Name: 쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 쥐 복막 대식세포 분리법으로 TLR 자극 후 유전자 발현 분석을 수행하는 방법을. 면역학 및 대식세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 (NSERC, 더 298515-2011을 부여하지 않음). AL은 박사 학위를받는 사람입니다 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 MS에서 장학금 (, 아니 부여합니다. MOP123246 CIHR) 건강 연구의 캐나다 연구소에서 교부금에서 지원되었다.

모든 절차는 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 몬트리올 대학교의 기관 동물 관리위원회 (CRCHUM)의 승인 후 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 따라 수행 하였다. 1. 격리, 식별, 문화 쥐 복막 대 식세포의 <ol><li> 3.8 %의 맥주 티오 글리콜 레이트 매체를 준비합니다. 이렇게 증류수 1,000 mL에 티오 글리콜 레이트 배지 38g을 일시 중단합니다. 완전히 매체를 용해 끓여 솔루션을 가져와. 15 분 동안 121 ° C 오토 클레이브에 의해 멸균. RT 18, 어둠 3 개월까지 보관합니다. 참고 : 탁도가 세균 오염을 나타내는 개발하는 경우 폐기하십시오. 무균 유지 경우 용액을 어둠에서 1 년 동안 유지 될 수있다. </li><li> 각각의 양해 각서 (MOU)의 복강에 3.8 % 브루 티오 글리콜 레이트 배지 1 ㎖를 주입, 23 G 바늘에 부착 된 1 ml를 주사기를 사용하여SE는 3 일 기다려. 각 마우스의 새로운 주사기와 바늘을 사용합니다. </li><li> 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사하여 마우스를 마취하고 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 호흡을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 일반적으로 빠른 호흡은 마우스가 깊이 마취되어 있지 않음을 나타냅니다. </li><li> 70 % 에탄올로 각 마우스의 복부를 씻으십시오. 가위를 사용하여, 복막의 하부 중앙선을 따라 횡 절개를 수행한다. </li><li> 집게를 사용하여 투명 복막 피부를 노출 복부 피부를 뒤로 당겨. 20 G 주사 바늘에 연결된 5 ㎖ 주사기를 사용하여, 각각의 마우스의 복강 내로 감기 DPBS 5 ㎖를 주입. </li><li> 복강에 부드러운 마사지를 수행하고있는 기관을 천공하지 않고 신중하게 유체를 대기음. 바늘을 제거하고 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브로 복강 액을 분배. </li><li> 냉장 원심 분리기 400 XG에 10 분 동안 원심 분리기.세포는 전체 과정 동안 차가운 유지한다. RPMI 배지 1640 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계수하고 1 × 106 세포 / ml의 세포 밀도로 조정한다. </li><li> F4 / 80과 antibodie 대해 마우스 당 1 × 106 세포를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 분리 된 세포의 표현형을 특성화 (표면 항원은 대 식세포에서 발현). </li></ol> 2. 세포 치료 <ol><li> 직접, 차단 후, 각 웰에 1 × 10 6 세포를 추가합니다. 37 ℃에서 1 시간 2 그들을 배양하여 6 웰 플레이트에 부착 쥐의 복강 대 식세포를 남겨주세요. 부드럽게 따뜻한 PBS로 3 회 세척하여 비 부착 세포를 제거합니다. </li><li> 이어서, 900 μL의 무 혈청 DMEM에서 배양 세포 다음 TLR 리간드의 존재하에 24 시간 동안 : (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 ㎎ / ㎖), 폴리 (I : C) -TLR3 (10 ㎎ / ㎖) ; LPS-TLR4 (100 NG / ㎖), 편모 - TLR5 (100 NG / ㎖) FSLTLR6 1 / 2 (100 NG / ㎖); ssRNA40-TLR7 (1 μg의 / ㎖); ODN1826-TLR9 (1 μM). 참고 : 각 리간드 10 배 재고 솔루션을 준비합니다. 따라서 10 배 희석을 수행, 각 웰에 후자의 100 μl를 추가합니다. </li></ol> 3. R​​NA 분리 <ol><li> 피펫을 통해 여러 번 각 웰에 1 ml의 트리 졸을 첨가하고, 세포 용 해물을 전달하여 6 웰 플레이트에서 직접 모든 매체를 Lyse 세포를 제거한다. 핵 단백질 복합체의 완전한 분리를 허용하도록, RT에서 5 내지 10 분 동안 균질화 된 샘플을 인큐베이션. </li><li> 1.5 ml의에 해물을 전송 RNA 분해 효소와 DNase의 무료 마이크로 원심 튜브. 1 ㎖의 트리 졸 0.2 ml의 클로로포름을 추가합니다. 15 초 동안 손으로 적극적으로 튜브를 흔들 5 ~ 10 분 동안 실온에서 그들을 품어. 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. 낮은 붉은 단계 (페놀 - 클로로포름)로 분리 혼합물, 계면 무색 위 수성 상을 관찰한다. RNA는 수성 상에 독점적으로 남아있다. </li><li> 트란계면을 방해하지 않고 새로운 튜브에 sfer 조심스럽게 위 수상. 이소 프로필 알콜 0.5 ㎖로 혼합하여 그것에서 RNA를 침전. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 10 분간 원심 분리하고 실온에서 샘플을 인큐베이션. RNA는 튜브의 측면 및 저면에 흰 석출물 펠렛을 형성. </li><li> 상층 액을 제거합니다. 75 % 에탄올 1 ㎖로 한 번 RNA 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 7,500 XG에 텍싱 및 원심 분리하여 샘플을 섞는다. 간단히 RNA (10 분 동안 건조 공기)을 건조. 0.1 ml의 DEPC (RNAse가없는 물)에서 RNA를 녹이고 55 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화. 이렇게하려면 샘플을 DEPC 물에 100 배 희석하고 260 nm의 파장에서 읽을. RNA 농도는 것입니다 : 외경 260 × 40 NG / UL X 희석 계수를. </li><li> RNA 농도를 균일화하고 첫 번째 가닥의 cDNA 합성 키트에 대한 RT-PCR 시스템을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성. 으로제조자의 지침에 따라, 실시간 PCR 실시간 DNA 검출 시스템 (45 회)에 의해 유전자의 mRNA 수준을 측정한다. 예 β 액틴 및 GAPDH 두 하우스 키핑 유전자와 유전자 발현 수준을 정상화. 참고 : ml의 500 μg의 /에 RNA 농도를 정상화 및 cDNA 합성 0.5 μg의를 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

