Name: 인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 배우세요 인간 유방암 조직과 세포주에서 mammosphere 형성 분석 방법을 통해 줄기세포 비율과 자가재생 능력을 평가하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 종양형성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 힐러리 공예, 선생님 더글러스 마이어스 특별한 언급과 제국 BRC, 건강 연구를위한 국립 연구소 및 조치에 대하여 암에 의해 지원됩니다.

절차는 다음과 윤리적 임페리얼 칼리지, 런던에 의해 승인되었습니다. 인간 유방암 세포주에서 차 Mammospheres의 1 세대 참고 : 멸균 문화 후드에서 다음 단계를 수행하십시오. <ol><li> Mammosphere 미디어 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 DMEM / F12, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ml의 스트렙토 마이신을 함유하는 준비한다. 10 NG / ml의 재조합 인간 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF; R &amp; D 시스템) 및 1X B27 보충제 20 NG / ml의 재조합 인간 상피 성장 인자 (시그마 EGF)을 첨가하여 사용 직전에 완료 매체를 준비한다. </li><li> (또는 원하는 유방암 세포주 70-80 % 컨 플루 언스 (confluence)에) 부착 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 함유하는 플라스크 대기음 매체는 1X PBS에 두 번 세척하고, 세포를 Trypsinize. </li><li> 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (200) XG 세포. mammosphere 미디어의 1-5 ml의 디 캔트 뜨는에 resuspend 세포. 피펫40 μm의 셀 스트레이너 캡 필터 상하 필요한 사용하는 경우, 단일 세포 현탁액을 얻었다. 단일 세포 현탁액 (그렇지 않은 경우, 3 회에 세포 현탁액을 주사기 25 G 바늘을 사용하여) 형성하고 있도록 혈구를 사용한다. </li><li> FACS를 통해 필요한 분리 된 CD44 + CD24- 세포의 일부는 항 CD24 피코 에리 트린 (PE) 및 항 CD44-형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 단일 클론 항체 (9)를 사용하는 경우. 또한, 자기 활성화 된 셀 정렬 안티 CD44 및 제조업체의 지침에 따라 항 CD24 - 바이오틴 결합 된 마이크로 비즈 (MACS) 시스템을 사용하는 인구를 분리. LD 열을 사용하여 LS 열을 사용하여 긍정적 인 선택, 음의 선택을 수행하고 17 유동 세포 계측법에 의해 모든 격리 세포의 표현형을 확인합니다. </li><li> 트리 판 블루를 사용하여 1 mL 당 생존 세포의 수를 계산합니다. 주 : 세포 생존율에 hemocy 그리드 내의 셀의 총 개수로 나누어 생존 세포의 수로서 계산된다tometer. 트리 판 블루를 차지 세포가 아닌 실행 가능한 것으로 간주됩니다. 다음 절차를 정확하게 생존 세포의 비율을 결정하는데 사용된다. <ol><li> PBS에서 트리 판 블루의 0.4 % 용액을 준비합니다. 세포의 1 ml의 트리 판 블루 원액 0.1 ML을 추가합니다. 혈구를 넣고 낮은 배율 현미경으로 즉시 검사합니다. 총 셀의 개수와 블루 염색 세포의 수를 계산. 가능한 세포 = [1.00 - (파란색 셀의 수 ÷ 총 세포 수)] × 100. </li><li> 배양 1 ㎖ 당 생존 세포의 수를 계산하는 아래의 식을 사용한다. 희석 배수를 보정해야합니다. 104 × 1.1 = 세포 / ㎖ 문화 × 가능한 세포의 수 </li></ol></li><li> 6- 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 전체 mammosphere 미디어 2 ㎖로 세포의 사전 결정된 양을 재현 탁. 파종 밀도는 일반적으로 500-4,000 세포 / cm 아니라 당이 세포입니다. 선택적으로 사용 싸다w 부착 24 웰 플레이트는 매체의 0.5 ml의 동일한 밀도로 세포를 파종한다. 