Name: 마스트 셀 노크-인 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 골수 유래 배양 비만 세포를 비만 세포 결핍 마우스에 이식하여 생체 내 기능을 분석하는 방법을. 유세포 분석 및 면역조직화학으로 분포와 표현형을 평가하여 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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N.G.는 프랑스 "퐁디앙 부어 라 레체르체 메디칼 FRM"과 필립 재단의 펠로우십의 수혜자입니다. R.S.는 어린이 건강을 위한 루실 패커드 재단과 스탠포드 NIH/NCRR CTSA 어워드 번호 UL1 RR025744; P.S.는 막스 케이드 재단과 오스트리아 과학 아카데미의 막스 케이드 펠로우십과 오스트리아 과학 기금(FWF) 슈로딩거 펠로우십: J3399-B21의 지원을 받고 있습니다. S.J.G.는 국립 보건원의 지원을 U19 AI104209, NS 080062 및 캘리포니아 대학의 담배 관련 질병 연구 프로그램에서 승인합니다. L.L.R.은 관절염 국립 연구 재단 (ANRF)과 국립 보건 원 보조금 K99AI110645의 지원을 인정합니다.

모든 동물 관리 및 실험은 건강의 국가 학회의 지침과 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 특정 승인을 준수하여 수행되었다.
1. 골수 유래 배양 돛대 세포의 생성 및 특성화 (BMCMC).
참고: 기증자 BMCMC는 받는 사람 MC-결핍 마우스와 동일한 유전 배경의 골수 세포에서 생성되어야 합니다. 남성 유래 기증자 BMCMC는 여성 마우스의 이식에 적합하지 않습니다. 여성 유래 기증자 BMCMC는 성공적으로 남성과 여성 받는 사람 모두에 이식합니다.
<ol><li>골수 추출.<ol>
<li>멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 6개의 웰 배양판(마우스당 1음)에 붓고 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>해부 기기를 70% 에탄올에 담그면 멸균을 위해 몸을 담그십시오.</li>
		<li>이산화탄소(CO2)흡입에 의해 기증자 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 마우스를 분사한 다음 조작 부위에 70%의 에탄올로 마우스를 분사합니다.</li>
		<li>멸균 해부 기구를 사용하여 뼈 에피피를 자르지 않고 대퇴골, 경골 및 비골 뼈를 추출하십시오.</li>
		<li>집게로 뼈를 고정하는 동안 멸균 가위 (또는 메스 블레이드)를 사용하여 뼈에서 모든 조직을 긁어 내고 비골을 버립니다. 모든 뼈가 수집될 때까지 PBS에 뼈를 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>멸균 조직 배양 후드에 남아있는 모든 단계를 수행합니다. 멸균 기구를 사용하여 집게로 뼈를 고정하고 두 표피를 잘라 수질 구멍을 노출시합니다.</li>
		<li>3ml 주사기와 30 G 바늘, 차가운 플러싱 배지(Dulbecco 개조 이글 매체 [DMEM]를 10% 태아 송아지 혈청[FCS, 열불활성], 2m L-글루타민, 1% 항생제-항미코틱 솔루션, 50 μM Β-메르카포에탄으로 보충하여, 페트르골에 수골에 빨강골을 넣습니다.</li>
		<li>동일한 주사기를 사용하여 반복된 부드러운 포부와 배출에 의해 플러시 골수 세포 클러스터를 해리합니다.</li>
		<li>각 마우스에서 15ml 원심분리기 튜브로 대퇴골과 경골 골수를 풀. 4°C에서 5분 동안 골수 세포와 원심분리기를 400 x g에서 씻어내는 차가운 홍조 배지로 튜브를 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC 문화.<ol>
<li>상신체를 제거하고 10 ml의 배양 배지에서 펠릿 골수 세포를 회복합니다(DMEM은 10% 태아 종아리 혈청으로 보충[FCS, 열불성], 2mM L-글루타민, 1% 항생제 항마이코스 용액, 50 μM Β-mercaptoethanol 및 20% WEHI-3 세포 조절 매체 [IL-3의 원천으로; 10 ng/ml에서 재조합 마우스 IL-3을 사용])</li>
		<li>적절한 크기의 조직 배양 플라스크에 세포를 배치(예를 들어,1 마우스용 T25, 2 마우스용 T75 등).</li>
		<li>도금 세포 후 1-2 일, 배지 및 현탁세포 (플라스크의 바닥에 부착 된 파편과 부착 세포를 떠나) 새로운 플라스크에 신선한 배양 배지 (10ml/마우스)를 추가합니다.</li>
		<li>다음 주 동안 3-4일마다 셀을 공급합니다(마우스당 배양 배지 10ml를 추가). 세포 밀도를 2.5 x 105-1 x 106 셀/ml 사이로 유지합니다. 비 부착 된 세포를 배양 플라스크에 부착 된 세포가 없을 때까지 일주일에 한 번 새로운 플라스크로 전달합니다. MC-결핍 마우스로 체외 검사 또는 생을 위해 사용하기 전에 세포의 성숙도를 테스트합니다(아래 참조). 참고: BMCMC의 완전한 차별화는 4-6주가 소요됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMC 성숙도 평가.<ol>
<li>
유동 세포측정을 사용.