대 식세포는 생존을 위해 매우 중요하다 및 면역 학적 목표에 대한 호스트를 조작 할 수있는 유혹 대상을 제공합니다. TLRs를 인식하고 다른 분자의 발견은 면역 논쟁의 중심 대 식세포를 수행 하였다. 대 식세포는 사이토 카인, 손상 관련 분자 패턴 분자 (감쇠) (20)과 병원균 (PAMPs가) 21 그룹과 연관된 분자를 포함한 다양한 자극에 반응한다. 이러한 다양한 자극 응답은 대 식세포의 활성화 과정을 나타내며, 보통 유전자 발현 (22)에 급격한 변화와 연관된다. 비 염증 상태에서는 대 식세포의 대부분은 체내에서의 전략적 위치에 상주. 그들은 모든 조직 및 혈액 단핵구 순환으로 찾을 수있다. 따라서, 식세포는 미생물 침입에 대해 가장 민감한 부위에 존재한다. 호스트 방어는 내가 설명한다고전 식세포의 활성화와 관련된 세포 내 병원균의 제거에 nflammatory ...

세망 내피 식세포 시스템은 골수, 혈액, 간 및 비장 등의 다양한 조직 및 기관에서의 세포로 구성된다. 대 식세포는 광범위하게 그들은 특히 타고난에 참여하고 제어하는​​ 면역 반응과 명확한 감염을 적응 적 신체, 주위에 분포한다. 숙주 방어에서의 역할뿐만 아니라, 대 식세포는 상처 치유 및 조직 1,2- 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 또한, 대 식세포는 면역 기능 만 중요한 것이 아니라 적극적으로 철 항상성 3에 참여한다. 체내에서 철의 약 80 %가 노화가 4 대 식세포에 의해 포식되고있는 경우에는, 적혈구 내의 헤모글로빈에 존재한다. 매일, 이러한 대 식세포는 적혈구 유래 철의 25 mg의 재활용 및 플라즈마 (5)에 자사의 전송을 제공한다. 또한, 감염 및 염증 동안 대 식세포 염증성 철 availabili 감소 혈청 철을 격리시키는모두 전신 및 지역 수준 6-8에서 병원균에 타이. 대 식세포 주로 간세포 철 대사 (9), (10)의 마스터 조절기 간주됩니다 hepcidin라는 항균 펩타이드를 생산하는 것이 아니라 연구는 보여 주었다. Hepcidin은 주로 염증 자극에 의해 증가 및 만성 염증 11 ~ 13시 대 식세포 철 격리 부분적으로 책임이있다. 대 식세포에 hepcidin 표현이 잘 이해되지 않습니다, 우리는이 규정에 수신자 같은 수용체의 가능한 역할 (TLR들)을 공부했다. TLR에 주로 대 식세포에서 발견되고 그들의 활성화에 중심적인 역할을한다. 또한, 간에서의 LPS 유도 hepcidin 식 TLR4 (13)에 의존한다. 따라서, 우리의 연구를 실행하도록, 우리는 뮤린 복막 마크로파지의 분리에 기초한 방법을 사용 하였다. 대식 세포주 대체로 대식 스터드에 이용된다이거; 그럼에도 연장 배양 유전자의 손실을 야기하고 이러한 세포주에서 면역 기능을 저하 할 수있다. 따라서, 복강 대 식세포에서의 분리는 매우 중요하다. 마우스 복강 대 식세포 13-15을 수확 할 수있는 이상적인 위치를 제공합니다. 고립 된 쥐의 복강 대 식세포는 면역 기능에 관한 여러 연구 편리합니다. 그러나, 복막의 대 식세포의 수가 방대한 연구 불충분하고, 마우스 당 약 1 × 106 식세포를 추정한다. 따라서, 대 식세포의 출력을 높이기 위해, 예컨대 티오 글리콜 레이트와 같은 멸균 제는 유도 세포 수확 직전 복강 내로 주사 하였다. 티오 글리콜 레이트 주사 후, 마우스 당 식세포의 수율은 10 배 증가 하였다. 대 식세포 수율, 대 식세포의 모집, 엄마의 결과, 염증 반응을 유도하는 자극으로 맥주의 티오 글리콜 레이트 배지 행위의 증가에도 불구하고그러나 Y 불필요 유전자 발현에 영향을 미친다. 따라서, 비 처리 된 대 식세포로 구성된 대조군이 각각의 실험에 포함되어야한다. 우리의 손에, 높은 염증에 의해 자극 hepcidin 표현은 복막 대 식세포를 이끌어 비 처리 티오 글리콜 레이트 검출되지 않았다. 또한, 연구는 맥주의 티오 글리콜 레이트가 많은 대 식세포를 모집하지만 그들에게 (16)을 활성화하지 않는 것으로 나타났습니다. 한편, 맥주의 티오 글리콜 레이트는 대 식세포는 리소좀 효소의 증가하지만 섭취 미생물을 죽이는 17의 감소를 유발 하였다. 비 - 유도 대 식세포와 비교할 때 16 그러나, 탐식 능력은 영향을받지 않았다. 접시에서 배양하면, 복막 마크로파지 따라서 복강으로부터 분리 된 세포의 다른 유형에서 자신의 분리를 허용 부착된다. 이어서, 절연 식세포 다른 TLR에 작용 제로 감염시켰다.마지막의 mRNA는 배양 된 세포로부터 추출하고, 유전자 발현은 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)을 이용하여 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Charles River Laboratories, Inc. (미국 매사추세츠주 윌밍턴)</td><td>475</td><td></td></tr><tr><td>티오글리콜레이트</td><td>시그마-알드리치, (미주리주 세인트루이스)</td><td>19032-500G</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 펜토바르비탈 나트륨 (마우스 마취에 사용됨 (80 mg/kg, i.p.))