Name: Lepr DB 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 Lepr db 당뇨병 마우스에서 췌장 섬을 분리하고 2광자 현미경으로 베타세포의 인슐린 분비를 실시간 관찰하는 방법을. 이 기술은 제2형 당뇨병의 병리 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) 및 National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG)의 지원을 받았습니다.

참고 : 모든 현재 실험 (퀸즐랜드 대학의 해부학 생명 과학 윤리위원회의 승인) 퀸즐랜드 대학의 지역 동물 윤리 절차에 따라 수행되었다. 1. 작은 섬 격리 <ol><li> 시약 준비 <ol><li> 효소의 혼합물 <ol><li> 췌장 소화를 들어, liberase과 콜라겐 IV 형의 혼합물을 사용합니다. (써모 낮음) liberase의 TL DMEM 26 ㎖ (둘 베코의 수정 이글 중간) 5 mg을 1 병을 희석. </li><li> 된 5mm HEPES가 보충 된 0.5 ㎎ / ㎖의 농도에서 행크 버퍼 콜라게나 제 IV 형을 준비 후 0.5mM 염화칼슘 2를 0.1 mg / ㎖의 DNase 및 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민. </li><li> 즉, (체적) 한 TL + 1 ㎖의 콜라게나 제 용액 liberase 4 : 4의 비율로 liberase의 TL과 콜라겐 용액을 섞는다. -20 ℃에서 각각 저장을 2.5ml를 효소의 혼합물 나누어지는. 참고 : 조직 배양 시간이 v에효소의 배치 사이의 비트 (30 초에 1 분 차이)을 당하고. 따라서, 일괄 테스트가 필요할 수있다. </li></ol></li><li> RPMI 격리 미디어 <ol><li> 실온에서 물 1 L에 RPMI 1640 분말의 한 유리 병을 녹여와 2g의 NaHCO3, 4.02 G의 HEPES과 보충. </li><li> , 자석 교반기로 혼합, 대형 삼각 플라스크에 RPMI 분리 미디어를 결합 NaOH로 pH를 7.4로 조정, 필터는 살균 및 4 ℃에서 저장. </li></ol></li><li> RPMI 문화 미디어 </li><li> 10 % 소 태아 혈청 및 1 % 항생 물질 (예, 페니실린 100 U / ㎖, 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖), RPMI 배양 배지를 사용한다. </li></ol></li><li> 섬의 분리 및 배양 <ol><li> 동물 희생 <ol><li> 지역 기관의 윤리 절차에 따라 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 쥐를 희생. 70 % 에탄올로 충분히 마우스 본체 스프레이. </li></ol></li><li> 췌장 관류 <ol><li> 유측면 복부 피부와 복막을 통해 자체 2 긴 인하 V 자형 플랩을 확인합니다. 전체 복강을 밝히기 위해서 피부 최대의 플랩을 당기고 장을 따로 넣어 담관을 공개 접힌 휴지에 의해 장소에 간 유지 (그림 1, 2). 동물을 넣어 외과 의사 멀리 외과에서 꼬리쪽으로 머리 있도록. </li><li> 십이지장 (그림 1)를 입력에서 주입 된 효소를 차단하는 십이지장 벽에 팽대부에서 혈관 클램프를 적용합니다. 참고 : 주입 된 효소가 췌장 관에 가서 (클램프 이상) 주사 부위에 췌장 또는 역류를 관류 또는 (클램프 아래) 십이지장으로 이동할지 여부는 결정으로이 중요한 단계입니다. </li><li> 일반적인 간 덕트 및 담낭 관 (그림 1)의 교차점 근처에 31 G 바늘과 담관을 Cannulate 및 제 주입을위한 공간을 남겨 일 경우즉 췌장은 처음 관류 못한다. 천천히 (이상 ~ 10 초) 마우스 담관에 약 2 ml의 차가운 효소 혼합물의 주입. 주 : 클램프 우측 위치에있는 경우 췌장 신속 관류한다. </li><li> 바늘이 담관 내에 있지만 췌장 관류 할 수없는 경우 (예. 고정 이상의 경우 간에서 조금 떨어진 클램프를 이동하거나 고정 아래의 경우 간으로 조금 아래로 이동) 클램프 위치를 조정합니다. 주 : 바늘 가끔 둘러싸 캡슐보다는 덕트의 루멘으로 간다. 유용한 기호 담관이 주입 관의 팽창은 내부 바늘이 있는지 여부를 확인한다. 췌장 관류 못하면 대안 효소 혼합물이 예상보다 낮은 수율과 췌장의 여러 부위로 주입 될 수있다. 췌장 (비장 엽)의 왼쪽 사이트의 관류는 섬 수율의 극대화를 위해 중요하다. </li><li> 췌장은 P가되면erfused, 신속, 췌장을 제거 유리 병 (~ 20 ㎖, 유리)에 넣고 37 ° C의 물을 욕조에서 ~ 19 분을 품어. 주 : 배양 시간이 마우스 변형 및 나이에 따라 약간 다를 수 있습니다. </li><li> 배양 시간 후, 냉 ~ 분리 매체 20 ㎖를 첨가하여 소화 과정을 정지. 