Name: 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 배우세요 복부 해마-누클레우스 어큼벤스 회로의 유전자 키메라 체외 배양법을 통해 니코틴 수용체 매개 칼슘 신호와 신경전달물질 방출을 실시간 라이브 이미징으로 분석하는 방법을. 이 기술은 시냅스 가소성의 전후 시냅스 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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기술 지원에 대해 Yehui Qin과 Mallory Myers에게 감사드립니다. 또한 항-α4-ECD 항체를 제공해 주신 Sigismund Huck 박사님께도 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 NS22061 L. W. R.의 지원을 받습니다.

모든 동물 실험 (2012 개정, NIH 간행물 번호 80-23) 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행되었고, 연구 기관 동물 관리의 승인을 스토니에 연구위원회에 사용되었다 브룩 대학 (# 1618과 # 1792). 1. vHipp-NACC 시냅틱 공동 문화 <ol><li> 희생 마우스 (출생 후의 일 0 - 야생형 (WT) 또는 α7 nAChRs 유전자 변형 마우스 라인 3) CO 2. 각각의 강아지 목을 벨 및 사후 사실상의 유전자형에 대한 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 꼬리를 저장합니다. 멸균 후드에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 전체 뇌를 노출 가위와 집게로 두개골의 상단을 제거합니다. 서로 꼬리 쪽의 대뇌 피질 부분은, 해부 현미경 vHipp 5,21 등 후방 피질을 포함하는 코로나 섹션을 얻을 시점에서 시작. </li><li> V를 해부하다개발 마우스 뇌 아틀라스 (22) (그림 1A)에 따라 CA1-subiculum 지역을 포함 HIPP 조직을 제거합니다. 추운 문화 미디어 (4 ° C의)를 포함하는 35mm 배양 접시로 전송, 작은 얇은 조각 (μm의 약 100 × 100 μm의 microslices)으로 잘라. </li><li> 37 ° C의 배양기에서 적어도 30 분 동안 배지 (~ 500 μL)를 24 웰 조직 배양 플레이트 내부 12mm 폴리 D 라이신 / 라미닌 - 코팅 유리 커버 슬립을 사전 부화. microslices 도금하기 전에 용지를 제거합니다. </li><li> (microslices의 ~ 20 개 함유 ~ 50 μL) 미디어의 최소량과 커버 슬립의 중심에서 화재 연마 파스퇴르 피펫 접시는 이식편의 부착을 용이하게한다. 하나의 동물에서 발생하는 플레이트 vHipp의 microslices (중 + / + 또는 - / - 유전자 변형 α7 라인의 유전자형) 각 coverslip에에. </li><li> 외식은 커버 슬립에 정착 한 후, 부드럽게 일까지 추가 미디어 (~ 100 μL)를 추가E 벽되도록 매체의 레벨은 아니지만 그 커버 슬립의 중앙에서 완전히 둘레에 이식편을 커버하기에 충분히 높다. </li><li> 37 ° C에서 O / N 배양 한 후, 5 % CO 2 배양기, 출생 후 1 일 (WT) 쥐에 배아 일 18 NACC 신경을 분산하고 외식에 추가 할 수 있습니다. <ol><li> 개발 마우스 뇌 아틀라스 (20) (그림 1B)에 따라 NACC 조직을 해부하다. </li><li> 15 ML 튜브 및 전송 (500 500 μm의 microslices × μm의 주위에) 작은 조각으로 잘라. </li><li> 37 ° C에서 15 분 동안 0.25 % 트립신 (2 ㎖)로 처리. 