Name: 소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 배우세요 유방암 세포에서 BB-Cl-amidine 처리를 통한 종양 형성 억제 효과를 소프트 아가 콜로니 형성 분석으로 정량 평가하는 방법입니다. 이 기법은 PADI 효소 억제제의 항암 효능을 검증하는 데 활용됩니다.

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기술적 조언을 제공해 주신 코넬 대학교의 Richard Cerione 박사, Marc Antonyak 박사, Kelly Sullivan과 Olympus CKX41 도립 현미경을 공유해 주신 코넬 대학교의 Gerlinde Van de Walle 박사에게 감사드립니다.

3 % 아가 로스 2- 히드 록시 에틸의 제조 1. <ol><li> 깨끗하고 건조한 100 ml의 유리 병에, 30㎖의 증류수이어서 2- 히드 록시 아가 (아가 로스 VII) 0.9 g을 추가한다. </li><li> 15 초 부드럽게의 혼합물이 소용돌이 전자 레인지. 아가로 오스 분말이 완전히 용해 될 때까지이 단계를 적어도 세 번 이상 반복합니다. </li><li> 15 분 동안 용액을 함유 한 병을 압력솥. </li><li> 아가로 오스 솔루션을 추가로 사용하기 전에 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 실온에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 아래 층의 2. 준비 : 0.6 % 아가 로스 젤 <ol><li> 취급시 피펫에 응고에서 아가로 오스를 방지하기 위해 5 ㎖와 37 ° C 배양기에서 10 ml의 피펫 사전 따뜻한 몇 가지. </li><li> 부분적으로 병 뚜껑 마이크로파 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가로 오스 용액을 느슨하게. 그런 다음, 부드럽게 또 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다. 주의 : 아가 소용돌이 때주의자체 솔루션 용액이 공기에 노출 이상 유출 할 수있을 때까지 상승하기 때문이다. </li><li> 병에 잔류 고체 젤, 몇 초 동안 전자 레인지가있는 경우. </li><li> 조기 고화 아가 용액을 방지하기 위해 다음 단계에서 45 ° C의 물 중탕에서 아가로 오스를 포함하는 용액을 보관 용기. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어. 참고 : MCF10DCIS 미디어는 DMEM / F12, 5 % 말 혈청, 5 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 구성되어 있습니다. </li><li> 전송 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 예열 피펫을 사용하여 3 % 아가 로즈 용액 3 ㎖. </li><li> 즉시 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 12 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합 원뿔 튜브를 반전. 그것은 식민지 나중에 계산을 방해하므로 모든 거품을 형성하지보십시오. </li><li> 부드럽게 기포를 형성하지 않고 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에,이 혼합물을 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 6 웰 배양 판 horizo​​nta을 품어에서야 1 시간 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 혼합물이 응고 할 수 있도록합니다. </li><li> 혼합 응고 후, 30 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 바닥 층을 사용할 준비가 된 것입니다. </li></ol> 셀 함유층 3. 제조 : 0.3 % 아가로 스겔 <ol><li> 를 Trypsinize MCF10DCIS 세포를 4 × 104 / ml의 세포 농도로 희석. </li><li> 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 피펫 및 전송을 사용하여 3 % 아가로 오스의 2 mL를 취하여. </li><li> 즉시 원뿔 튜브에 MCF10DCIS 미디어의 8 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 모든 거품을 형성하지 마십시오. </li><li> (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 MCF10DCIS 세포 (4 × 104 / ㎖) 2 mL를 취하여 BB-CLA로 처리. </li><li> 1 : 1 희석, 0.6 % 아가로 오스와 세포를 섞는다. </li><li> 세포 혼합물을 아가로 1 ㎖를 취하여 부드럽게 6 웰 배양 (P)의 바닥층 상에 추가후반 (2 × 104 세포 / ㎖). </li><li> 상단 층이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 판을 놓습니다. </li><li> 혼합 응고 후, 공급 층을 추가하기 전에 일주일 동안 37 ° C의 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li></ol> 세포층 4. 준비 : 0.3 % 아가 로스 젤 <ol><li> 전자 렌지 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가 용액. 부드럽게 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다. </li><li> 45 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스 솔루션 병 평형. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 MCF10DCIS 미디어를 따뜻하게. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 9 ml의 3 % 아가로 오스 액 1ml를 섞어 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 공기 방울을 형성하지 마십시오. </li><li> BB-CLA와 혼합물 (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 치료. </li><li> 부드럽게에 대한없이 (이 혼합물 1 ㎖를 추가밍 바닥 연질 층을 포함하는 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에) 거품. </li><li> 혼합물이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 플레이트를 놓습니다. </li><li> 피더 층이 굳은 후, 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다. </li><li> 콜로니 형성이 관찰 될 때까지 새로운 매체를 사용하여 세포를 보충하기 위해 기존의 세포층에 0.3 % 아가로 오스 / 중 / 처리 용액 1 ㎖를 중첩하여이 공급 절차 주간를 반복합니다. 주 : 한천 부드럽고 피더 레이어 것은 따라서, 피더 레이어에서 추가 영양분 용이 세포에 도달하는 셀 - 함유 층으로 확산되며, 매우 부드럽고. </li></ol> 5. 데이터 수집 <ol><li> 소프트 한천에 세포 성장 2.5 주 후, 각 웰을 광학 현미경을 사용하여 콜로니 수를 카운트. 정량을 용이하게하기 위해, 투명도에 그리드를 인쇄에 그리드를 부착6 웰 플레이트는 세포가 계산하는 동안 어디에 찾을 수 있도록 도와줍니다. (각 식민지의 직경에 의해 정량화 등) 식민지의 크기가 달라질 수 있기 때문에, 채점되는 식민지 결정하는 기준 식민지 크기를 미리 정의. 예를 들어, 70 μm의 또는 데이터 분석의 큰 콜로니의 크기를 포함한다. </li><li> 더 콜로니 형성과 미래에 대한 계산을 방지하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 이 건조 겔을 방지 파라 필름 6 웰 배양 접시를 밀봉. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
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</ol>