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수(DPBS), 얼음에 놓고 대식 세포</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체 1640(페니실린, 스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% 태아 송아지 혈청 보충).</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>1 및 5 ml 주사기</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>309659 6-웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated (NY, USA)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, USA)</td><td>TLRL-pm25</td><td></td></tr><tr><td>Polyionosine&ndash; 폴리시티딜산(폴리(I:C)) (10 mg/ml)</td><td>InvivoGen(미국 샌디에이고)</td>대장균 055:B5의 <td>TLRL-PIC</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen(미국 샌디에이고)</td>Salmonella typhimurium의 <td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>정제 편모(100 ng/ml)</td><td>InvivoGen(미국 샌디에이고)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td>지단백질 합성 FSL1(100 ng/ml)</td><td>InvivoGen(미국 샌디에이고)</td><td>TLR-FSL</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 긴 말단 반복 ssRNA40에서 유래한 ssRNA (1&mu; g/ml)</td><td>InvivoGen (미국 샌디에이고)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>B형 CpG 올리고뉴클레오티드 ODN1826(1 &mu; M)</td><td>InvivoGen(미국 샌디에이고)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (캐나다 온타리오주 벌링턴)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>20G 및 23G 바늘</td><td>BD 미국(NJ)</td><td></td><td></td></tr>305175 <tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음에 놓인 50ml 원추형 튜브</td><td>Sarstedt(미국 매사추세츠주 뉴턴)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80 항체</td><td>BIO-RAD ( CA, USA)</td><td></td><td></td></tr>MCA497APC <tr><td>CD16/CD32 항체</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tubes</td><td>Axygen Scietific (CA, USA)</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific (ON, 캐나다)</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>JT Baker (PA, USA)</td><td>70566</td><td></td></tr><tr><td>75% 에탄올 (DEPC 처리수 중)</td><td>상업용 알콜 (QC, 캐나다)</td><td>17394</td><td></td></tr><tr><td>0.01% 디에틸 피로탄산염(DEPC) 처리수(하룻밤 방치하고 오토클레이브)</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript RT-PCR system</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene 3000</td><td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada)QuantiTect</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SYBR Green I PCR kits</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td><td>204141</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