워시 조직 덩어리를 차가운 세척 미디어 3 회 (5 ㎖, 4 ° C의) 차가운 문화 매체에서 한 세척 한 다음 (5 ㎖, 4 ℃). 서스펜션은 각 세척 단계에서 5 분간 휴식 한 다음 조심스럽게 상층 액을 부어하도록 허용합니다. </li><li> 가볍게 화재 광택 파스퇴르 피펫으로 배양 배지 2 ㎖ 부드러운 분쇄하여 세포를 떼어 놓다. </li><li> 트랜스5 분 동안 2,000 X rpm에서 또 다른 15 ML 튜브와 원심 분리기에 FER 세포 현탁액. 상층 액을 제거하고 6 새끼 당 1 ml의에서 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 부드럽게 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 언론에 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산. </li><li> vHipp 외식 각 coverslip에에 분산 NACC 세포의 0.25 ML을 추가합니다. </li><li> 가습 37 ° C의에서 문화를 유지, 5 % CO 2 배양기. 기계적으로 시냅스 형성을 촉진, 안정 및 습도를 유지하기 위해 적신 멸균 거즈 패드에 문화 판을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 세포 화학 <ol><li> 문화 수정 - 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당 (5 체외에서 7 일) / PBS (~ coverslip에 500 μL, 20 분, RT). </li><li> 0.25 % 트리톤 X-100 / PBS와 Permeabilize 하시려면 배양 (~ 커버 슬립 당 ​​500 μL, 5 분, RT). </li><li> PBS 10 % 정상 당나귀 혈청 블록 문화 (~ coverslip에 500 μL, 30 분, RT) antibod 이전Y 염색. 4 ° C에서 O / N 일차 항체에 품어. 안티 포성 글루타메이트 트랜스 포터 1 (1 : 250), 안티 GAD65 (1 : 100); 안티 nAChRs (항 α 5 소단위, 1 500 500 α 4 -ECD 1) 다음과 같은 일차 항체를 사용합니다. </li><li> (coverslip에 3 회 / ~ 500 μL, 5 분) PBS로 일차 항체를 세척 한 후 (~ coverslip에 500 μL, 1 : 500) 알렉사 488에 복합 이차 항체에 문화를 품어 또는 커버 슬립 당 ​​알렉사 594 (~ 500 μl를 1 : 37 ℃에서 1 시간 동안 500). </li><li> 이전 라벨 표면 α7 * nAChRs에 대한 고정 37 ° C에서 45 분 (문화 미디어에서 1,000 ~ coverslip에 500 μL, 1) 알렉사 594에 결합 αBgTx의 문화를 품어. </li><li> 마운트 및 밀봉 된 커버. </li><li> 플랜-고차 색지움 목표 (0.8 NA 1.4 또는 NA와 오일 63X 20X)을 구비 한 형광 현미경과 CCD 카메라로 이미지를 캡처. </li></ol> 3. FM1 -​​ 43 기반 소낭 퓨전 <ol><li> , 영상 실 - (체외에서 7 일 5) 디스크 공 초점 현미경을 회전에 챔버를 탑재 문화를 유지한다. 