		<ol>
<li>세척 셀 (5 x 104-5 x 105 셀/조건) 얼음 차가운 FACS 버퍼 (PBS, 0.5% FCS) 5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브. 4°C에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기. 흡인 슈퍼 네티볼.</li>
			<li>FACS 버퍼에서 항마우스 CD16/32(클론 93 또는 2.4G2) 단일 클론 항체 1:200(2.5 μg/ml)을 희석한다. 각 펠릿에 10 μl을 넣고 간단한 소용돌이로 다시 중단합니다. 얼음에 5분 동안 배양하여 Fc 바인딩을 차단합니다. 참고: 나머지 모든 단계에 대해 샘플을 직접 조명으로부터 보호합니다.</li>
			<li>희석 물리에리트린 (PE) 공주 항 마우스 Fc θRI α (클론 MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) 및 플루오레세인 이소티오야네이트 (FITC) 공주 항 마우스 KIT (CD117; 클론 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("염색 용액"), 또는 FACS 버퍼에서 각각의 표지된 동형 제어 항체("동색 조절 용액").</li>
			<li>차단된 세포의 절반을 1.3.1.2)에서 추가 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 분할하고 한 튜브에 "염색 용액"의 20 μl과 다른 튜브에 "동형 제어 용액"의 20 μl을 추가합니다. 얼음에 30 분 인큐베이션.</li>
			<li>4°C에서 5분 동안 400 x g에서 3ml의 얼음 차가운 FACS 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 1 μg/ml 프로피듐 요오드 (PI, 죽은 세포의 식별을 위해)를 포함하는 300 μl FACS 버퍼에서 슈퍼 나탄을 버리고 펠릿을 다시 중단하십시오. 순환 측정 해석을 흐름으로 진행합니다(그림 2A참조).</li>
		</ol>
</li>
		<li>toluidine 블루 스테인링을 사용 하 여.<ol>
<li>실온에서 5분 동안 400 x g에서 PBS로 1x 105 셀을 한 번 씻은 다음 PBS의 200 μl에서 세포를 흡인 및 재중단합니다.</li>
			<li>세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 부착된 준비된 사이토깔로 옮기고 사이토센심분리기(5분 동안 40 x g)를 사용하여 사이토 원심분리기를 진행한다.</li>
			<li>공기 건조 슬라이드 10 분 PAP 펜을 사용 하 여 셀 주위 왁스 원을 그립니다. 세포를 덮기 위해 0.1% Toluidine 블루 용액을 추가합니다. 1 분 동안 인큐베이션. 흐르는 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 세척합니다.</li>
			<li>장착 매체를 사용하여 커버 슬립 셀. 광 현미경 분석 진행(그림 2B참조)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. BMCMC와 마스트 세포 결핍 마우스의 이식.