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소프트 한천 콜로니 형성 속도는 세포의 종류에 따라 달라 9. 따라서, 셀의 수는 최적화하고 그에 따라 조정되어야로 시작. 제안 된 초기 범위는 잘 6- 웰 플레이트를 이용하여 당 4~10 X 10월 2일부터 1일까지 X (5) 사이의 세포이다. 또한, 콜로니 크기는 각 셀의 성장 속도에 따라 변화한다. 따라서, 콜로니 크기 소정 컷오프 하류 정량적 분석에 대한 개별 콜로니 주석 필요하다. 여기서, 더 이상 70 μm의 도금은 초기로부터 유도되지 않은 세포 증식의 포함을 피하기 위하여 정량 콜로니. 3D 아가 로스 젤을 할 때 최적 성장을 위해, 그것은 일반적으로 2 차원 세포 배양에 사용되는 동일한 세포 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 종종 매체를 변경하면, 따라서 세포가 새로운 매체에 적응할 수 있도록하기 위해 추가 계대를 필요로, 세포의 성장 속도를 변경하기 때문이다. 예를 들면, MCF10DCIS 세포는...

비형질전환(정상) 세포와 형질전환된 세포 모두 2D 단층 배양에서 쉽게 증식할 수 있습니다. 이러한 형태의 부착 세포 성장은 유사분열 자극이 없을 때 세포가 미세환경 내에서 빠르게 분열하지 않는 생체 내에서 발생하는 것과는 매우 다릅니다. 반면에 부드러운 한천 분석은 반고체 아가로스 겔1 내에서 현탁액에서 증식하고 콜로니를 형성하는 세포의 능력을 측정하여 종양 원성을 정량화하기 때문에 2D 배양 시스템과 구별됩니다. 이 환경에서 형질전환되지 않은 세포는 세포외 기질(ECM)에 고정되지 않은 상태에서 빠르게 증식할 수 없으며 아노이키스(anoikis)로 알려진 과정인 세포사멸(apoptosis)을 겪습니다. 대조적으로, 악성 형질전환(malicious transformation)을 겪은 세포는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)/Akt 및 Rac/Cdc42/PAK와 같은 신호전달 경로의 활성화로 인해 고정 의존성을 잃게 됩니다. 따라서 이러한 세포는 반고체 연질 한천 기질2 내에서 성장하고 군체를 형성할 수 있습니다.
연질 한천 분석의 일반적인 용도는 PADI 억제제와 같은 특정 화합물이 in vitro에서 종양 성장을 억제할 수 있는지 여부를 테스트하는 것입니다. 일반적으로 콜로니 수 또는 콜로니 크기는 세포 종양원성의 차이를 평가하기 위해 대조군과 치료군 간에 비교할 수 있는 분석의 정량적 판독값입니다. 따라서 집락 형성이 약물 농도 증가와 반비례하는 것으로 밝혀지면 해당 약물이 시험관 내 종양 원성의 효과적인 억제제라는 결론을 도출할 수 있습니다. 반면에, 약물이 집락 형성에 영향을 미치지 않는 경우, 약물은 적절한 용량이 아니거나 효과적인 종양 형성 억제제가 아닙니다. 약물의 항종양 효과를 테스트하기 위해 부드러운 한천 분석을 사용하는 것 외에도 이 분석은 특정 유전자와 종양 형성 사이의 관계를 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 종양원성에 대한 PADI2 발현 억제의 효과는 PADI2 특이적 siRNA 처리로 해결할 수 있습니다.
PADI는 칼슘 의존성 효소로, 시트룰린화(citrullination) 또는 탈모방(deimination3-5)으로 알려진 과정에서 양전하를 띤 아르기닌 잔기를 중성하를 띤 시트룰린으로 변환하여 단백질을 번역후 변형합니다. 우리는 최근에 펩티딜라기닌 데이미나제 2 (PADI2)가 새로운 유방암 바이오마커로 기능할 수 있으며, PADI 억제제가 초기 유방암의 후보 치료법임을 발견했다6. 예를 들어, 우리는 이전에 "pan-PADI" 억제제인 Cl-amidine이 2D 단층을 사용하여 유방암 세포의 증식을 억제하고 억제제가 3D 종양 스페로이드의 성장을 억제한다는 것을 입증했습니다6. 이 보고서에서는 이러한 연구를 확장하고, MCF10DCIS유방암 집락의 성장을 억제하는 새로운 PADI 억제제인 BB-CLA의 효능을 테스트함으로써 연질 한천 분석의 유용성을 강조합니다7. 이 실험을 위해 MCF10DCIS 세포를 사용한 이유는 이 세포가 형질전환되지 않은 인간 MCF10A 세포의 발암성 유도체이고 PADI2 단백질8의 높은 정상 상태 수준을 포함하고 있기 때문입니다. 우리는 PADI2 효소 활성이 이 세포주의 종양 형성에 중요한 역할을 하며, PADI2 활성의 BB-CLA 매개 억제가 암 진행을 억제할 것이라는 가설을 세웠습니다.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss 현미경 1021859251</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 기증자 말 혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-하이드록시에틸라가로오스: 유형 VII, 낮은 겔화 온도</td><td>시그마-알드리치</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

생체 내 종양 진행 메커니즘을 조사하는 데 내재된 어려움을 감안할 때, 반고체 매트릭스에서 세포의 증식 능력을 측정하는 연질 한천 집락 형성 분석법(이하 연질 한천 분석법이라고 함)과 같은 세포 기반 분석법은 암 연구의 특징으로 남아 있습니다. 기존 2D 단층 또는 3D 스페로이드 세포 배양 분석에 비해 이 기술의 주요 장점은 3D 세포 환경이 생체 내에서 볼 수 있는 환경과 매우 유사하다는 것입니다. 중요한 것은 연질 한천 분석법이 세포 증식 및 이동에 대한 새로운 화합물 또는 처리 조건의 효과를 엄격하게 테스트할 수 있는 이상적인 도구를 제공한다는 것입니다. 또한 이 분석을 통해 유전적 섭동의 맥락에서 세포 형질전환 가능성의 정량적 평가를 수행할 수 있습니다. 우리는 최근 펩티딜라기닌 데이미나제 2(PADI2)를 잠재적인 유방암 바이오마커 및 치료 표적으로 확인했습니다. 여기에서는 PADI 억제제인 BB-Cl-아미딘(BB-CLAA)이 인간 관 상피내암종(MCF10DCIS) 세포의 종양원성에 미치는 영향을 테스트하여 전임상 항암 연구를 위한 소프트 한천 분석의 유용성을 강조합니다.