감염과 염증 동안, 순환 단핵 세포는 혈류를 떠나 그들이 대 식세포로 분화 조직으로 이동한다. 마크로파지는 미생물의 광범위한 발전을 통해 보존 된 분자 패턴을 인식 표면 수신자 같은 수용체 (TLR들)을 표현한다. TLR에 보통 유전자 발현의 변화와 연관된 대 식세포의 활성화에 중요한 역할을 담당한다. 대 식세포는 많은 질병에 중요하며 치료를위한 매력적인 대상으로 등장했다. 다음의 프로토콜에서는 맥주의 매체를 이용하여 티오 글리콜 레이트 뮤린 복막 대 식세포를 분리하는 과정을 설명한다. 후자는 이에 따라이 10 배 식세포 수율을 올릴 것이다, 복막에 단핵 세포 마이그레이션을 높일 것입니다. 몇몇 연구는 골수, 비장 또는 복막 대 식세포 유래를 사용하여 수행되었다. 그러나, 복강 대 식세포는 분리에 따라 더 성숙한 것으로 나타났다과 기능에 더 안정되었다성만 및 표현형. 따라서, 쥐의 복강에서 분리 한 대 식세포는 다른 면역 및 대사 연구에서 봉사 할 수있는 중요한 세포 집단을 제시한다. 격리되면 대 식세포는 다른 TLR 리간드로 자극하고, 결과적으로 유전자 발현을 평가 하였다.

우리는 제 1 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 쥐의 복강 대 식세포를 특징. 이렇게하려면, 우리는 구체적 만 대 식세포에 의해 표현 마커를 인식 (F4 / 80) 항체를 사용 하였다. 이 특성은 절연 식세포의 백분율을 결정하고, 분리 과정 중 얻어진 세포와 구별 할 필요가있다. (도 1)에 도시 된 바와 같이, 세포의 비율은 F4 / 80이 지속적으로 95 % 초과 인 것으로 밝혀졌다 항원을 발현. 이어서, 대 식세포에서의 유전자 발현을 연구하기 위해, 분리 된 세포는 여러 TLR 리간드로 처리 하였다 : Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) 및 FSL1 (TLR6 / 2). 이어서, Hepcidin (HAMP), 우리의 관심 유전자의 mRNA 수준을 RT-PCR로 측정 하였다. TLR1 / 2 (도 2)에 도시 된 바와 같이, TLR4와 TLR6 / 2 리간드는 뮤린 대 식세포 19 hepcidin mRNA ...