<ol><li>인트레이더말(즉, 주사)에 의한 귀 이식. 참고: MC 결핍 마우스의 귀 정점에 BMCmC를 채택하는 경우, 이어 피나 당 각각 1 x 106 셀 (총 2 x 106 셀)의 두 개의 주사를 수행하는 것이 좋습니다. MC-결핍 마우스의 귀 정점에 BMCmC의 인트레이더말 이식은 수동 적인 무호흡 성 과민성 (PCA)24,27,숙주 방어28,만성 과민성 (CHS) 반응29,30의모델을 포함하여 여러 모델에서 많은 조사자들에 의해 사용되었습니다.<ol>
<li>차가운 DMEM에서 4 x 107 BMCmC/ml(1 x 106 BMCmC/ 25 μl)에서 셀을 계산하고 재중단합니다. BMCMC 용액을 30G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.</li>
		<li>이소플루란(2.5% v/v)을 이용한 4-6주 된 MC 결핍 마우스를 마취한다. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인하고, 표시된 경우 이소플루란을 조정하고 시술 내내 호흡과 발가락 핀치 반응을 계속 모니터링하십시오. 안과 연고를 Q-tip으로 바르면 눈의 건조를 방지하십시오.</li>
		<li>검지 손가락으로 귀 피나의 등쪽 면에 수직 압력을 가하여 복부 면을 노출하고 스트레칭합니다.</li>
		<li>BMCMC 용액의 25 μl i.d. 주사를 귀 피나의 복부 면의 두 가지 부위로, 귀 중간에 첫 번째 주사를, 이어 피나 끝을 향한 두 번째 주입을 수행한다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.d. 이식 후 4-6 주를 기다립니다. 참고: 우리의 경험에서, 그 때까지 귀 피나의 중앙 부분에 진피의 MC/mm2의 수는 일반적으로 야생형 마우스의 해당 위치에서 와 유사하지만, 반면, 귀 피네의 주변에 있는 MC/mm2의 수는 일반적으로 해당 야생형 마우스27,28마리보다실질적으로 낮다. 이러한 MC 이식 마우스를 가진 실험을 설계할 때 염두에 두어야 한다(예를 들어,MC 기능에 가능한 효과 에이전트는 귀 피네의 중앙 부분에 주입 되어야 하며, 이러한 치료의 효과의 분석은 또한 그 영역에 초점을 맞추어야 한다).</li>
	</ol></li>
	<li>복막 구멍 내 (i.p.) 주입에 의한 복막 구멍 이식. 참고: MC 결핍 마우스의 복막 구멍으로 BMCMC를 채택하여 마우스 당 2 x 106 세포의 1개의 주사가 필요합니다. 이러한 i.p. MC-결핍 마우스에 BMCmC를 주사하는 많은 그룹이 다양한 모델에서 복막 MC의 역할을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 독에 대한 숙주 방어모델(31) 또는 세균패혈증32,33이포함되어 있다.<ol>
<li>적절한 수의 셀수를 계산하고 차가운 DMEM에서 1 x 107 BMCMC/ml(2 x 106 BMCMC/ 200 μl)로 재중단합니다. BMCMC 용액을 25G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.</li>
		<li>4-6주 된 MC-결핍 마우스의 복막 구멍에 200 μl BMCMC 용액1주입을 수행한다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.p. 이식 후 4-6 주를 기다립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정맥 (즉, 주사)에 의한 이식. 참고: MC 결핍 마우스로 i.v. 주입에 의해 BMCmC의 입양 전송은 마우스 당 5 x 106 세포의 1개의 주입을 요구할 것이다. MC-결핍 마우스로 BMCmC를 주사하는 정맥(i.v.) 주사는 방광 감염34,천식35,폐 섬유증36,항체 매개 관절염37의모델을 포함하여 다양한 질병 모델에서 MC의 역할을 연구하기 위해 많은 그룹에 의해 사용되어 왔다.<ol>
<li>적절한 수의 셀수를 계산하고 차가운 DMEM에서 2.5 x 107 BMCMC/ml(5 x 106 BMCMC/200 μl)로 재중단합니다. BMCMC 용액을 30G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.</li>
		<li>이소플루란(2.5% v/v)을 이용한 4-6주 된 MC 결핍 마우스를 마취한다. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인하고, 표시된 경우 이소플루란을 조정하고 시술 내내 호흡과 발가락 핀치 반응을 계속 모니터링하십시오. 안과 연고를 Q-tip으로 바르면 눈의 건조를 방지하십시오.</li>
		<li>MC 결핍 마우스의 꼬리 정맥(또는 또는 레트로 궤도 정맥)에 BMCMC 용액 200 μl을 1회 주입합니다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.v. 이식 후 12 주를 기다립니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 이식 된 마스트 세포 결핍 마우스의 분석.