소프트 한천 콜로니 형성 분석은 암세포의 종양 유발 문서화 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 반고체 매트릭스 선택적 앵커리지 독립적 인 방식으로 증식 할 수있는 세포의 성장을 선호한다는 것이다. 이 특성은 주로 암세포가 아닌 일반 세포에 의해 발휘된다. 우리는 주로 약물에 의해 종양 성장 억제의 효과를 테스트하고 유방암 세포의 종양 유발에서 과발현 또는 PADI 유전자를 포함하여 우리의 관심 유전자의 고갈의 효과를 테스트하기 위해이 기술을 사용한다. 여기서는 PADI2 MCF10DCIS 과발현 세포의 종양 형성 억제에 BB-CLA의 효과 평가 (도 1 및도 2). 결과는 BB-CLA 크게 MCF10DCIS 세포 유래 콜로니 형성을 억제하는 것을 보여준다.도 3은 도시, 그 PADI 억제제의 존재하에, t<html> DMSO 제어에 비해 모두 여기 콜로니 형성 및 콜로니 크기가 감소했다. ...

여기에서는 펩티딜아르기닌 데이미나제(PADI) 효소 억제제인 BB-Cl-아미딘이 체외 유방암 종양원성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 연질 한천 집락 형성 분석법을 사용하는 방법을 문서화합니다.