지속적으로 실온에서 HBS 칵테일 (1 ml / 분)를 관류. </li><li> 90 초 동안 56 mM의 K + ACSF (~ 500 μL) (염색)에 10 μm의 FM1 - 43와 관류 및로드 문화를 중지, 칼슘 ADVASEP-7 (0.1 mm)를 포함하는 무료 HBS로 15 분 거리에 외부 염료를 씻어 막 결합 FM1 -​​ 43을 청소할 수 있습니다. </li><li> 120 초 동안 FM1 - 43없이 56 mM의 K + ACSF (~ 500 μL) (탈색)과 문화를 자극 같은 조건을 사용하여 FM1 - 43와 문화를 다시로드, 및 CA 다시 포함 2+ 무료 HBS 씻어 ADVASEP-7 15 분. </li><li> CCD 카메라와 계획 - 고차 색지움 목표 (1.4 NA와 60X 물, 여기 488 nm의, 방출 53​​0 ㎚)과 캡처 이미지를 갖춘 회전 디스크 공 초점 현미경으로 FM1 -​​ 43 형광 이미지를 획득. </li><li> 1 분 기준 FM1 -​​ 43 형광 이미지 (매 2의 수집) 사전 니코틴 제어와 같은; 1 분 동안 빠른 관류 (2 ml / 분)에 의해 니코틴 (1 μM)를 적용하고 밖으로 HBS 칵테일 니코틴을 씻어. 5 분 동안 매 2 초 동안, 니코틴 신청 후, 전에 캡처 시간 경과 이미지를 유지합니다. </li><li> 전에 FM1 - 43 형광 강도 (F 염색)과 후 (F의 탈색) 각 시냅스의 부통에서 니코틴 응용 프로그램을 정량화. </li><li> 이전과 니코틴 응용 프로그램 (ΔF = F 염색 -F의 탈색) 후 FM1 - 43 형광 강도의 차이를 정량화하여 vHipp 축삭을 따라 해제 FM1 - 43 형광의 총량을 계산합니다. 다음 식에 니코틴 후 형광 강도 저하의 비율을 분석 : F 감소 % = ΔF / F 염색. </li></ol> 4. 칼슘 이미징 <ol><li> 다음 (5 μm의 FLUO-4 칼슘 2 + 지표와 문화를로드, 정상 HBS 빠르게 - (체외에서 7 일 5) 문화를 씻어AM 에스테르) 및 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 HBS 0.02 % 플루로 닉 F-127 (2 mL)을 첨가 하였다. </li><li> (3 회 / 5 분) HBS와 FLUO-4 솔루션을 세척 할 것. (37 ° C / 5 % CO 2) 적어도 30 분 동안 인큐베이터 문화를 돌려줍니다. </li><li> 동일한 촬상 실과 FM1 -​​ 43 기반 소포 융합 절에서 설명한 바와 같이 동일한 조건으로 배양 물을 유지한다 (단계 3.1 참조). </li><li> 계획 - 고차 색지움 목표 (1.4 NA와 60X 물, 여기 488 nm의, 방출 53​​0 ㎚)와 CCD 카메라와 vHipp 마이크로 조각에서 축삭 돌기의 FLUO-4 형광 이미지를 수집합니다. </li><li> 1 분 동안 빠른 관류 (2 ml / 분)에 의해 니코틴 (1 μM)를 적용, 사전 니코틴 컨트롤로 기준 FLUO-4 형광 이미지 (2 분마다 10 초)을 수집 한 다음 밖으로 HBS 칵테일 니코틴을 씻어. 30 분마다 10 초 동안, 니코틴 신청 후, 전에 캡처 시간 경과 이미지를 유지합니다. </li><li> 일련의 원시 FLUO-4 형광 이미지, 수출의 모든 프레임을 저장추가 분석을 위해 TIFF 포맷 이미지. </li><li> 전에 vHipp 축삭을 따라 니코틴 신청 후 FLUO-4 형광의 통합 강도를 수집합니다. </li><li> 하기 식으로 통합 된 형광 강도를 정규화한다 ΔF / F = 0 (FF 0) / F 0 배경 보정 전 니코틴 집적 형광 강도이며, F는 각각의 시점에서 vHipp 축삭을 따라 집적 형광 강도 F 0, 니코틴 신청 후. 분석하고 정규화 집적 형광 강도를 플롯. </li></ol>

