자 분석에서 더 적은 수의 아이렛(eyelet)을 보이지만, 인슐린 과립이 혈장막과 융합될 때 SRB가 과립 내부로 진입하며, 그 결과 지름 약 400 nanometers의 갑작스러운 형광 점이 나타납니다. 기록된 시간 내에 자극에 반응하는 모든 엑소(exo) 이벤트가 식별되며, 이벤트의 위치, 출현 시간, 지속 시간 및 융합 유형이 파악됩니다. KISS, Run 또는 완전 융합(full fusion)과 같은 이벤트들이 특성화되며, 이는 제2형 당뇨병 모델에서 과립 융합의 결함을 평가하는 데 유용합니다.

이 방법은 당뇨병성 DB DB eyelet의 결함이 개별 과립 융합의 역학적 변화가 아니라, 완전한 과립 융합의 상실임을 보여주는 데 사용되었습니다. 또한, 질병 상태에서 인슐린 분비 감소에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 반응성 세포 수의 감소입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 RDB 마우스의 췌장 관류 및 eye less 작동 방식에 대해 충분히 이해하게 되며, 손상되지 않은 island 내에서 인슐린 분비 반응을 평가하기 위한 두 가지 tongue assay를 수행할 수 있게 될 것입니다.