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 소프트 아가(soft agar) 분석법을 사용하여 반고체 매질 내에서 세포가 증식하는 능력에 치료가 미치는 영향을 정량적으로 결정하는 것입니다. 증식 능력의 향상은 세포의 종양 형성능(tumor genicity)의 특징이기 때문이며, 종양 형성능은 반고체 AROS 겔 내에서 세포가 콜로니를 형성하는 능력을 통해 측정됩니다. 비형질전환 세포는 이러한 환경에서 빠르게 증식할 수 없으므로, 먼저 0.6% AROS 바닥층을 만들어 반고체 AROS 겔을 구성합니다. 그다음, 바닥층 위에 세포가 포함된 0.3% AROS 겔 층을 추가합니다.본 분석법에서는 실험 세포를 Subramanian 박사가 개발한 peptidyl, arginine, dase 또는 pad 효소 억제제로 처리합니다. 매주 처리 여부에 따라 0.3% agar 겔로 구성된 추가 급이층을 더합니다. 마지막 단계는 분석을 위해 70 µm보다 큰 콜로니의 수를 세는 것입니다.최종적으로, 대조군과 처리군 사이의 콜로니 수 차이를 보여주기 위해 도립 현미경이 사용됩니다. 안녕하세요, 저는 Baker Institute for Animal Health의 Scott Kros 박사 연구실에서 공부하고 있는 대학원생 Achi Huta입니다.코넬 대학교에서, 소프트 타이거 콜로니 형성 분석(soft tiger colony formation assay)은 약물, 호르몬 및 기타 다양한 치료 조건에 대한 민감도와 관련하여 광범위한 암세포의 종양 유전성을 평가하는 것과 같이 암 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 깨끗하고 건조한 100 milliliter 유리 병에 3% two hydroxyethyl aros를 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 0.9 grams의 two hydroxyethyl aros를 넣은 다음, 30 milliliters의 증류수를 추가하십시오.혼합물을 전자레인지로 15초 동안 가열한 후 부드럽게 회전시키십시오. AROS 분말이 완전히 용해될 때까지 이 단계를 반복합니다. 다음으로, 용액이 담긴 병을 15분 동안 오토클레이브로 멸균하십시오.agarose 용액을 실온까지 식힙니다. 다음 단계에 앞서, agarose가 피펫 내부에서 굳는 것을 방지하기 위해 5 mL 및 10 mL 피펫 여러 개를 37 °C 인큐베이터에서 예열하여 사용하십시오. 부분적으로 사용할 때는 병 뚜껑을 느슨하게 열고 미리 준비된 3% 2-HYDROXYETHYL agarose 용액을 전자레인지로 15초 동안 가열합니다.그 후 용액을 가볍게 흔들어 섞고 15초 동안 더 전자레인지로 가열합니다. ARO 용액을 흔들 때 주의하십시오. 공기에 노출되면 용액이 위로 솟아오르며, 병 내부에 잔류 고체 겔이 있을 경우 넘칠 수 있습니다. 다음 단계로 넘어가기 전, ARO 용액이 들어 있는 병을 45 °C 항온수조에 몇 초간 더 유지하여 농축 용액이 조기에 응고되는 것을 방지하십시오.다음으로, Prewarm 피펫을 사용하여 따뜻하게 데워진 배지 12 milliliters를 멸균된 50 milliliter 원심 분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 즉시 3% aros 용액 3 milliliters를 첨가하고 원심 분리 튜브를 부드럽게 뒤집어 aros와 배지를 혼합합니다. 그 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 이 혼합액 2 milliliters를 6-well 배양 플레이트의 각 웰에 천천히 첨가합니다.혼합물이 응고될 수 있도록 6웰 배양 플레이트를 평평한 표면 위에 수평으로 놓고 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 혼합물이 응고되면 플레이트를 37°C 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 이제 하단 층을 사용할 준비가 되었습니다.이 절차에서 까다로운 점은 모든 세포가 균일하게 분산되도록 하는 것과, 액체 agri gel을 첨가하기 전 media 내에서 seltz가 잘 섞이도록 하기 위해 녹은 agra shell이 각 웰에 첨가되기 전까지 응고되지 않게 하는 것입니다. 또한, 취급 중에 용액이 응고되는 것을 방지하기 위해 파이펫을 미리 예열합니다. 