소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

여기에서는 펩티딜아르기닌 데이미나제(PADI) 효소 억제제인 BB-Cl-아미딘이 체외 유방암 종양원성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 연질 한천 집락 형성 분석법을 사용하는 방법을 문서화합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 반고체 매트릭스에서 세포의 증식 능력에 대한 치료의 효과를 정량적으로 결정하는 것인데, 이는 부드러운 한천 분석을 사용하여 세포 종양 genicity의 특징이며, 종양 genicity는 반고체 AROS gel 내에서 colony를 형성하는 세포의 능력을 통해 측정됩니다. 형질전환되지 않은 세포는 이러한 환경에서 빠르게 증식할 수 없기 때문에 반고체 AROS 겔은 먼저 0.6%AROS 바닥층을 만들어 구성됩니다. 다음으로, 0.3%AROS 겔 층을 포함하는 세포를 맨 아래 층 위에 추가합니다.

이 분석에서 실험 세포는 Dr.Subramanian이 개발한 펩티딜, 아르기닌, 다제 또는 패드 효소 억제제로 처리됩니다. 매주마다, 추가 먹이는 층은 처리의 유무에 관계없이 0.3%aros 젤인 추가됩니다. 마지막 단계는 분석을 위해 70마이크로미터보다 큰 군집의 수를 세는 것입니다.

궁극적으로 반전 현미경은 대조군과 치료군 사이의 콜로니 수의 차이를 보여주기 위해 사용됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 Achi Huta입니다. 저는 베이커 동물 건강 연구소(Baker Institute for Animal Health)의 스콧 크로스(Scott Kros) 박사 연구실의 대학원생입니다.

코넬 대학교에서 소프트 타이거 군집 형성 분석은 약물, 호르몬 및 기타 다양한 치료 조건에 대한 암세포의 민감성과 관련하여 광범위한 암세포의 종양 genicity를 평가하는 것과 같은 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 깨끗하고 건조한 100ml 유리병에 3%2개의 하이드록시에틸 아로스를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 2개의 하이드록시에틸 아로 0.9g을 넣은 다음 증류수 30ml를 추가합니다.

혼합물을 전자레인지에 15초 동안 돌리고 부드럽게 휘젓습니다. AROS 분말이 완전히 용해될 때까지 이 단계를 반복합니다. 다음으로, 병이 들어있는 용액을 15 분 동안 오토 클레이브합니다.

agros 용액을 실온으로 식히십시오. 더 나아가기 전에, 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터 및 10밀리리터 피펫 여러 개를 예열하여 피펫에서 아로스가 응고되는 것을 방지하십시오. 부분적으로 취급할 때는 병 뚜껑을 풀고 미리 만들어진 3%2 HYDROXYETHYL aro 용액을 전자레인지에 15초 동안 돌립니다.

그런 다음 용액을 부드럽게 휘젓고 전자레인지에 15초 더 돌립니다. ARO 용액을 소용돌이칠 때 용액이 공기에 노출되면 위로 올라와 병 전자레인지에 고체 젤이 남아 있으면 넘칠 수 있으므로 주의하십시오. 몇 초 더 동안 ARO 용액이 들어 있는 병을 섭씨 45도의 수조에 보관하여 농업 용액이 조기에 응고되는 것을 방지합니다.

다음으로, Prewarm 피펫을 사용하여 12ml의 예열 매체를 멸균 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 즉시 3%aros 용액 3ml를 넣고 원뿔형 튜브를 부드럽게 뒤집어 aros를 매체와 혼합합니다. 그런 다음 기포를 형성하지 않고 6개의 웰 배양 플레이트의 각 웰에 이 혼합물 2밀리리터를 부드럽게 첨가합니다.

6웰 배양 플레이트를 섭씨 4도의 평평한 표면에 1시간 동안 수평으로 배양하여 혼합물이 응고되도록 합니다. 혼합물이 응고된 후 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 이제 맨 아래 레이어를 사용할 준비가 되었습니다.

이 절차의 어려운 측면은 모든 세포가 균등하게 분포되어 있고 용융된 아그라 껍질이 각 웰에 첨가하기 전에 응고되지 않도록 하여 액체 아그라 겔을 첨가하기 전에 셀츠가 배지에서 혼합되도록 하는 것입니다. 또한 파이프는 취급하는 동안 용액이 응고되는 것을 방지하기 위해 미리 예열되어 있습니다. 층을 포함하는 세포를 첫째로 trypsin 눈 MCF 10 DCIS 세포를 준비하고 40의 세포 농도, 밀리리터 당 000의 세포로 묽게 하기 위하여는, 그 후에 prewarm 피펫을 사용하여 매체의 8 밀리리터를 가지고 가고 메마른 50 밀리리터 원뿔 관으로 옮깁니다.

