인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 암 세포주 또는 종양 조직 샘플 내에서 줄기 유사 세포의 비율을 추정하고 연속적인 계대에 대한 자가 재생 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 암 세포주 또는 종양 조직을 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성한 다음 CD 44 양성 및 CD 24 음성 세포 subset을 분리하도록 분류합니다. 세포는 낮은 부착 플레이트에 파종되고 성장 시간이 허용된 다음 광학 현미경 구체로 검사합니다.

성형 효율은 원래 파종된 세포의 수에 비해 형성된 구체의 수를 결정하여 정량화됩니다. 단일 세포 현탁액을 생성하고, 성장 시간을 허용하고, 구 형성 효율을 결정하는 과정은 연속적인 계대에 걸쳐 반복되며, 궁극적으로 시간이 지남에 따라 세포의 자가 재생 능력을 측정합니다. 이 방법은 자가 재생과 같은 줄기세포의 기능적 특성을 나타내는 세포를 식별하기 위한 간단한 원근 분석을 제공할 뿐만 아니라 in vivo 종양에서 유래한 줄기세포의 수를 정량적으로 추정

구 형성 분석의 핵심 교리는 각 구체가 클론을 위해 존재하는 단일 세포에서 파생된다는 것입니다. 이러한 이유로 세포 밀도는 이 분석에서 가장 중요한 매개변수인데, 이는 멸균 배양 후드 하에서 작동하는 신뢰성에 중요한 영향을 미치기 때문입니다. 70-80% cofluent인 MCF 7 또는 MDA MB 2 3 1 셀로 이 절차를 시작합니다.

플라스크에서 배지를 흡입하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 트립신 EDTA를 추가하고 10%FBS를 함유한 맘모스 구형 배지를 추가하여 분리 윈치 후 2-6분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 15ml 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 G로 200회 회전시킵니다.

원심분리 후 세나를 디캔팅합니다. 그런 다음 resus는 1-5 밀리리터의 manosphere medium에 세포를 현탁시키고 세포 펠릿을 분해하기 위해 10 번 위아래로 피펫합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 40미크론 세포 트레이닝 캡 필터로 더 실행하고 부착된 튜브를 통해 흐름을 수집합니다.

단일 세포 현탁액을 얻기 위해 재현탁된 세포의 20마이크로리터 분취액을 혈구 분석기에 넣고 현미경을 사용하여 검사합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 세포 클러스터가 관찰되면 주사기를 사용하여 25 게이지 바늘 안팎으로 현탁액을 한두 번 마사지합니다. 세포가 여기에 표시된 것처럼 단일 세포 현탁액으로 분산되면 형광 활성화 세포 소싱 또는 자기 활성화 세포 소싱을 통해 CD 44 양성 CD 24 음성 세포 subset을 분리하기 위해 물러납니다.

LS 열을 사용하여 CD 44 양극 셀을 긍정적으로 선택합니다. 원하는 셀이 LS 컬럼의 벽에 부착되어 있기 때문에 플로우를 버리고 컬럼에서 셀을 제거합니다. 5ml의 완충액을 바르고 컬럼과 함께 제공된 플런저를 바르고 눌러 원하는 세포를 씻어냅니다.

다음으로, LD 열을 사용하여 negative selection에 의한 모집단을 더욱 정제합니다. 여기서 CD 24 양성 세포는 LD 기둥에 부착되어 있습니다. CD 24 음성 세포를 포함하는 흐름을 수집합니다.

다음으로, 유세포 분석을 사용하여 모든 분리된 세포의 표현형을 확인합니다. Trian blue exclusion 방법을 사용하여 세포 현탁액을 적절하게 희석한 후 생존 가능한 세포의 밀도를 계산합니다. 500에서 4, 완전한 맘모스 구체의 2 밀리리터에 있는 000 세포 센티미터 정방미터를 가진 6개의 잘 ultralow 부착 판의 각 우물을 씨를 뿌린다. 보통.

구체가 관찰될 때까지 5일에서 10일 동안 접시를 방해하지 않도록 주의하면서 플레이트를 배양합니다. 구체의 직경이 40미크론 이상이 될 때까지 배양을 계속하지만 아직 회전을 시작하지 않았습니다. 자멸사. 유방 종양 제거 수술을 받는 환자로부터 인간 유방암 조직을 채취합니다.

티슈를 50ml로 최대 24시간 동안 얼음에 보관하십시오. 밀리리터당 100단위, 페니실린 및 밀리리터당 100단위를 포함하는 DMEM의 멸균 튜브. 멸균 조직 배양 후드 아래에서 작동하는 스트렙토마이신.