<ol><li>귀 이식 분석.<ol>
<li>실험이 끝나면, CO2 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.</li>
		<li>귀 피네를 분리하고 4 °C에서 하룻밤 동안 10 % (vol/vol) 버퍼링 포르말린으로 고정합니다. 파라핀에 고정 된 귀 피네를 포함, 귀 피네의 4 μm 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 마운트.</li>
		<li>실온에서 1 분 동안 0.1 % Toluidine 블루 솔루션으로 슬라이드를 얼룩. 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 실온에서 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 드실 수 있습니다.</li>
		<li>마운팅 매체를 사용하여 커버슬립 슬라이드를 사용한 다음, 라이트 현미경을 사용하여 피네 섹션당 이식된 MC 수를 계산합니다. 이식된 마우스의 귀 껍질에 있는 MC의 백분율 그리고 분포를 야생형 마우스대 비교하여 이식 효율을 평가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>복막 구멍 이식 분석.<ol>
<li>복막 구멍에서 마스트 세포 수의 평가.<ol>
<li>실험이 끝나면, CO2 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 복막 구멍을 부러뜨리지 않고 마우스의 복부 피부를 주의 깊게 제거하십시오.</li>
			<li>25G 바늘이 장착된 주사기 5ml를 사용하여 복막 구멍에 5 ml의 냉온 또는 실온 PBS를 주입하십시오. 복막 세포를 활성화하는 위험을 줄이기 위해 감기 PBS를 사용하십시오 (복막 용암 액에서 복막 MC 탈과또는 일부 MC 파생 제품의 수준을 평가할 때 매우 중요합니다). 복막 세포를 수확하기 위해 20 초 동안 복부 마사지를 수행하십시오.</li>
			<li>22G 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 수막 용암을 천천히 흡인시합니다. 흡량성 용암의 양을 기록하십시오 (주입 된 볼륨의 최대 80 %까지 회복 될 것으로 예상).</li>
			<li>복막 용암액을 5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브로 옮기고 원심분리기를 4°C에서 5분 동안 400 x g로 옮긴다. 흡인 슈퍼 네티볼. 400 μl 감기 PBS에서 펠릿을 복구합니다.</li>
			<li>혈종계 챔버를 사용하여 총 수의 다원세포를 계산합니다. 혈중 세포 측정 분석(단계 1.3.1에 설명된 대로)에 세포 현탁액의 절반을 사용하여 복막 구멍에서 이식된 MC의 백분율 및 마커 발현을 평가한다. MC의 백분율에 따라 회막 셀의 총 수를 곱하여 절대적인 수의 수입니다.</li>
			<li>단계 1.3.2.2에 설명된 바와 같이 나머지 세포와 세포 원심 분리를 수행한다. 실온에서 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 사용하고 PAP 펜을 사용하여 셀 주위에 왁스 원을 그립니다.</li>
			<li>희석되지 않은 5월-그룬발트 스테닝 용액을 5분 간 커버한 다음 실온에서 PBS에서 5분 동안 세척합니다. Giemsa 얼룩으로 세포를 덮어 1:20에 탈온화된 물로 희석하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 수돗물로 2번 밀어 넣고 1분 간 세척한 다음 공기 건조 슬라이드를 세척합니다.</li>
			<li>장착 매체를 사용하여 커버슬립 셀을 사용하고, 경현미경을 사용하여 이식된 MC의 백분율을 계산합니다(최소 400개의 총 세포를 계산하여). 생항마우스의 배막용 암포에서 MC의 비율을 야생형 마우스와 비교하여 이식 효율을 평가한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>막자 창에서 비만 세포의 평가.<ol>
<li>단계 3.2.1에 기술된 복막 용암에 따라 복막을 열어 마우스의 장내를 노출시킵니다. 슬라이드에 마우스 당 4 ~ 5 막연한 창을 정렬합니다.</li>
			<li>카노이 용액(3:2:1 vol/vol/vol of ethanol, 클로로폼 및 빙하 아세트산)에서 1시간 동안 슬라이드를 고정합니다. 공기 건조 슬라이드및 내장을 제거 (고정 된 장간 창은 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다).</li>