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 복강 대식세포를 분리하고 toll-like receptor 자극에 따른 유전자 발현 분석을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스의 복강 내에 3.8% brewer thi glyco medium을 주입하여 복강으로의 단핵구 이동을 촉진함으로써 대식세포 수득률을 높입니다. 3일 후, 마우스를 안락사시키고 차가운 ECCOs phosphate buffer saline을 복강에 주입하여 세포를 수확합니다.복강을 부드럽게 마사지한 후, 복강액을 조심스럽게 흡인합니다. 다음으로, 얻은 세포를 배양하고 유도된 복강 대식세포를 유세포 분석법으로 특성 분석합니다. 마지막 단계는 이러한 대식세포를 서로 다른 toll-like receptor 또는 TLR 리간드로 자극하고 샘플에서 RNA를 분리하는 것입니다.최종적으로, 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 표적 유전자의 발현을 측정합니다. 다음 절차의 목적은 brewer's TIO glycol 배지를 사용하여 복막 대식세포를 분리하는 것입니다. 이 배지는 복막으로의 단핵구 이동을 촉진하여 대식세포 수율을 높여줍니다.분리된 미세포식세포를 서로 다른 toll-like receptor 리간드로 자극하여, 우리가 관심 있는 유전자인 hepcidin의 분자적 조절을 연구할 것입니다. 먼저, 23 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3.8% brewer's bio glyco eight 배지를 준비하십시오. 각 마우스의 복강 내에 3.8% brewer's bio glycol eight 배지 1 mL를 주입하고 3일 동안 기다리십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 마취 및 안락사를 진행한 후, 각 마우스마다 새로운 주사기와 바늘을 사용하고 각 마우스의 복부를 70% ethanol로 적십니다. 가위로 복막 하단 중앙선을 따라 측면 절개를 수행합니다. 포셉을 사용하여 복부 피부를 뒤로 당겨 투명한 복막 피부를 노출시킵니다.그 다음, 20 gauge 바늘이 장착된 5 milliliter 주사기를 사용하여 각 마우스의 복강에 차가운 ECCOs phosphate buffered saline 5 milliliters를 주입합니다. 복강을 부드럽게 마사지한 후, 장기에 손상을 주지 않도록 주의하여 액체를 흡인합니다. 바늘을 제거하고 복강액을 50 milliliter 원추형 원심분리 튜브에 분취합니다.다음으로 수집한 복강액을 냉장 원심분리기를 사용하여 400 ×g 또는 1500 RPM에서 10분 동안 원심분리하며, 과정 전반에 걸쳐 세포를 차갑게 유지해야 합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 RPMI 1640 배지에 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 샘플의 세포 밀도를 ml당 100만 개가 되도록 조정합니다.유세포 분석법을 통해 분리된 세포의 표현형을 특성 분석하여 대식세포가 농축되었는지 확인합니다. 마우스당 100만 개의 세포와 대식세포에서 직접 발현되는 표면 항원인 F4/80에 대한 항체를 사용합니다. 분리 후, 6-웰 플레이트의 각 웰에 100만 개의 세포를 첨가합니다.웰 플레이트. 마우스 복강 대식세포가 웰에 부착될 수 있도록 37°C에서 1~2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 따뜻한 인산염 완충 식염수로 세 차례 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.그런 다음 세포에 혈청이 포함되지 않은 DMEM 900 µL를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 기재된 대로 각 toll-like receptor 또는 TLR 리간드의 10배 농축 스톡 용액을 준비합니다. 이어서 각 웰에 스톡 용액 100 µL를 첨가하여 10배 희석 배양을 수행합니다.TLR 리간드가 존재하는 환경에서 세포를 24시간 동안 배양합니다. RNA 분리를 먼저 수행하려면, 모든 배지를 제거하고 6-웰 플레이트에서 세포를 직접 용해합니다. 각 웰에 1 mL의 triol 시약을 첨가하고 피펫으로 세포 용해물을 여러 번 통과시켜 섞어줍니다.그 다음, 핵 단백질 복합체가 완전히 해리될 수 있도록 균질화된 샘플을 실온에서 5~10분 동안 배양합니다. 배양 후, 용해물을 1.5 milliliter RNA 및 DNA 전용 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, triol 시약 1 milliliter당 0.2 milliliters의 클로로포름을 첨가합니다. 튜브를 손으로 15초 동안 강하게 흔든 후, 실온에서 5~10분 동안 배양합니다.그다음 4 °C에서 12,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 혼합물이 하단의 붉은색 페놀 클로로포름 층, 중간층, 그리고 상단의 무색 수성층으로 분리되는 것을 확인합니다. RNA는 수성층에만 남아 있습니다.중간층이 섞이지 않도록 주의하며 상층의 수용액 층을 새 튜브로 옮깁니다. 샘플을 상온에서 10분 동안 배양한 후, 0.5 milliliters의 isopropyl alcohol과 혼합하여 RNA를 침전시킵니다. 4 °C에서 12,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.RNA가 침전되어 튜브의 측면과 바닥에 흰색 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거하고 75% ethanol 1 mL로 RNA 펠렛을 한 번 세척합니다. 볼텍싱으로 샘플을 혼합한 다음, 4 °C에서 7,500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거한 후, RNA를 10분 동안 짧게 공기 건조합니다. 그런 다음 RNA를 100 µL의 RNA-free water에 녹이고 55 °C에서 10분 동안 인큐베이션합니다. 다음으로, 분광광도계를 사용하여 RNA의 양을 정량합니다.RNA free water로 샘플을 100배 희석하고 260 nanometers 파장에서 측정하여 RNA 농도를 동일하게 맞춘 뒤, 제조사의 지침에 따라 cDNA를 합성합니다. 이때 first strand cDNA synthesis kit용 RT-PCR 시스템을 사용합니다. 그 후, 실시간 DNA 검출 시스템에서 real-time PCR을 통해 gene mRNA 수준을 측정하며, 두 개의 housekeeping gene으로 유전자 발현 수준을 정규화합니다.분리된 거울상 복막 대식세포를 유세포 분석법으로 특성 분석하여, 분리된 대식세포의 백분율을 결정하고 분리 과정에서 얻은 세포들 사이에서 이를 구분하였습니다. 항원 F4/80을 발현하는 세포의 비율은 지속적으로 95% 이상인 것으로 나타났습니다. 이후 분리된 세포를 여러 TLR 리간드 및 mRNA로 처리하였습니다. hepcidin 수치는 TLR1, TLR2, TLR4에 대한 RT-PCR로 측정하였습니다.톨 유사 수용체 6(Toll-like receptor 6) 및 두 가지 리간드는 미러링 대식세포에서 hepcidin mRNA를 자극할 수 있었습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 미러링 복막 대식세포를 성공적으로 분리하고 유전자 발현의 분자적 조절을 정밀하게 조사하는 데 있어 본 프로토콜의 유용성을 입증합니다. 이 영상을 시청하고 나면 미러링 복막 대식세포를 분리, 식별 및 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-murine-peritoneal-macrophages-to-carry-out-gene-expression