참고 : 우리는 관심의 각 세포주에 대한 파종 밀도와 문화의 시간을 최적화하는 것이 좋습니다. </li><li> 특히 제 오일의 성장 단계에서, 플레이트를 방해하지 않고 (세포주 및 mammospheres의 크기에 따라) 5-10일 37 ° C, 5 % CO 2에서 초저 부착 6 웰 플레이트를 인큐베이션 . </li></ol> 인간의 유방암 임상 샘플에서 차 Mammospheres의 2 세대 주 : 인간 유방암 조직 유방 종양의 제거를위한 수술을받은 환자로부터 얻을 수있다. 100 U / ml의 페니실린 100 U / ml의 스트렙토 마이신을 포함하는 배지에서 50 ml의 멸균 튜브에 최대 24 시간 동안 얼음에 저장 조직. 멸균 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다. <ol><li> 미디어의 작은 부피와 100mm 조직 배양 접시에 시료를 전송합니다. Remov멸균 가위, scapel 및 핀셋을 사용하여 전자 지방 조직. </li><li> DMEM / F12의 2-3 ML을 추가하고 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 살균 scapel 또는 면도날 1mm 3 조각으로 샘플을 말하다. </li><li> 목록 조직편 재현 탁 단백질 분해 효소 (3,000 U / ml의 콜라겐 및 1000 U / ㎖의 히알루로니다 아제)를 함유하는 10 ㎖의 DMEM을 프리 - 가온하고 모든 조직 파편이 소화 될 때까지 회전 진탕하에 37 ℃에서 배양한다. 일반적으로 완전한 소화은 1-3 시간 정도 걸립니다. 종양의 병리학 자에 따라 소화 시간을 조정합니다. (예를 들어 유방 선암 더 취약 짧은 소화 시간이 필요 점액 성 암종에 비해 소화가 일반적으로 어렵다). 혈구에서 20 μl의 서스펜션을 관찰하여 소화 모든 ½ 시간의 정도를 평가합니다. </li><li> 단편 후, 5 분 동안 침강 실 TEM에서 10 분 동안 200 XG에 15 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 상청을 전송하도록 허용아네트. mammosphere 매체 5 ㎖ - 조심스럽게 1에 재현 탁하고 세포 상등액을 가만히 따르다. </li><li> 취득 및 단일 세포 현탁액을 도금하는 세포주를 위해 위의 설명 된 단계 1.1 ~ 1.4을 따릅니다. 필요한 경우 G (25)를 통해 세포가 세포 손상을 제한하기 위해 2 배의 최대 시린지 패스. </li></ol> 3. Mammosphere 효율 (%) 계산 성형 <ol><li> 배양 기간 후, 40 배 배율 현미경 mammospheres (이상 40 μm의) 직경을 계산합니다. 디지털 화상 (5) 임의의 광학 현미경에 디지털 카메라를 사용하여 필드 및 수집 소프트웨어를 이용 mammospheres 크기를 결정한다. 어떤 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 다음 식을 이용 Mammosphere 형성 효율 (MFE의 %)을 계산한다 MFE (%)는 = (웰당 mammospheres의 #은) / (웰 당 세포의 접종은 #) × 100 </li></ol> 자기 갱신의 평가를위한 Mammospheres 4. 직렬과 Passaging <ol><li&gt; 피펫 15ml를 튜브에 각 웰로부터 mammospheres 함유 매체. PBS로 우물을 세척하고 수집 된 미디어에 추가 할 수 있습니다. 실온에서 10 분 동안 원심 분리기 (115) XG. </li><li> 뜨는을 취소하고 미리 예열 0.5 % 트립신 / 0.2 % EDTA의 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 2 ~ 3 분 동안 품어. </li><li> 트립신을 중화 FCS 500 μl를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 구체들을 분해 아래로 mammospheres 미디어, 피펫 최대 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 펠렛을 취소하고. </li><li> 혈구와 세포를 세어 세포는 단일 세포 현탁액에있는 경우 결정합니다. 25 G를 통과하지 않으면 단일 세포를 얻기 위해 3 회까지 주사기. 기본 생성에 사용되는 동일한 농도에서 새로운 초저 부착 6 웰 플레이트에 세포를 시드. </li><li> 5-10일 후, 구&gt; 40 μm의 수와 이전에보고 된 공식을 사용하여 구체 형성 효율을 계산한다. </li></ol>

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<li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281(2013).</li>
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</ol>

저자는 이 기사의 공정성을 침해하는 것으로 인식될 수 있는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