			<li>Csaba (알시안 블루 / 사프란 O) 염색 용액으로 실온에서 20 분 동안 준비하십시오.<ol>
<li>500ml의 Csaba 얼룩을 만들기 위해 1M HCl 120ml의 아세테이트 용액 100ml를 혼합하여 500ml의 아세테이트 버퍼를 준비하십시오. 그런 다음 90 mg 사프라닌 [빨간으로 '성숙한 MC'를 식별], 1.8 g 알시안 블루 [파란색으로 '미성숙한 MC'를 식별] 및 2.4 g 의 페리 암모늄 황산 NH4Fe (SO4)2 ~ 500 ml의 아세테이트 버퍼.</li>
			</ol>
</li>
			<li>마운팅 매체를 사용하여 커버 슬립 슬라이드, 다음 가벼운 현미경을 사용하여 막연한 창 당 이식 된 MC의 수를 계산합니다. 이식된 마우스의 막질 창에서 MC의 백분율 과 분포를 야생형 마우스와 비교하여 이식 효율을 평가한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. 이식 분석.<ol>
<li>실험이 끝나면, 자궁경부 탈구, 수확 조직(예를들어 폐, 피부 또는 비장)에 의해 마우스를 안락사시키고 4°C에서 10%(vol/vol) 완충 된 포르말린으로 하룻밤 을 고정한다.</li>
		<li>파라핀에 고정 된 조직을 포함, 4 μm 섹션을 잘라, 유리 슬라이드에 마운트. 실온에서 1 분 동안 0.1 % Toluidine 블루 솔루션으로 슬라이드를 얼룩. 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 공기 건조 슬라이드를 10분 동안 세척합니다.</li>
		<li>커버슬립 슬라이드는 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드를 사용하고 가벼운 현미경을 사용하여 조직 섹션당 이식된 MC의 수와 분포를 평가합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

초기 설명 38 년 후 거의30년,'돛대 세포 노크 -in'접근 방식은 MC가 할 수있는 일또는 생체 내에서 할 수없는 일에 대한 귀중한 정보를 계속 제공하고 있습니다. MC의 기능은 오랫동안 알레르기에 있는 그들의 역할에 국한된 것으로 생각되었습니다. '마스트 셀 노크-인'접근법을 이용하여 생성된 데이터는 MC가 특정 병원균4,39또는 독28,31에 대한 호스트 방어에 중요한역할을 할 수 있다는 증거를 제공함으로써 이러한 견해를 변화시켰으며, 또는 특정 면역 반응을 억제할 수있다 29,34,40일까지.
우리의 프로토콜 설명에서, 우리는 골수 유래 배양 MC (BMCMC)의 생성 및 이식에 집중하기로 결정했습니다, 이러한 세포의 많은 수는 야생 유형 또는 돌연변이 마우스의 골수에서 체외에서 생성 될 수 있기 때문에. 그러나, MC들은 배아...

비만 세포(MC)는 다능성 골수선조1-3에서발생하는 조혈 세포이다. 골수 회귀에 이어 MC들은 지역성장인자의영향으로 성숙한 MC로 발전하는 다양한 조직으로 이주한다. 조직 거주자 MC는 피부, 기도 및 위장관과 같은 호스트 환경 인터페이스에 전략적으로 위치하며, 외부 모욕에 대한 방어의 첫 번째 선으로행동합니다 3-6. MC는 종종 자신의 "기준"표형 특성과 해부학 위치에 따라 하위 분류된다. 마우스에서는 MC의 두 가지 유형이 설명되었습니다 : "결합 조직 형" MC (CTMC) 및 점막 MC (McC)1-3,7,8. CTMC는 종종 정맥 과 신경 섬유 근처에 위치하고, 혈청 구멍에 거주, MmCs는 창자 및 호흡점막1-3의상피 위치를 차지하는 동안.
9-13MC의생물학적 기능을 연구하기 위해 수많은 방법론이 적용되었다. 많은 그룹은 세포주(인간 MC 라인 HMC114 또는 LAD215,16)를사용하여 체외 접근법에 초점을 맞추고 있으며, 체외 유래 MC(예: 인간 말초 혈액 유래 MC17)또는 마우스 골수 유래 배양MC [BMCMC]18,태아 피부 유래 배양 MC [FSCmC]19 및 수막 세포 유래 MC [PCMC]20)또는 다른 해부학 적 사이트에서 전 생체 외 격리 MC. 이러한 모든 모델은 MC 활성화에 관여하는 신호 경로와 같은 MC 생물학의 분자 세부 사항을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, MC 생물학의 중요한 측면은 그들의 표현성 및 기능적특성(예를 들어,세포질 과립 프로테아제 함량 또는 다른 자극에 대한 반응)이 해부학적 위치 및 미세환경에 의해 변조될 수 있다는 것이다2,7. 생체 내에서 발생하는 이러한 요인의 정확한 혼합물은 시험관 내에서재현하기 어려울 수 있기 때문에, 우리는 MC 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 생체 내 접근 방식을 사용하는 것을선호9.