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공동 배양 제제는 기재된 재 저항하는 것을 시험 관내 복부 해마-중격 의지 회로. 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 변속기 (5), (21)를 강화 유도하는 공간 및 시간 프로파일이 제조 허가 비교적 간단하고 신뢰성 시험. 공동 배양 생체 -like 함수를 보여주는 시험 관내에서 생리적 조건을 제공 할 수있는 하나의 접시에 다른 특정 세포 유형의 증식으로 정의된다. 기존의 신경 세포 신경 세포의 공동 문화는 서로 다른 종류의 세포 사이의 시냅스 상호 작용 연구를위한 신경 과학 연구에 도입되었다. 그러나, 이러한 사전 및 공동 배양에서 시냅스 후 사이트를 식별하기 어렵다. 이 microslice - 해리 신경 공동 문화 프로토콜은 사전 시냅스 축삭 및 사후 시냅스 목표를 쉽게 인식 할 수 있습니다. 다른 뇌 영역에서 사용 microslices O다른 형광 단백질을 발현하는 형질 전...

회로 흥분성의 콜린성 변조인지의 기본적인 양태에 기여하고, 변경된 콜린성 변조는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 정신 분열증 및 중독 1-4 포함한 신경 퇴행성 질환 및 신경 기능이다. 중추 신경계의 시냅스 전달의 콜린성 촉진의 설립 메커니즘은 사전 시냅스 사이트에서 번역 된 nAChRs 직접 활성화를 통해입니다. 간접적으로 특정 nAChR을 서브 타입, 그리고 상대적으로 높은 칼슘 전도에 직접적으로 인해를 통해 세포 내 신호 폭포 -이 사전 시냅스 수용체의 활성화는 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 전 시냅스 터미널의 증가에 이르게 5함으로써 신경 전달 물질 방출을 향상. 실제로, 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 신경 전달 물질을 포함한 다양한, GABA, 아세틸 콜린의 방출의 변화와 연관되어있다차 도파민 6-10. 이 프로세스는 다양한 간접적 시냅스 전기 생리 학적 방법을 이용하여 검토했지만, 광학 기자 [CA는 2+] i 및 시냅스 소포 재활용 프리 시냅스 현상의 직접적인 시간적으로 정확한 측정을 허용한다. nAChRs의 사전 시냅스 현지화는 전자 현미경 (EM) 레벨 11, 12에 nAChRs 직접 면역 금 표지와 함께 설득력있게 입증되었다. 다른 여러 기술들은 배양 된 신경 세포 (13, 14)에 nAChRs subunit- 형광 단백질 키메라의 위치를 검출 포함한 간접적 nAChR을 현지화를 해결하기 위해 사용되고, 시냅스 말단 (15, 16)에 nAChR을 전류의 전기 생리 학적 기록 [캘리포니아 니코틴 유도 변화를 모니터링 에 의해 시냅스 터미널에서 라이브 세포 이미징 (17), 및 신경 전달 물질 방출의 간접적 인 모니터링에 의한 시냅스 신경 터미널에서 2 +] I스티 릴 양친 매성 FM 염료 (FM1 -​​ 43와 FM4-64) 및 / 또는 synapto-pHluorin에 의해 및 글루타메이트에 대한 아세틸 콜린과 iGluSnFr에 대한 CNiFERs 같은 특정 형광 신경 전달 물질 기자, 볼 시냅스 소포의 세포 외 유출을 포함 형광 지표와 라​​이브 세포 이미징 기법, 18 ~ 20. 전반적으로, nAChRs의 사전 시냅스 현지화를 식별이 현재의 접근 방법이 복잡하고, 신뢰할 수있는 식별 및 사전 시냅스 활동의 생리 학적 모니터링을 할 수 있도록 특별한 시스템과 기술을 필요로한다. 확인하고 시냅스 전달의 사전 및 사후 시냅스 구성 요소를 모두 분석에 직접 액세스를 제공합니다 핵 중격 의지 (NACC) 회로 - 여기서 우리는 복부 해마 (vHipp)의 체외 공동 문화 시스템에 대한 프로토콜 및 장비에 대해 설명합니다. 우리는 전 시냅스 nAChRs의 현지화 및 칼슘 신호와 신경 전달 물질 방출 ALO 매개 nAChR을의 라이브 세포 이미징의 예를 보여NG vHipp 축삭. 여기에 제시된 프로토콜 천연 (및 간단한) 확장은 다른 유전자형으로부터 뉴런 구성된 전후 시냅스 접촉의 제조이다. 이러한 방식으로 변조 전 및 / 또는 후 - 시냅스 메커니즘 특정 유전자 산물의 기여는 직접 평가할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. 배양 배지 (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. 세척 매체 (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>헤페스 (1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. HEPES 완충 식염수&nbsp; (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 밀리미터미터</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 밀리미터미터</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 밀리엠</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>시그마</td><td>C1016&nbsp;</td><td>2 밀리엠</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td colspan="4">4. 라이브 이미징을 위한 HBS 칵테일 pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 밀리미터미터</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 밀리미터미터</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 밀리엠</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>시그마</td><td>C1016&nbsp;</td><td>2 밀리엠</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td>테트로도톡신&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &마이크로; M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &마이크로; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 &마이크로; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 &마이크로; M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209 10</td><td>&마이크로; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. 칼슘 프리&nbsp; 에이브지&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 밀리미터미터</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 밀리미터미터</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 밀리엠</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM 칼륨 ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>시그마</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>시그마</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr></tbody></table>