세포 포함 층을 준비하려면, 먼저 MCF 10 DCIS 세포를 trypsin 처리한 후 세포 농도가 40,000 cells/mL가 되도록 희석합니다. 그 다음, 예열된 파이펫을 사용하여 media 8 mL를 취해 멸균된 50 mL conical tube로 옮깁니다.원추형 튜브에 3% aros 2 mL를 즉시 첨가하고, 튜브를 부드럽게 뒤집어 aros와 배지를 혼합합니다. 이때 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 세포 2 mL를 취하여 DMSO에 녹인 2 µM BB chloramine으로 처리하거나, 대조군으로 DMSO만을 처리한 후, 세포를 0.6% aros와 1:1 비율로 희석하여 BB chloramine의 최종 농도가 1 µM이 되도록 혼합합니다.그런 다음 세포 aros 혼합물 1 mL를 취해 6-웰 배양 플레이트의 바닥층 위에 조심스럽게 추가합니다. 상층이 응고될 수 있도록 6-웰 배양 플레이트를 4 °C의 평평한 표면에 수평으로 놓고 최소 15분 동안 둡니다. 혼합물이 응고되면, 피딩 층(feeding layer)을 추가하기 전 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 일주일 동안 배양합니다.이전에 수행한 것과 같이 미리 준비된 3% two hydroxyethyl aro 용액을 전자레인지로 가열하고 agro 용액 병을 45 °C 항온수조에서 평형화하여 feeding layer 준비를 시작합니다. 50 mL 원심분리 튜브에 3% agro 용액 1 mL와 따뜻한 배지 9 mL를 혼합한 후, 가볍게 뒤집어 aro와 배지를 섞어줍니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 혼합물을 BB chloramine으로 처리한 후, 하층 및 soft layer가 포함된 6-well 배양 플레이트의 각 well에 혼합물 1 mL를 천천히 첨가합니다.그 다음 6-웰 배양 플레이트를 4°C의 평평한 표면에 수평으로 놓고 최소 15분 동안 두어 혼합물이 응고되도록 합니다. 피더 층이 응고되면 플레이트를 37°C 배양기에 넣습니다. 콜로니 형성이 관찰될 때까지 일주일에 한 번씩 기존 피더 층 위에 1mL의 0.3% agros 배지 처리 용액을 덮어 세포에 새 배지를 보충하는 피딩 과정을 반복하십시오.연한 한천(soft agar)에서 2주 반 동안 세포를 배양한 후, 각 웰의 콜로니 수를 측정합니다. 정량화를 용이하게 하기 위해 광학 현미경을 사용하며, 투명 필름에 그리드를 인쇄하여 6-웰 플레이트에 부착함으로써 계수 시 세포의 위치를 찾는 데 도움을 줍니다. 콜로니 크기는 각 콜로니의 직경으로 정량화하며 크기가 다양할 수 있으므로, 어떤 콜로니를 측정할지 결정하기 위해 기준 콜로니 크기를 미리 정의합니다.예를 들어, 여기서는 70 µm 이상의 콜로니 크기를 데이터 분석에 포함하였습니다. 계수가 끝나면 겔이 건조되는 것을 방지하기 위해 6-well 배양 플레이트를 파라필름으로 밀봉하십시오. 추가적인 콜로니 형성을 막고 추후 계수를 위해 샘플을 4 °C에서 보관하십시오.결과는 pad 억제제가 존재할 때 BB chloramine이 MC 10 DCIS 세포 유래 콜로니 형성을 유의미하게 억제함을 보여줍니다. DMSO 대조군과 비교했을 때 콜로니 형성 수와 콜로니 크기가 모두 감소했습니다. BB chloramine으로 처리한 MCF 10 DCIS 세포의 콜로니 크기는 주로 20에서 100 micrometers 범위 내에 있었습니다.DMSO 대조군의 콜로니 크기는 2.5주간의 배양 후 70에서 150 micrometers의 더 넓은 범위를 보였으며, 70 micrometers보다 큰 콜로니들을 계수하여 분석하였습니다. DMSO 대조군에서는 평균 약 3,500개의 콜로니가 관찰된 반면, BB chloramine 처리군에서는 약 2000개의 콜로니만이 관찰되었습니다. 2.5주간의 연한 배양(soft agriculture) 후, 이는 1 micromolar BB Chloramine 존재 하에서 평균 콜로니 형성이 44% 감소했음을 나타내며, 이는 해당 억제제에 의해 유방암 세포의 종양 형성이 유의미하게 억제되었음을 보여줍니다.이 절차를 수행할 때, 시약을 취급하는 동안 용액이 응고되는 것을 방지하기 위해 모든 시약과 장비를 미리 예열하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