췌장을 방해하고 멸균 50 ㎖ 튜브에 일반 차 체 (1mm의 구멍 직경)를 통해 부어 부드럽게 병을 흔들어. 브레이크 오프 4 ° C에서 1 분 동안 400 XG에 격리 매체와 원심 분리기와 튜브를 최고. </li><li> 다시 분리 미디어에서 펠렛을 해산 한 후 브레이크 해제와 함께 4 ℃에서 1 분 동안 400 XG에 원심 분리기,이 15 ml의 튜브에 전송할 수 있습니다. 흡인 뜨는 후, 텍싱 또는 최대 피펫 아래로 튜브 당 밀도 구배 세포 분리 매체의 6 ㎖ (Histopaque 1077 용액)을 잘 두 개의 알약을 섞는다. 부드럽게 위에 튜브의 측면에 격리 매체 ~ 6를 가하여브레이크 오프 4 ° C에서 15 분 동안 100 XG에 밀도 구배 분리 매체와 원심 분리기. </li><li> 상단 (격리 미디어)의 상층 액 3 별도의 요리, 중간 및 하부 (밀도 구배 세포 분리 미디어) 레이어를 수집합니다. 해부 현미경 피펫을 사용하여,이 3 요리의 섬을 따다. 주 : 중간 층이 섬의 대부분을 포함하고 있습니다. 섬의 크기는 ~ 50 μm의 500의 컴팩트 한 구조 (그림 3)으로 인식하고 있습니다. 우리는 (WT) 쥐에 ~ 200 섬과 DB / db 마우스에서 300- &lt;100 섬을 구하십시오. </li></ol></li><li> 섬의 배양 <ol><li> 독도는 37 ℃, 5 %, 효소 소화에서 6ml를 RPMI 배양액 (10 mM이 포도당)와 25cm 배양 접시에 40 섬의 문화 그룹을 복구 할 수 있도록하려면 / 95 % 라이브 전에 2 일간 CO 2 / O 2 -cell 2 광자 영상화. 매일 문화 미디어를 변경합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> (2). 라이브 셀 2 광자 이미징 <ol><li> 시약 준비 <ol><li> 세포 외 버퍼 <ol><li> 140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 2.5 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의의 MgCl 2, 5 mM의 NaHCO3를 10 mM의 HEPES와 2 광자 분석의 나트륨이 풍부한 세포 외 버퍼를 준비합니다. </li></ol></li><li> 세포 외 염료 <ol><li> 2 광자 분석의 경우, -20 ° C에서 세포 외 버퍼, 나누어지는 작은 튜브에 저장에 스톡 SRB 8 mm로 준비합니다. 0.8 mm의 작업 농도를 얻기 위해 신선한 세포 외 버퍼에 주식 SRB 1:10 희석. </li></ol></li></ol></li><li> 광자 이미징 <ol><li> 먼저, 30 분 동안 3 mM의 글루코오스 외 버퍼에서 2 일간 배양 아일렛 사전 부화. 참고 : 우리는 문화에 2 오일 사이에 독도를 사용합니다. </li><li> 이어서, 현미경 스테이지 상에 열 제어실 상 유리 슬라이드를 배치. 용액의 누출을 방지하기 위해 그리스를 사용합니다. </li><li> extracell 500 μL와 챔버 커버다른 포도당 농도 (3 mm의 6 mm의 15 mM의 20 mM의 포도당)와 0.8 mM의 SRB를 포함 울라 버퍼입니다. </li><li> 다음에, 챔버의 중앙으로 미리 인큐베이션 아일렛 놓고 설치류 아일렛의 인슐린 면역 염색하여 가장 세포가 베타 세포 인 것을 나타내고, 췌도 세포로 3-4 층에 초점을 맞춘다. 주 : SRB 신속 아일렛 모든 세포막 윤곽 것이며 아일렛 이미지를 준비한다. </li><li> (예., ScanImage 11). 60X 오일 침지 대물 (NA 1.42) 및 이미징 소프트웨어와 2 광자 현미경을 사용하여 4 현미경 전형적인 배열을 도시한다. 형광으로 막 880 nm에서 펨토초 레이저 펄스에 의해 여기 impermeant 형광 세포 마커로 SRB를 사용하여 이미지 exocytic 이벤트, 550-650 nm에서 검출. 자극에 섬의 응답을 기록합니다. </li><li> 작은 형광 자리의 갑작스러운 출현에 의해 단일 ​​exocytic 이벤트를 식별 (해상도 10 픽셀 /1, M)와 관심 영역 (~ 0.78 μm의 2)을 통해 형광 신호의 빠른 상승 단계에 의해 확인합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
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<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
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<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