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

시냅스 전 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs)의 활성화에 의한 축삭 신호의 지속적인 향상 및 신경전달물질 방출 증가는 아세틸콜린(ACh)에 의한 신경조절의 중요한 메커니즘입니다. 온전한 축삭돌기 내부와 신경 말단의 신호 전달 메커니즘을 시험관 내에서나 생체 내에서나 조사하는 데 어려움이 있기 때문에 시냅스 가소성의 시냅스 전 구성 요소에 대한 연구의 진전이 제한적이었습니다. 여기에서는 시냅스 전후 뉴런의 유전적 프로필을 선택적으로 변화시키면서 전달의 시냅스 전후 구성 요소를 모두 분석하기 위해 직접 실시간 이미징을 허용하는 체외 복부 해마(vHipp)-측좌(nAcc) 회로의 유전자 키메라 제제를 소개합니다. 우리는 vHipp 마이크로슬라이스의 돌기가 시냅스 전 축삭 입력으로서 nAcc에서 분산된 뉴런인 시냅스 후 표적과 함께 여러 개의 신뢰할 수 있는 글루타메이터 시냅스를 형성한다는 것을 보여줍니다. nAChR의 다양한 아형의 시냅스 전 국소화가 감지되고 동시 전기생리학적 기록 및 라이브 셀 이미징에 의해 시냅스 전 니코틴 신호 매개 시냅스 전달이 모니터링됩니다. 이 제제는 또한 in vitro에서 글루타메이터 시냅스 가소성의 시냅스 전후 메커니즘을 연구하기 위한 유익한 접근 방식을 제공합니다.

사용 준비는 체외에서 vHipp-NACC 회로의 유전자 키메라 공동 문화로 구성되어 있습니다. vHipp의 microslices에서 냄새가 나는데 계획은 사전 시냅스 축삭 입력으로, 후 시냅스 대상, NACC에서 분산 된 뉴런과 시냅스 연락처를 만들 수 있습니다. vHipp에 의해 신경 지배 NACC 신경 세포에서 글루타메이트 전송의 지속 (≥ 30 분) 촉진을 유도 니코틴은 사전 시냅스 α7 * nAChRs 통해 vHipp 축삭 (5)에 따라 신호 (21)와 연장 칼슘을 축삭. 그림 1은 vHipp 마이크로 조각에서 돌기 (vGluT1 긍정적) 글루타메이트하고 있음을 직접 보여 연락처가 NACC에서 분산 된 GABA 성 중간 가시 신경 세포로 만든 것을 (GAD 긍정적, 그림 1C, D). (α4 및 α5 서브 유닛 포함) α7 *와 비 α7 모두 * nACh...

우리는 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs) 매개 시냅스 전달의 시냅스 전 메커니즘을 분석하기 위해 직접 라이브 이미징을 허용하는 복부 해마 – 측좌 회로의 유전자 키메라 제제를 in vitro에서 개발했습니다. 이 제제는 또한 시냅스 가소성의 시냅스 전후 메커니즘을 연구하기 위한 유익한 접근 방식을 제공합니다.