기본 및 보조 mammospheres의 성공적인 평가는 세포가 최소한의 구 집합으로, 단일 클론에서 양식을 mammospheres 충분히 낮은 밀도에서 도금되는에 의존합니다. 그러나 너무 낮은 밀도가 너무 적었 mammospheres 통계적 처리의 효과를 구별하기 위해 형성 할 수있다. 파종 밀도가 그들의 영역 형성의 효율에 상당히 다를 수 있기 때문에 사용 된 각각의 세포주에 대해 최적화되어야한다 (낮은 E-cadherin의 표현들은 덜 안정하고 짧은 기간 mammosphere 배양 물 (18)을 형성 할 수있다). 이 최적화 단계는 단일 세포의 클론 성장에서 가장 기본 및 보조 구 형성 결과를 확인해야합니다. 웰 당 하나의 셀을 도금 전적으로 mammosphere 클론 형성을 보장하는 유일한 방법이며, 새롭게 도출 된 샘플 (13)의 자기 갱신 / 분화 속도를 정량화 추천 할 수있다. 그러나이 방법은 복잡 요인을 앓고 : mammosphere 형성1 %의 효율은 96 웰 플레이트 당 ...

줄기 같은 암 줄기 세포가 이끄는 종양 세포 계통의 존재는 크게 종양 이질성에 대한 우리의 이해에 추가했다. 종양의 일부 표현형 다양성 유전자 구별 클론의 클론 생장에서 발생 않지만, 실질적인 성분은 후생 유전 학적 차이에 기인하는 것으로 나타난다 : 암 세포가 특정 유전자의 활성화 또는 억제를 통해 줄기, 전구 및 분화 상태 사이 (가역적 때때로) 전환 할 수 식 프로그램 1-3. 이것은 현재 조절 성 요소를 제공하는 암, 간질 또는 면역 인접 셀로부터 측 분비와 함께 그 결과의 분비 신호와 세포에서 발현되는 유전자 발현 프로그램을 반영 셀 고유 또는 외인성 인자를 반영하고있다 같은 정도로서 microenviromental 조건 저산소증 2,4,5. 혁신적인 혈통 추적 방법이지만이들 생체 내 틈새 (6)에 추정되는 암 줄기 세포를 연구 할 수있는 능력 전진 - 8 구 - 형성 분석법 적어도 사용 분석 조건 하에서, 줄기 세포처럼 행동하도록 유방암 세포 잠재력을 추정 인기 편리한 접근 남아있다. 그것은 종종 더 mesenchymal- 상피 대응하도록 제안되어 막 마커 CD44 및 CD24 9 및 효소 ALDH (알데히드 탈수소 효소)의 활동 수준 (10), 마커의 발현에 의해, 정화 암 줄기 세포 대 향적 방법과 함께 사용 -like 암 줄기 세포 각각 11. 구 형성 방법이 제 상피 성장 인자 (EGF) (12)의 첨가 비 점착성, 무 혈청 조건에서 단일 클론으로부터 추정되는 줄기 세포의 성장을 가능 neurosphere 분석법 개발되었다 나중에 유용 정상 및 암에 적용되는 유방 조직. 뼈 선의의 줄기 세포는 생체 내에서 활성화를 선호 할 요인의 정확한 조합을 발생하지 않습니다, G0 단계에서 내립니다. mammosphere 분석 대신 유사 분열 부문 태세 이미 13을 분할하거나 세포의 성장을 할 수 있습니다. 이들 전구 세포가 아닌 세포 진정한 정지되지만, 분석에 사용 된 EGF 및 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 유사 분열 증식 세포 단계 일 수있다. 그럼에도 불구하고, 그들은 활성화 줄기 세포 - 관련 시그널링의 범위 (14) 경로를 포함하고있다. 또한, 그 형성 속도는 마우스 이종 이식편에서 2,15,16을 제한 희석 분석에서의 역가 측정들이 찍은 된 조직의 종양 발생에 관한 &lt;/ SUP&gt;. 여기서 우리는 단일 세포를 분리 및 인간 유방암 세포주 및 유방암의 임상 샘플 모두로부터 mammospheres 차를 생성하기 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리는 또한 자기 갱신을 평가하는 주요 mammospheres의 일련 구절을 수행하는 방법, 및 구 다른 시드 밀도에서 비교를 (그림 1의 방식을 참조) 할 수 있습니다 효율성을 형성 계산하는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-글루타민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml 페니실린 & 스트렙토마이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>시그마 알드리치</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)</td><td>R& D 시스템</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x B27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 트립신/0.2% EDTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>태아 종아리 혈청</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>낮은 부착성 6웰 플레이트</td>, <td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Collagena 유형 1A</td><td>, Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr>, <tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>멸균 메스</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>멸균 마이크로 해부 가위</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유방암 조직과 세포주에서 mammosphere 형성 분석