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

포유류의 복막 캐비티는 타고난 면역 반응에 중요한 다른 면역 세포 인구가 포함되어 있습니다. 효율적인 분리 방법은 이러한 세포의 생화 학적 및 기능적 분석이 필요합니다. 여기서 우리는 마우스의 복막 공동 세포의 격리를위한 포괄적인 방법을 제공합니다.

마우스 복막 구멍 세포의 분리

이 비디오는 정맥 면역글로불린과 박테리아 지질다당류를 사용하여 마우스의 복막 대식세포를 활성화하는 방법을 보여줍니다. 동시 자극은 복막 대식세포를 면역 조절 활성을 가진 항염증 대식세포로 활성화합니다.

쥐 모델에서 항체에 반응하여 복막 대식세포의 생체 내 활성화(In vivo Activation of peritoneal macrophages in response to antibodies in a murine model)

이 동영상은 형광 현미경으로 세포사멸 마우스 흉선세포의 복막 대식세포 매개 발포구를 분석하는 절차를 보여줍니다.

복막 대식세포(Peritoneal Macrophage)에 의한 Apoptotic Thymocytes의 Efferocytosis 분석

이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 쥐 대식세포 세포주를 siRNA로 효율적으로 transfection하고, 지질다당류로 대식세포를 자극하고, 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.

Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

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투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

배우세요 쥐 복막 대식세포 분리법으로 TLR 자극 후 유전자 발현 분석을 수행하는 방법을. 면역학 및 대식세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

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