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

본 실험 과정의 전반적인 목표는 시냅스 전달의 시냅스 전 및 후 성분을 모두 식별하고 분석하기 위해 직접적인 생체 이미징이 가능한 복측 해마-측좌핵 회로의 유전자 키메라 표본을 in vitro에서 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 CA1 CIC 영역을 포함하는 복측 해마 조직 스트립을 분리합니다. 두 번째 단계로, 복측 해마 스트립을 작고 얇은 절편으로 자른 후, 이 마이크로 절편들을 24웰 조직 배양 플레이트 내 커버슬립 중앙에 배치하여 하룻밤 동안 배양합니다.다음으로, 뇌 조직에서 nucleus accumbens를 분리합니다. 마지막 단계로, trypsin을 사용하여 nucleus accumbens 조각들을 개별 뉴런으로 분리한 후, ventral hippocampal 이식물이 도말된 커버슬립에 nucleus accumbens 뉴런을 추가하고 5~7일 동안 배양합니다. 최종적으로, nicotinic acetylcholine receptor의 시냅스 전 국소화와 nicotinic acetylcholine receptor 매개 칼슘 신호 전달 및 신경전달물질 방출을 확인합니다.복측 해마 축삭은 스피닝 디스크 공초점 살아있는 세포 이미징을 통해 식별하고 모니터링할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마이크로 슬라이스 해리 뉴런 공동 배양 준비물을 통해 이들의 시냅스 전 축삭과 시냅스 후 표적을 쉽게 인식할 수 있다는 점입니다. 인비트로(In vitro) 공동 배양 준비물은 복측 해마에서 전전두엽 피질로 이어지는 회로를 인비트로로 재현합니다.이를 통해 시냅스 전 및 후 구획 중 하나 또는 둘 모두를 직접 실시간으로 이미징할 수 있습니다. 이러한 in vitro 시냅스 표본 제작법은 시냅스 전 수용체의 활성화가 글루타메이트성 시냅스 전달에 미치는 공간적 및 시간적 영향에 대한 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 결과적으로, 조직 수집 전에 글루타메이트성 시냅스 가소성에 기여하는 시냅스 전 및 후 메커니즘 모두에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.24-웰 조직 배양 플레이트 내의 12 mm poly-D-lysine 코팅 유리 커버슬립을 500 µL의 배양액과 함께 37 °C에서 최소 30분 동안 사전 배양합니다. 그 후, 배양을 위한 조직 수집용 마이크로 슬라이스를 플레이팅하기 전에 배양액을 제거합니다. 해부 현미경 하에서 희생된 각 새끼 쥐의 두개골 상단을 제거하여 뇌 전체를 노출시킵니다.대뇌 피질이 서로 갈라지는 지점에서 시작하여, 복측 해마(ventral hippocampal)를 포함한 후방 피질이 포함된 관상면 절편을 얻습니다. 다음으로, CA1 영역을 포함하는 복측 해마 조직을 절제합니다. 그 후, 조직을 차가운 배지가 담긴 35mm 배양 접시로 옮깁니다.이어서 조직을 작은 얇은 조각으로 더 세밀하게 자릅니다. 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 조각들을 커버의 중앙에 배치합니다. 외식물(explants)의 부착을 돕기 위해 50 µL의 배지를 가합니다.그 다음, 복측 해마 마이크로 슬라이스를 커버슬립 위에 플레이트합니다. X explants가 커버슬립 위에 안착되면, 배지의 높이가 주변부의 explant를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분해지도록 벽면을 따라 추가 배지 100 µL를 조심스럽게 첨가하되, 커버슬립 중앙에 있는 것들은 덮이지 않게 합니다. 그런 다음, nucleus accumbens 뉴런을 분산시키기 전, 5% CO₂ 조건의 37 °C에서 explant를 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 배아 18일에서 출생 후 1일까지의 wild type 마우스로부터 nucleus accumbens 조직을 얻어 작은 조각으로 자른 후, 15 mL 튜브로 옮깁니다.조직을 0.25% trypsin 2 mL로 37°C에서 15분 동안 처리합니다. 이어서, 4°C의 세척액 5 mL로 조직을 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 현탁액을 5분 동안 방치합니다. 그 후 4°C의 배양액 5 mL로 조직을 세척합니다.다음으로, 가볍게 화염 멸균한 파스퇴르 피펫을 사용하여 2 mL의 배지에서 세포를 부드럽게 파이펫팅하여 해리합니다. 그 후, 세포 현탁액을 다른 15 mL 튜브로 옮기고 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 5분 후, 상층액을 제거하고 펍(pup)당 1 mL의 배지로 세포를 재현탁한 다음, 화염 멸균한 파스퇴르 피펫으로 배지를 여러 번 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 분산시킵니다.마지막으로, 분산된 핵 주위 세포 25 milliliters를 복측 해마 절편이 있는 각 커버슬립에 첨가합니다. 시냅스 형성을 촉진하기 위해 배양 플레이트를 젖은 멸균 거즈 패드 위에 올려 기계적으로 안정화하고 습도를 유지합니다. 