아일렛 분리에 가장 중요한 요인은 췌장의 초기 관류이고; 아래는 상당히 낮은 섬 수율 췌장 결과를 관류. 다른 인자는 또한 소화 시간 부분적 관류의 레벨을 보정 할 수 진탕 레벨로 분리 품질에 영향을 미친다. 예를 들어, 완전히 관류 췌장 부드럽게 진탕하면서 아래에서 췌장 세게 진탕 ~ 20 분 소화가 필요할 수 소화 반대로, 18 분 30 초 ~ 37 ° C에서 배양해야한다. 우리의 손에 두 개의 소화 효소의 혼합물을 혼자 둘 중 하나보다 더 섬 격리를 제공합니다. 콜라게나 유일한 방법은, 소화 시간이 매우 섬 수율과 30 초의 시간 차이가 극적으로 품질에 영향을 미칠 수있는 영향을 미친다. 만 liberase를 들어, 수율은 허용하지만 아래 - 소화 때때로 우리는 콜라게나 제를 첨가 더 잘 결합 조직을 소화하는 데 도움이 믿고 발생합니다. <p c아가씨 = &quot;jove_content&quot;&gt; 우리는 DB를 발견 / db 마우스는 심지어 형제 자매들, 다양한 당뇨병 표현형 있습니다. 그 결과, 희생 전...

질병의 베타 - 세포 기능 부전의 역할은 광범위 3,4-을 인식하고있다. 이러한 MIN6와 INS-1 등의 세포주는 베타 세포 행동의 생물학을 이해하기 위해 유용한 도구이다. 그러나, 인슐린 분비의 생리적 제어는 랑게르한스의 섬 내에서 일어난다. 이 섬은 단단히 포장 베타 세포의 수천뿐만 아니라 혈관 및 기타 내분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 아일렛이 환경 내의 인슐린 분비에 영향을 당뇨병에 중요한 것으로 예상된다. 따라서, 인슐린 분비의 생리 학적 제어하고 질환의 병태 생리를 이해하기 위해서는 본래 아일렛을 연구하는 것이 필수적이다. 섬 격리 2 형 당뇨병 환자, 특히 인간의 아일렛 라이브 인간 섬과는 얻는 것이 곤란하다. 또한, 인간의 독도 실험 분자 조작에 대한 제한 가능성이 있습니다. 연구원은 그러므로 고용 한동물과 제 2 형 당뇨병 동물 모델에서 할 수 있습니다. 하나는 이러한 질병 모델은 DB / DB 마우스입니다. 이 모델은 밀접하게 인간의 질병 5,6 평행 표현형의 진행과 2 형 당뇨병 자발적인 돌연변이입니다. 당뇨병 DB / db 마우스에서 섬의​​ 격리를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 더 나은 수율, 정화 및 강화 섬의 생존을위한 몇 가지 정련 다른 그룹과 공통점이 많은 단계가 있습니다. 2 광자 이미징 여기에 설명 된 라이브 셀 2 광자 분석법을 계량 숫자 7과 야생형 당뇨병은 8,9 아일렛의 많은 세포로부터 인슐린 단일 - 함유 과립의 특성을 평가하기 위해 연구를 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche-5401020001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium(10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>분리 매체 준비</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>배양 배지를 준비하기 위해</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>를 사용하여 배양 배지를 준비하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 500ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td>을 준비하기 위한 <td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>liberase</td></tr><tr><td>Metamorph 프로그램</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td> 2<td>-광자 이미지 분석</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