이 비디오는 유방암 종양 원성에 대한 PADI 효소 억제제와 BB-Cl-아미딘의 효과를 시험관내에서 테스트하기 위한 부드러운 한천 집락 형성 분석을 설명합니다. 이 분석은 또한 유전적 교란의 맥락에서 세포 형질전환 가능성의 정량적 평가를 가능하게 합니다.

Soft Agar Colony Formation Assay: 암세포 증식에 대한 새로운 화합물의 효과를 테스트하는 방법

이 비디오는 폐암 세포가 무한정 증식하고 개별 군체를 형성하는 능력을 결정하는 데 도움이 되는 군집 형성 분석에 대해 설명합니다. 항암제가 군집 형성 세포에 미치는 영향은 결과 군체의 수 및/또는 크기의 변화를 분석하여 분석할 수 있습니다.

Colony Formation Assay: Colony Forming Lung Cancer Cells에 대한 항암제의 효능 평가

이 비디오는 항암 화합물 치료에 대한 반응으로 백혈병 세포에 의해 형성된 집락의 수를 식별하고 계산하는 데 도움이 되는 메틸 셀룰로오스 기반 집락 형성 단위 또는 CFU 분석에 대한 프로토콜에 대해 설명합니다.

메틸 셀룰로오스 기반 CFU 분석: 백혈병 세포의 집락 형성에 대한 항암 화합물의 효과를 확인하는 방법

soft 한천 집락 형성 분석은 in vitro에서 세포 앵커리지 독립적 성장을 확인하는 데 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 형질전환된 세포의 종양형성 전위와 형질전환된 세포에 대한 단백질의 종양 억제 효과를 검출하기 위한 엄격한 방법을 설명하는 것입니다.

소프트 한천 콜로니 형성 분석

이 절차는 아스피린-푸마르산염 전구약물의 항-NFκB 및 항암 줄기세포 활성을 합성하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.

NFκB 활동과 유방암 줄기 세포를 금지합니다 합성 및 아스피린 - 푸마 레이트의 전구 약물의 특성

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

시험관내 세포 침습 분석기는 단백질 매트릭스를 함유하는 세포 배양 삽입을 사용하여 침입 및 이동을 위한 세포 전이를 정량화함으로써 암 전이의 잠재력을 측정하는데 사용된다. 세포는 단백질 매트릭스와 다공성 막을 통해, 화학유도제를 향해, 그 때 가벼운 현미경 검사법에 의해 정량화되기 위하여 도전됩니다.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

이 실험 프로토콜은 lncRNA 녹다운과 콜로니 형성 분석법을 결합하여 lncRNA가 골육종 세포 증식에 미치는 영향을 정량화하는 안정적이고 비용 효율적이며 효율적인 방법을 제공합니다.

LncRNA 노크다운 골육종 세포의 증식 능력을 검출하는 콜로니 형성 분석

배우세요 유방암 세포에서 BB-Cl-amidine 처리를 통한 종양 형성 억제 효과를 소프트 아가 콜로니 형성 분석으로 정량 평가하는 방법입니다. 이 기법은 PADI 효소 억제제의 항암 효능을 검증하는 데 활용됩니다.

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

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