그 후 플레이트를 5%CO2, 37 degrees Celsius 조건에서 배양합니다.본 절차에서는 배양물을 하나씩 이미징 챔버로 옮깁니다. 챔버를 회전 원판 공초점 현미경(spinning disc confocal microscope)에 장착하십시오. 상온에서 1 mL/min의 속도로 HBS 칵테일을 사용하여 샘플에 계속 관류합니다.다음으로, 관류를 중단하고 56 mM potassium A CSF 내의 10 µM FM 1 43으로 배양물을 90초 동안 염색합니다. 그런 다음 0.1 mM ADVASEP 7이 포함된 칼슘 제거 HBS로 15분 동안 세척하여 외부 염료를 제거합니다. 그 후, FM 1 43이 없는 56 mM potassium A CSF를 사용하여 120초 동안 배양물의 자극을 해제합니다.염색 제거를 위해. 동일한 조건에서 FM 1 43으로 배양액을 다시 채우고, A-D-V-A-S-E-P seven이 포함된 칼슘 제거 HBS로 15분 동안 다시 세척합니다. 이제 평면 아포크로매틱 대물렌즈가 장착된 스피닝 디스크 공초점 현미경으로 FM 1 43 형광 이미지를 획득하고 CCD 카메라로 이미지를 캡처합니다.니코틴 처리 전 대조군으로서 2초마다 1분 동안 기저 상태의 FM 1 43 형광 이미지를 수집하십시오. 그다음 2 mL/min의 속도로 빠르게 관류하여 1 µM의 니코틴을 1분 동안 처리한 후, HBS 칵테일로 니코틴을 세척하십시오. 니코틴 처리 전, 처리 중, 그리고 처리 후 5분 동안 2초마다 타임랩스 이미지를 계속 캡처하십시오.이 단계에서는 배양물을 일반 HBS로 빠르게 헹굽니다. 그런 다음 5 µM Fluo-4 칼슘 지시제와 0.02% ONIC F127이 포함된 HBS 2 mL를 배양물에 넣고 37 °C, 5% CO2 조건에서 30분 동안 반응시킵니다. 그 후, HBS를 사용하여 Fluo-4 용액을 3회 세척하며, 각 세척 시간은 5분으로 합니다.배양물을 인큐베이터에 넣고 최소 30분 동안 유지합니다. 그 후, 배양물을 하나씩 이미징 챔버로 옮깁니다. FM 1-43 기반 소포 융합 절차에서 설명한 것과 동일한 조건 하에 진행합니다.니코틴 처리 전 대조군으로서 배측 해마 마이크로 슬라이스 내 축삭 돌기의 기저 flu oh four 형광 이미지를 수집합니다. 다음으로, 2 mL/min의 속도로 1분 동안 1 µM의 니코틴을 급속 관류시킨 후, HBS 칵테일로 니코틴을 세척합니다. 니코틴 처리 전, 처리 중 및 처리 후 30분 동안 10초 간격으로 타임랩스 이미지를 지속적으로 캡처합니다.이 그림은 복측 해마 미세 절편의 투사 경로가 글루탐산성(glutamatergic)이며, 이들의 접점이 분산된 GABA성 신경세포와 형성된다는 것을 직접적으로 보여줍니다. nucleus accumbens의 중형 가시 신경세포(medium spiny neurons)에서, alpha seven 및 non alpha seven 니코틴성 아세틸콜린 수용체가 복측 해마 축삭을 따라, 특히 복측 해마 투사 경로가 nucleus accumbens 신경세포와 접촉하는 부위에서 발견되었습니다. nucleus accumbens의 분산된 신경세포들은 alpha seven 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 발현하지 않는다는 점에 유의해야 하며, 이는 접점의 수용체 클러스터가 엄격하게 시냅스 전(presynaptic) 단계임을 의미합니다.복측 해마 축삭을 따라 나타나는 Fluo-4 칼슘 형광의 타임랩스 이미지는 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 60배 수침 대물렌즈로 30분 동안 10초 간격으로 획득하였습니다. 획득한 이미지는 의색(pseudocolor) 척도로 표시되었으며, 초당 2프레임의 속도로 비디오로 재생되었습니다. 이 비디오는 니코틴 적용이 살아있는 야생형 복측 해마 축삭을 따라 지속적인 Fluo-4 칼슘 형광 활성을 유도함을 보여줍니다.이 절차를 수행할 때, 복측 해마 마이크로조직을 최소량의 배지에 플레이팅하고 배양 플레이트를 습윤한 스테레오 성장 패드 위에 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 단계는 마이크로조직의 부착, 돌기 성장 및 시냅스 형성에 매우 중요합니다. 따라서 이 공동 배양법을 통해 시냅스 전 입력 뉴런의 유전형을 시냅스 후 표적 뉴런과 별개로 달리할 수 있습니다.또한, 이는 두 구획에서 외래 유전자를 각각 독립적으로 선택적 발현시키는 것을 가능하게 합니다. 이는 시냅스 가소성의 시냅스 전 메커니즘과 시냅스 후 메커니즘을 분석하는 데 매우 유용한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 복측 해마에서 측좌핵으로 이어지는 회로를 재현하는 유전자 키메라 시냅스 공동 배양물을 생성하는 방법을 이해하게 될 것입니다.그 후 라이브 이미징 기술을 사용하여 시냅스 전 및 후 뉴런을 모두 분석할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 더 나은 접근 장물과 스펙트럼을 사용하여 수용체의 형광 단백질 태그를 포함한 접근 방법의 조합을 사용하여 니코틴 중독의 메커니즘을 이해하기 위해 CNS의 뉴런의 특정 subtypes의 subcellular 지역 내에서 nicotinic 아세틸콜린 수용체 변화를 quantifying의 소설 기법을 개발했습니다 공촛점 이미징.