2 형 당뇨병은 2013 년 382,000,000명에 영향을 미치는 만성 질환이며, 지난 2 년 동안. 2035 1 592000000에 명확하게이 설립 된 제 2 형 당뇨병에서 베타 세포 기능 장애의 역할을 증가 할 것으로 예상된다. 연구 진행은 췌장 섬의 분리 방법을 요구하고있다. 섬 분리의 프로토콜은 야생형과 당뇨병 Lepr의 데시벨 (dB / DB) 마우스 모두에서 고립 된 섬의 수율과 품질을 개선하기 위해 일부 수정과 함께 공유 여기 다른 그룹의 프로토콜과 많은 일반적인 단계를 제시했다. 라이브 셀 2 광자 이미징 법은 아일렛 내에서 인슐린 분비의 조절을 조사하기 위하여 사용될 수 제시된다.

섬 수율 및 정화 정상적인 야생형 마우스의 200 아일렛이 예상된다. 건강한 섬은 둥근 모양, 밝은 모양과 부드러운 테두리가. 아래의 소화 배치가 적은 섬과 선방 세포 부착 섬 (그림 3)이 때 과열 소화 분리 배치는 일반적으로 작은 퍼지 섬이있다. 더 나은 혈당 마우스 (100) 아래 (반투명 외관과 작은 섬이 악화 혈당 쥐에 비해 (300 섬에) 더 큰, 더 밝고 섬이 당뇨병 DB / db 마우스의 경우, 섬 수율 및 외관은 질병의 진행에 따라 달라집니다 섬) 2 광자 분석법 2 광자 영상화는 단일 인슐린 과립 융합 수준에서 인슐린의 분비를 측정하는 간접 분석법이다. 높은 포도당 또는 칼륨과 같은 자극에 응답하여, 인슐린 과립은 세포막과 융합 및 세포 외 염료는 SRB 번째 진입직경 갑작스런 형광 스폿 ~ 400 nm 인 외관을 초래 E 과...