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

건강한 조직 많은 혈액 및 고형 악성 종양과 유사하게이 더욱 분화 된 자손을 발생주기 동안 자기 - 갱신 줄기 같은 암세포의 서브 세트로, 계층 적으로 구성하는 것으로 생각된다. 이해 및 향상된 화학 치료 및 비 - 조혈 종양 부피에 비해 전파 저항을 가질 수있다 유방암 이러한 암 줄기 세포를 표적으로는, 중요한 연구 분야가되고있다. mammosphere 분석이 또한 널리 향적 sphere-를 식별하는 능력을 위해 사용되었다 : CD44, CD24, 및 ALDH 활성 포함 마커 전향 면역 결핍 생쥐에 주입 할 때 향상된 발암 표시 세포를 분리하는 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 평가할 수있다 하나의 줄기 세포와 같은 세포 클론 개발을 형성한다. 여기에서 우리는 세포 라인 또는 기본 환자 샘플, 자신의 계대 및 구 F를 추정하는 계산에서 mammospheres의 적절한 배양 방법을 간략하게 설명orming 효율 (SFE). 먼저 우리는 적절한 계획과 mammosphere 실험의 해석에 주요 고려 사항과 함정에 대해 설명합니다.

다른 샘플이나 다른 치료를 실시 그 시드 초기 세포 정상화 후 형성 mammospheres&gt; 40 μm의 수에 따라 다를 수 있습니다. 세중에서 재배 각각의 치료를위한 mammosphere 형성 효율 (MFE)를 계산합니다. 이것은 다른 시드 밀도 실험을 비교 할 수 있습니다. 데이터는 가장 이상적 양성 및 음성 대조군으로, 막대 그래프에 표시하고, 삼중 웰 걸친 표준 편차를 표시한다. 지속적으로 60-80% 합류 사이에 비 부착 판에 부착 된 세포를 전송합니다. 조심 셀 카운팅 정확하게 치료의 효과를 정량화에 필수적이다. 이 중요한 단계가 아니라 같은 처리는 별도로 여러 현탁액을 준비하여 결과에 기여하고 변화의 정도를 예측. 측정 된 세포 농도가 같은 우물에서 크게 다른 경우, 귀하의 계산 방법 (그림 2) 정제 고려하십시오. <pFO 클래스 = &quot;jove_content&quot;유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img al...