즉시 원뿔형 튜브에 2ml의 3%aros를 추가하고 부드럽게 뒤집어 aros를 미디어와 혼합합니다. 거품이 생기지 않도록 하십시오. 다음으로, 세포 2 밀리리터를 가져 와서 DMSO 또는 DMSO 단독으로 2 마이크로 몰 BB 클로라민으로 처리하고, 처리 후 대조군으로 0.6 % aros와 세포를 1 대 1 희석으로 혼합하여 1 마이크로 몰 BB 클로라민의 최종 농도를 만듭니다.

그런 다음 세포 aros 혼합물 1 밀리리터를 가져 와서 6 웰 배양 플레이트의 바닥 층에 부드럽게 첨가합니다. 6웰 배양 플레이트를 섭씨 4도의 평평한 표면에 최소 15분 동안 수평으로 놓아 최상층이 응고되도록 합니다. 혼합물이 응고된 후 공급 층을 추가하기 전에 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 일주일 동안 놓습니다.

이전과 같이 미리 만들어진 3%2 하이드록시에틸 아로 용액을 전자레인지에 돌리고 섭씨 45도의 수조에서 농업 용액 병을 평형화하여 수분 층 준비를 시작하고, 3% 농업 용액 1밀리리터와 따뜻한 매체 9밀리리터를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 혼합한 다음 부드럽게 뒤집어 아로스를 매체와 혼합합니다. 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 혼합물을 BB 클로라민으로 처리한 후, 혼합물 1ml를 바닥과 부드러운 층을 포함하는 6개의 웰 배양판의 각 웰에 부드럽게 첨가합니다.

그런 다음 6웰 배양 플레이트를 섭씨 4도의 평평한 표면에 최소 15분 동안 수평으로 놓아 혼합물이 응고되도록 합니다. 피더 층이 응고된 후 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. Bader, 콜로니 형성이 관찰될 때까지 세포에 새로운 배지를 보충하기 위해 기존 공급층에 1ml의 0.3%agros 배지 처리 용액을 오버레이하여 매주 이 공급 절차를 반복합니다.

부드러운 한천에서 2주 반 동안 세포가 성장한 후 각 웰의 군체 수를 계산합니다. 정량화를 용이하게 하기 위해 광학 현미경을 사용하여 그리드를 투명하게 인쇄하고 그리드를 6개의 웰 플레이트에 부착하여 계수하는 동안 세포의 위치를 찾는 데 도움을 줍니다. 콜로니 크기는 각 콜로니의 직경에 의해 정량화되며, 어떤 콜로니가 점수가 매겨질지 결정하기 위해 참조 콜로니 크기를 미리 정의합니다.

예를 들어, 여기에서 70마이크로미터 이상의 콜로니 크기가 데이터 분석에 포함됩니다. 카운팅 후 젤이 마르는 것을 방지하기 위해 파라폼으로 6개의 우물 배양 플레이트를 밀봉합니다. 추가 식민지 형성을 방지하고 향후 계수를 위해 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오.

결과는 BB 클로라민이 패드 억제제의 존재 하에서 MC 10 DCIS 세포 유래 콜로니의 형성을 현저히 억제한다는 것을 보여줍니다. DMSO 대조군과 비교했을 때 군체 형성과 군체 크기가 모두 감소했습니다. BB 클로라민 처리된 MCF 10 DCIS 세포의 콜로니 크기는 주로 20 내지 100마이크로미터 범위 내에 있었습니다.

DMSO 대조군의 군집 크기는 70-150 마이크로 미터의 더 큰 범위를 나타 냈지만, 2 주 반 동안 성장한 후에는 70 마이크로 미터보다 큰 군체를 계산하고 분석했습니다. DMSO 대조군에서는 평균 약 3,500개의 집락이 관찰된 반면, BB 클로라민 처리군에서는 약 2,000개의 집락만이 관찰되었습니다. 2주 반 동안 부드러운 농업을 한 후, 이는 1마이크로몰 BB 클로라민의 존재 하에서 평균 집락 형성이 44% 감소했음을 나타내며, 이는 패드 억제제에 의한 유방암 세포의 상당한 종양 유발 억제를 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 취급 시 용액이 응고되지 않도록 모든 시약과 장비를 미리 예열하는 것을 염두에 두는 것이 중요하며 시청해 주셔서 감사합니다.