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 당뇨병성 LEP R DB 마우스로부터 생존 가능한 췌도(islet)를 얻고, 라이브 셀-포톤 이미징(live cell to photon imaging)을 통해 췌도 내 베타 세포의 인슐린 분비 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 췌장 소화를 위한 효소 혼합물, 췌도 배양을 위한 배양 배지, 그리고 이광자 분석(two photon assay)을 위한 세포외 완충액과 같은 시약들을 준비합니다. 그다음, 안락사시킨 마우스의 복부를 절개하고 췌장에 효소 혼합물을 주입하여 장기를 소화시킵니다.그런 다음 아일렛(eyelet)을 췌장 소화물로부터 분리하여 배양합니다. 마지막으로, 이광자 현미경을 사용하여 아일렛 내 베타 세포의 단일 인슐린 과립 융합을 이미지화합니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 연구자들이 건강한 상태와 질병 상태에서 인슐린 분비가 어떻게 조절되는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다.아일렛 분리 기술의 주요 개선 사항은 아일렛의 수율과 생존율을 높이기 위해 혼합 효소를 사용하는 것입니다. 이광자 이미징 기술은 현재 손상되지 않은 아일렛 내의 여러 세포로부터 인슐린 분비를 기록할 수 있는 유일한 방법입니다. 췌장 아일렛 분리를 위한 효소를 준비하려면 liase TL 5 mg이 들어있는 바이알 하나를 DM EM 26 mL로 희석하고, Hank's buffer로 collagenase type four를 0.5 mg/mL 농도로 준비한 후, 앞서 준비한 liase TL 및 collagenase 용액을 다음과 같이 혼합하여 보충합니다.부피 비율 4:1로 효소 혼합물을 각각 2.5 mL씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. RPMI 분리 배지를 준비하려면 1 L의 물이 담긴 대형 원추형 플라스크에 RPMI 1640 분말 1바이알을 넣고 상온에서 용해시킨 후, 중탄산나트륨 2 g과 HEPES 4.02 g을 첨가하십시오. 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조절한 다음, 여과 멸균하여 4 °C에서 보관하십시오.이광자 이미징용 RPMI 분리 배지에 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하여 RPMI 배양 배지를 만듭니다. 다음 시약들을 사용하여 나트륨 풍부 세포 외 버퍼를 준비합니다. 세포 외 염색약을 준비하려면, 8 mM SRB 스톡을 만들어 세포 외 버퍼 분량을 작은 튜브에 나누어 담고 -20 °C에서 보관합니다.작동 농도를 맞추기 위해, 신선한 세포 외 버퍼를 사용하여 SRB 스톡 용액을 1:10으로 희석하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 희생시킨 후 70% ethanol로 마우스 몸 전체에 충분히 분무하고, 머리가 수술자 쪽을 향하고 꼬리가 반대쪽을 향하도록 동물을 배치하십시오. 복부 피부와 복막을 통해 두 번의 긴 측면 절개를 가하여 V자형 플랩을 만드십시오.피부 플랩을 들어 올려 복강 전체를 노출시킵니다. 장을 옆으로 밀어두고, 접힌 조직을 이용해 간을 고정하여 총담관이 드러나게 합니다. 다음으로, 주입된 효소가 십이지장으로 들어가는 것을 막기 위해 십이지장 벽의 팽대부에 혈관 클램프를 적용합니다.이는 췌장 효소가 췌관으로 역류하는지, 주입 부위로 새어 나오는지, 아니면 십이지장으로 진입하는지를 결정하는 중요한 단계입니다. 31 gauge 바늘을 사용하여 총간관과 담낭관의 접합부 근처에서 총담관에 캐뉼라를 삽입하고, 두 번째 주입을 위한 공간을 남겨둡니다. 첫 번째 시도에서 췌장 관류에 실패한 경우, 약 2 mL의 차가운 효소 혼합물을 마우스 총담관에 천천히 주입하십시오.클램프가 올바른 위치에 있다면 췌장이 빠르게 관류될 것입니다. 췌장이 관류되면 즉시 장기를 꺼내 유리 바이알에 넣고 37 °C 항온 수조에서 약 19분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 약 20 mL의 차가운 분리 배지를 첨가하여 소화 과정을 중단시킵니다.바이알을 가볍게 흔들어 췌장을 분쇄한 후, 공극 크기가 1 mm인 일반 T sieve를 통해 멸균된 50 mL 튜브에 붓습니다. 분리 배지를 사용하여 튜브를 채우고 400 G, 4 °C에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리를 멈춘 후, 펠릿에 분리 배지를 추가하여 용해합니다.그 다음 현탁액을 두 개의 15 milliliter 튜브로 옮기고 다시 한 번 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 각 펠릿에 6 milliliter의 밀도 구배 세포 분리 배지를 추가하고 피펫팅 또는 볼텍싱하여 재현탁합니다. 그 후 튜브 벽면을 따라 밀도 구배 분리 배지 위에 약 6 milliliter의 분리 배지를 조심스럽게 첨가하고, 100 G, 4 °C에서 15분 동안 원심 분리합니다.분리된 조직을 상층, 중층, 하층의 세 가지 층으로 나누어 각각 별도의 디쉬에 수집합니다. 그다음 해부 현미경 하에서 피펫을 사용하여 세 디쉬에 들어있는 안구절(eyelets)을 수작업으로 선택해 수집합니다. 대부분의 안구절은 효소 소화 과정으로부터 회복되는 단계인 중층에서 발견될 것입니다.10 mM glucose가 포함된 6 mL의 RPMI 배양액이 담긴 25 cm 페트리 접시에 40개의 아일렛(eyelets) 그룹을 준비하여 2일 동안 배양합니다. 인슐린 분비를 측정하기 위한 간접 분석법인 이광자 이미징(two photon imaging)을 수행하기 위해 매일 배지를 교체합니다. 우선, 2일 동안 배양한 아일렛을 3 mM glucose가 포함된 세포외 완충액에서 사전 배양하는 것으로 시작합니다.용액 누출을 방지하기 위해 현미경 스테이지에 그리스를 도포하고, 유리 슬라이드가 들어 있는 온도 조절 챔버를 현미경 스테이지에 장착하여 30분 동안 유지합니다. 그 다음, 0.8 millimolar의 SRB와 다양한 농도의 glucose가 포함된 extracellular buffer 500 µL를 사용하여 챔버를 채웁니다. 이어서, 미리 배양된 eyelet을 챔버 중앙에 배치하고 eyelet의 3~4개 세포층 깊이에서 초점을 맞춥니다.설치류의 섬(eyelets)에서 인슐린 면역 염색을 통해 대부분의 세포가 베타 세포임을 확인합니다. 그다음, 60배 오일 침수 렌즈를 장착한 이광자 현미경을 사용하여 작은 형광 점이 갑자기 나타나는 것을 통해 단일 엑소시토시스(exo acidic) 이벤트를 식별합니다. 마지막으로, 스캔 이미지 소프트웨어에서 야생형 생쥐의 관심 영역(ROI)에 대한 형광 신호의 급격한 상승기를 통해 이벤트 발생을 확인합니다.이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하면 약 200개의 안구체(eyelets)를 얻을 수 있을 것으로 예상됩니다. 건강한 안구체는 밝고 둥근 모양이며 경계가 매끄럽게 보입니다. 반면, 소화가 덜 된 분리 배치는 대개 작고 솜털 같은 모양의 안구체와 아사르(asar) 세포가 부착된 안구체를 포함합니다.과소화된 배치는 포도당이나 고농도 칼륨과 같은 자극에 반응하여 두 광자 분석에서 더 적은 수의 아이렛(eyelet)을 보이지만, 인슐린 과립이 혈장막과 융합될 때 SRB가 과립 내부로 진입하며, 그 결과 지름 약 400 nanometers의 갑작스러운 형광 점이 나타납니다. 기록된 시간 내에 자극에 반응하는 모든 엑소(exo) 이벤트가 식별되며, 이벤트의 위치, 출현 시간, 지속 시간 및 융합 유형이 파악됩니다. KISS, Run 또는 완전 융합(full fusion)과 같은 이벤트들이 특성화되며, 이는 제2형 당뇨병 모델에서 과립 융합의 결함을 평가하는 데 유용합니다.이 방법은 당뇨병성 DB DB eyelet의 결함이 개별 과립 융합의 역학적 변화가 아니라, 완전한 과립 융합의 상실임을 보여주는 데 사용되었습니다. 또한, 질병 상태에서 인슐린 분비 감소에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 반응성 세포 수의 감소입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 RDB 마우스의 췌장 관류 및 eye less 작동 방식에 대해 충분히 이해하게 되며, 손상되지 않은 island 내에서 인슐린 분비 반응을 평가하기 위한 두 가지 tongue assay를 수행할 수 있게 될 것입니다.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 세포 역학의 장기적인 시각화를 위해 안정화된 창을 통해 쥐 췌장의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