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

이 비디오는 공동 배양을 위해 쥐의 뇌에서 복부 해마 및 측좌핵 조직을 준비하는 과정을 보여줍니다. 뉴런은 돌기를 확장하여 복부 해마와 측좌핵 조직 사이에 시냅스 연결을 형성합니다. 이 방법을 사용하면 이 두 뇌 영역 간의 신경 상호 작용을 연구하여 인지, 행동 및 신경 장애에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Ventral Hippocampal 및 Nucleus Accumbens의 공동 배양

이 비디오는 마우스의 복부 해마에서 니코틴 성 아세틸콜린 수용체의 니코틴 매개 활성화가 축삭을 따라 지속적인 칼슘 신호를 어떻게 초래하는지 보여줍니다.

시냅스 공동 배양에서 배쪽 해마 축삭을 따라 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 이미징

출처: Bancroft, E. A., et al. 1차 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적 Ca2+ 플럭스와 그 하류 효과를 정량화합니다. J. Vis. Exp. (2020){{TAG_ 46}}이 비디오는 마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 지표(calcium indicator)를 발현하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 컨포칼 현미경으로 뉴런을 이미지화하여 자발적 및 신경전달물질에 의한 칼슘 활동 중 형광 강도의 변화를 추적합니다.

마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입 시각화(Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons derived from Mouse Embryos)

출처: Lark, A. R., et. al., 생물 발광 칼슘 지표 GFP-aequorin을 기반으로 한 생체 내 기능적 뇌 이미징 접근 방식. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 Green을 사용한 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다. 초파리 심부 뇌 구조에서의 형광 단백질-aequorin 생물 발광.

초파리 뇌 구조에서 칼슘 과도 현상을 연구하기 위한 생물 발광 이미징

이 문서는 니코틴 uncaging에 의해 마우스 뇌 조각에서 nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (nAChRs) 공부에 대 한 메서드를 제공 합니다. 동시 패치 클램프 기록 및 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법으로 사용할 경우 해 신경 생물학의 깊은 이해를 제공 하는 세포 형태학 nicotinic 수용 체 기능을 연결 니코틴 uncaging 합니다.

Photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 Photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 Nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

배우세요 복부 해마-누클레우스 어큼벤스 회로의 유전자 키메라 체외 배양법을 통해 니코틴 수용체 매개 칼슘 신호와 신경전달물질 방출을 실시간 라이브 이미징으로 분석하는 방법을. 이 기술은 시냅스 가소성의 전후 시냅스 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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