멸균 가위, 메스 및 핀셋을 사용하여 소량의 배지가 들어 있는 100mm 조직 배양 접시에 샘플을 옮깁니다. 지방 조직을 제거합니다. D-M-E-M-F 12 2-3ml를 넣고 멸균 메스 또는 면도날을 사용하여 큰 조각이 남지 않을 때까지 검체를 다집니다.

Reeses는 단백질 분해 효소가 포함된 조직 조각과 10ml의 예열 DMEM을 구부리고 섭씨 37도의 회전식 셰이커에서 1-3시간 동안 배양합니다. 소화 효소를 사용하여 생존 가능한 영장류 종양 세포를 쌓을 때 세포 사멸과 세포 기질에서 ins로의 충분한 추출 사이에는 중요한 절충점이 있습니다. 이 소화를 정기적으로 모니터링하려면 성공이 필수적인지 확인하십시오 30분마다 20마이크로리터의 현탁액을 혈구 분석기에 피펫으로 주입하고 현미경을 사용하여 소화 정도를 평가합니다.

일단 소화가 완료되었습니다. 파편이 5분 동안 침전되도록 합니다. 그런 다음 supinate를 15 밀리리터 원추형 폴리 프로필렌 튜브로 옮깁니다.

실온에서 200분 동안 G 200회 10회 원심분리. 스핀 후, 앙와위 제제를 조심스럽게 디캔팅하고 1-5 밀리리터의 맘모스 구 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 이전 섹션에서 설명한 대로 단일 세포 현탁액을 준비하고 플레이팅합니다.

이 비디오에서는 25게이지 주사기를 통해 세포를 위아래로 최대 2회 요청하여 필요한 경우 세포를 분산시킵니다. 배양 기간이 끝나면 디지털 카메라가 장착된 현미경으로 40배 배율로 세포를 관찰합니다. 5개의 임의 필드의 이미지를 획득합니다.

모든 이미지를 촬영한 후 획득 소프트웨어를 사용하여 직경이 40미크론보다 큰 마이크로스피어의 수를 확인합니다. 마지막으로, 메타스피어 형성 효율을 계산합니다: 각 웰에 있는 마모 구체의 수를 각 웰에 파종된 세포의 수에 100을 곱한 값으로 나누어 각 웰의 마모스 구체를 포함하는 매체를 15밀리리터 튜브에 베팅합니다. PBS로 각 우물을 씻고 수집된 매체에 첨가합니다.

그런 다음 실온에서 10분 동안 115배 G로 세포를 원심분리합니다. 스핀 후 supinate andries를 버리십시오. 펠릿을 500마이크로리터의 예열 tryin EDTA 배양액에 2-3분 동안 현탁시킵니다.

배양 후 500마이크로리터의 FBS를 첨가하여 tryin을 중화한 다음 500배 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 스핀이 완료되면 supinate를 버리고 100 마이크로 리터의 맘모스 구, 중간 피펫을 위아래로 펠릿을 회전시켜 구를 분해합니다. 다시 말하지만, 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수하고 단일 세포 현탁액으로 분산되었는지 여부를 확인합니다.

그렇지 않은 경우 25 게이지 주사기를 최대 2회 통과시켜 단일 세포를 얻고 세포를 새로운 초저농도로 시드합니다. 첨부 6, 5-10일 후 1차 생성에서 사용된 것과 동일한 밀도의 웰 플레이트, 40미크론보다 큰 구체를 계산하고 이전과 같이 공포 형성 효율을 계산하여 구 형성 효율을 추정합니다. 대기는 상피 에스트로겐 양성 CF 7 및 am 중간엽 삼중 음성 MDA 2 3 1 세포주에서 성장하였으며, 이 비디오에 설명된 바와 같이, 40미크론보다 큰 맘모스 구체의 수는 각 세포주에 대한 구 형성 효율의 추정치를 제공합니다.

여기에서 볼 수 있는 최소 세포 융합 응집은 MCF 7의 경우 센티미터 제곱당 500 셀, MDA의 경우 센티미터 제곱 당 1000 셀의 저밀도 도금에 의해 달성되었습니다 2 3 1. 이 비디오를 시청한 후에는 다른 세포주 또는 수술 종양 샘플에서 파생된 유방 구체를 성장시키고 계수하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 클론성을 보장하고 수술 샘플에서 세포를 추출할 때 높은 비율의 세포가 생존할 수 있도록 낮은 밀도로 세포를 시딩해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차 외에도, 관심 조직의 생체 내 종양 발생성을 결정하기 위해 면역이 저하된 마우스에 세포 이종 이식 집단을 수행하는 것과 같은 다른 방법을 수행해야 합니다.