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

다음 실험의 전체적인 목적은 암 세포주 또는 종양 조직 샘플 내에서 줄기세포 유사 세포의 비율을 추정하고, 연속적인 계대 배양을 통해 이들의 자기 재생 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 암 세포주 또는 종양 조직을 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성한 다음, 세포 분류를 통해 CD 44 양성 및 CD 24 음성 세포 하위 집단을 분리합니다. 분리된 세포를 저부착 플레이트에 접종하고 성장 시간을 거친 후, 광학 현미경으로 구체(sphere) 형성 여부를 관찰합니다.형성 효율은 최초에 접종한 세포 수 대비 형성된 구체(sphere)의 수를 결정하여 정량화합니다. 단일 세포 현탁액을 생성하고, 성장을 위한 시간을 부여하며, 구체 형성 효율을 측정하는 과정은 연속적인 계대 배양을 통해 반복되며, 궁극적으로 시간에 따른 세포의 자가 재생 능력을 측정하는 지표를 제공합니다. 이 방법은 자가 재생과 같은 줄기세포의 기능적 특성을 보이는 세포를 식별하기 위한 간단한 관점의 분석법을 제공할 뿐만 아니라, 생체 내(in vivo) 종양에서 유래한 줄기세포 수에 대한 정량적 추정치를 제공합니다.구체 형성 분석의 핵심 원리는 각 구체가 단일 세포로부터 유래되었으므로 클론성이라는 점입니다. 이러한 이유로 세포 밀도는 이 분석에서 가장 중요한 변수이며, 이는 결과의 신뢰성에 결정적인 영향을 미칩니다. 무균 배양 후드 내에서 작업을 수행하십시오. 70~80% 정도로 합쳐진(confluent) MCF 7 또는 MDA MB 2 3 1 세포를 사용하여 이 절차를 시작하십시오.플라스크에서 배지를 흡입하여 제거하고, PBS로 세포를 2회 세척합니다. 그다음 trypsin EDTA를 첨가하고 2~6분 동안 배양한 후, 10% FBS가 포함된 mammos sphere 배지를 첨가하여 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 상온에서 200 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 제거합니다. 그다음 1~5 mL의 manosphere 배지로 세포를 재현탁하고, 피펫팅을 10회 반복하여 세포 펠렛을 풀어줍니다. 이어서 세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너 캡 필터에 통과시킨 후, 연결된 튜브에 여과액을 수집합니다.단일 세포 부유액을 얻기 위해, 재현탁된 세포의 20 µL 분량을 헤모사이토미터에 분주하고 현미경으로 관찰합니다. 여기에서 보는 것과 같이 세포 응집물이 관찰되면, 주사기를 사용하여 부유액을 25 gauge 바늘 내부와 외부로 한두 번 밀어 넣어 마사지합니다. 여기에서 보여주는 것처럼 세포가 단일 세포 부유액으로 분산되면, 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sourcing) 또는 자기 활성 세포 분류법(magnetic activated cell sourcing)을 통해 CD 44 양성 CD 24 음성 세포 하위 집단을 분리합니다.LS 컬럼을 사용하여 CD 44 양성 세포를 양성 선택합니다. 원하는 세포가 LS 컬럼 벽에 부착되므로 통과액은 버리고 컬럼에서 세포를 회수합니다. 5 mL의 버퍼를 넣고 컬럼과 함께 제공된 플런저를 눌러 원하는 세포를 씻어 내립니다.다음으로, LD 컬럼을 사용하여 음성 선택(negative selection)을 통해 세포군을 추가로 정제합니다. 이때 CD 24 양성 세포는 LD 컬럼에 부착됩니다. CD 24 음성 세포가 포함된 통과액(flow through)을 수집합니다.다음으로, 유세포 분석법을 사용하여 분리된 모든 세포의 표현형을 확인합니다. 트라이판 블루 배제법을 사용하여 세포 현탁액을 적절히 희석한 후 생존 세포의 밀도를 계산합니다. 6웰 초저부착 플레이트의 각 웰에 2 mL의 완전한 mammosphere 배지를 넣고, 웰당 500 내지 4,000 cells/cm²의 세포를 분주합니다.구체가 관찰될 때까지 5~10일 동안 플레이트를 흔들리지 않게 주의하며 배양합니다. 구체의 직경이 최소 40 µm가 되고 아직 세포 사멸(apoptosis)이 시작되지 않을 때까지 배양을 계속합니다. 유방 종양 제거 수술을 받는 환자로부터 인간 유방암 조직을 얻습니다.멸균된 조직 배양 후드 내에서 100 units/mL의 penicillin과 100 units/mL의 streptomycin이 포함된 DMEM 50 mL가 담긴 멸균 튜브에 조직을 넣고 얼음 위에서 최대 24시간 동안 보관하십시오.멸균 가위, 메스 및 핀셋을 사용하여 소량의 배지가 담긴 100 millimeter 조직 배양 접시에 샘플을 옮깁니다. 지방 조직을 제거합니다. 2~3 milliliters의 D-M-E-M-F 12를 첨가하고, 멸균 메스나 면도날을 사용하여 큰 조각이 남지 않을 때까지 샘플을 잘게 다집니다.조직 조각을 구부리고 단백질 분해 효소가 포함된 37 °C로 예열된 DMEM 10 mL를 넣은 후, 회전 쉐이커에서 1~3시간 동안 배양합니다. 소화 효소를 사용하여 생존 가능한 영장류 종양 세포를 분리할 때는 세포 사멸과 세포 기질로부터의 충분한 추출 사이의 임계적 절충안이 존재합니다. 