Intravital Imaging: 안정화된 이미징 창을 통해 마우스 췌장의 세포 수준을 관찰하는 방법

이 비디오는 이식된 루시페라제 발현 베타 세포를 비만하지 않은 당뇨병성 면역결핍 마우스로 시각화하는 이미징 기반 방법을 보여줍니다. 당뇨병이 있는 쥐에서 비장세포를 도입하면 점진적인 베타 세포 파괴가 일어나며, 기질 도입 후 발광이 감소하여 시각적으로 확인됩니다.

당뇨병성 비장세포에 걸린 면역결핍 마우스의 형질전환 베타 세포 이미징(Imaging Transgenic Beta-Cells in an Immunodeficient Mouse Challenged with Diabetic Splenocytes)

안구 이식 및 공 촛점 현미경을 결합 새로운 접근 방식은 이식 조직 내에서 단일 셀 해상도 세로, 비 침습적 실시간 이미징을...

길이, 비 침습적을위한 안구의 앞쪽 상공 회의소에 이식<em&gt; 생체에</em실시간으로 단일 셀 해상도&gt; 영상

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

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이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

배우세요 Lepr db 당뇨병 마우스에서 췌장 섬을 분리하고 2광자 현미경으로 베타세포의 인슐린 분비를 실시간 관찰하는 방법을. 이 기술은 제2형 당뇨병의 병리 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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