성공을 보장하려면 이 소화 과정을 정기적으로 모니터링하는 것이 필수적입니다. 30분마다 현탁액 20 µL를 혈구계(hemocytometer)에 분주하고, 현미경을 사용하여 소화 정도를 평가하십시오.소화가 완료되면, 조각들이 가라앉을 때까지 5분 동안 둡니다. 그런 다음 상층액을 15 mL 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.상온에서 200 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오. 원심분리가 끝나면 상층액을 조심스럽게 따라내고, 1~5 mL의 mammosphere 배지에 세포를 재부유시키십시오. 그런 다음 이전 섹션에서 설명한 대로 단일 세포 현탁액을 준비하여 플레이팅하십시오.이 비디오에서, 필요한 경우 세포를 분산시키기 위해 25 gauge 주사기를 사용하여 세포를 최대 2회 위아래로 피펫팅하십시오. 배양 기간이 지난 후, 디지털 카메라가 장착된 현미경 하에서 40배 배율로 세포를 관찰하십시오. 무작위로 선택한 5개 시야의 이미지를 획득하십시오.모든 이미지 촬영이 완료되면, 획득 소프트웨어를 사용하여 직경이 40 microns보다 큰 마이크로스피어의 수를 결정합니다. 마지막으로, 각 웰에 파종된 세포 수 분의 각 웰 내 마모스 스피어(mamos spheres) 수에 100을 곱하여 메타스피어 형성 효율을 계산합니다. 각 웰에서 마모스 스피어가 포함된 배지를 15 milliliter 튜브에 옮깁니다. 각 웰을 PBS로 세척하고 이를 수집된 배지에 추가합니다.그런 다음 상온에서 115 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거합니다. 펠렛을 500 µL의 예열된 trypsin EDTA에 현탁하고 2~3분 동안 배양합니다.배양 후, tryin을 중화시키기 위해 FBS 500 µL를 첨가한 다음 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고, 펠릿을 100 µL의 mammosphere 배지로 재부유시킨 후 피펫팅하여 구체(sphere)를 해리시킵니다. 다시 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고, 단일 세포 현탁액으로 분산되었는지 확인합니다.그렇지 않은 경우, 단일 세포를 얻기 위해 25 gauge 주사기로 최대 2회 통과시킨 후, 1차 배양 시와 동일한 밀도로 새로운 ultralow attachment 6-well 플레이트에 세포를 분주합니다. 5~10일 후, 40 µm보다 큰 구체를 계수하고 이전과 동일하게 계산하여 구체 형성 효율을 추정합니다. 본 비디오에서 설명한 바와 같이, 상피성 에스트로겐 양성 CF7 및 중간엽 삼중 음성 MDA-MB-231 세포주로부터 mammosphere를 배양하였습니다. 40 µm보다 큰 mammosphere의 수는 각 세포주의 구체 형성 효율에 대한 추정치를 제공합니다.여기서 나타나는 최소한의 세포 융합 응집은 MCF-7의 경우 cm²당 500 cells, MDA-MB-231의 경우 cm²당 1000 cells의 낮은 밀도로 도말하여 달성되었음에 유의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 서로 다른 세포주나 수술적 종양 샘플에서 유래한 mammosphere를 배양하고 계수하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 클론성을 보장하기 위해 세포를 낮은 밀도로 파종하고, 수술 샘플에서 세포를 추출할 때 높은 비율의 세포 생존율을 확보하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.본 절차 외에도, 관심 조직의 체내 종양 유전성을 결정하기 위해 면역 결핍 마우스에 이종 이식 세포 집단을 주입하는 것과 같은 다른 방법들이 수행되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

HC11 lactogenic 차별화는 mammospheres이라고 돔 구조의 형성에 의해 특징 수 있습니다. 구조 lactogenic 차별 quantifying에 투입 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거 수 있습니다.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

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1차 유방구의 생성: 세포 효능을 결정하는 기술

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기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

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배우세요 인간 유방암 조직과 세포주에서 mammosphere 형성 분석 방법을 통해 줄기세포 비율과 자가재생 능력을 평가하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 종양형성 연구에 활용됩니다.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

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