널리 사용되는 WBB6F1-키트 W/W-v 또는 C57BL/6-키트 W-sh/W-sh 마우스와 같은 유전 MC 결핍을 가진 몇몇 마우스 긴장이 존재합니다. 이들 마우스는 KIT(CD117)의 발현 및/또는 활성이 부족하며, 주 MC 성장 인자 줄기 세포 인자(SCF)21,22에대한 수용체가 부족하다. 그 결과, 이들 마우스는 심오한 MC 결핍을 가지고 있지만, 또한c-키트 돌연변이(WBB6F1-키트 W/W-v 마우스)와 관련된 추가적인 표현성 이상이 있거나 큰 염색체 반전의 영향으로 c-키트 발현(C57BL/6-키트 W-sh/W-sh/W-sh)을 감소시키는 효과가 있다. 최근에는c-kit-독립적인구성 MC 결핍을 가진 마우스의 몇몇 변종은24-26보고되었다. 이러한 모든 마우스와 유도 할 수없는 MC-결핍 마우스의 몇 가지 추가 새로운 유형은 최근 자세히 검토되었습니다9,10,13.
여기서는 마우스골수 유래 배양형 MC(BMCMC) 생성, MC-결핍 마우스로의 입양 전달, 양상분석, 양상분석 등의 방안을 설명하고 있다. 이른바 '마스트 셀 노크인' 방법을 사용하여 MC및 MC 파생 제품의 기능을 생체 내에서 평가할 수 있다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>1% 항생제-항진균 용액</td><td>Corning cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>3ml 주사기</td><td>Falcon</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm 접시</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Rowley Biochemical Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R 원심분리기</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD16/32(클론 93) 정제</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1ml TB 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 22G x 1(0.7mm x 25mm) 바늘</td><td>BD 정밀 글라이드 니들</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 바늘</td><td>BD 주사기</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 바늘</td><td>BD 프리시전 글라이드</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>블루 MAX Jr, 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>팔콘</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 마운팅 매체</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation 펜</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 열 비활성화</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC 복합 IgG2b K 쥐 동형 대조군</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 복합 안티 마우스 키트(CD117, 클론 2B8)</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 염색 변성</td><td>시그마 Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>이소테시아</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 현미경</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus 조직 임베딩 매체</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE 복합 IgG 아르메니아 햄스터 이소타입 제어</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin(PE) 복합 안티마우스 FceRIa(클론 MAR-1)</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 염색 용액</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Safranin-o 인증</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루 1% 수성</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

비만 세포 (MC)는 다양한 조직에 상주하는 조혈 세포이며, 특히 피부, 기도 및 위장관과 같은 외부 환경에 노출 된 부위에 풍부합니다. IgE 의존성 알레르기 반응에서 해로운 역할로 가장 잘 알려진 MC들은 독과 침입 하는 박테리아와 기생충에 대 한 호스트 방어에 중요 한 선수로 등장 했다. MC 표현형 및 기능은 해부학적 위치에 따라 다를 수 있는 미세 환경적 요인및/또는 면역 반응의 발달의 유형 또는 단계에 따라 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로, 우리와 다른 MC 기능에 대 한 통찰력을 얻기 위해 체 외 메서드를 통해 생체 내 접근에 선호 했다. 여기서는 마우스골수 유래 배양MC(BMCMC), 유전자 MC-결핍 마우스로의 입양 이송, 양상에서 입양된 MC의 수 및 분포 분석 등을 설명하고 있다. '마스트 셀노크인' 접근법이라는 이름의 이 방법은 지난 30년 동안 MC와 MC 파생 제품의 기능을 생체내에서평가하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.

'마스트 세포노크-인'접근법의 개요는 도 1에도시되며, BMCmC의 생성, i.p., 즉 mc-결핍 마우스로 이식해야 하는 세포의 수(실험 설계에 따라 표시될 경우 숫자가 달라질 수 있음) 및 주사 부위에 따라 이식 및 실험 사이의 간격을 포함할 수 있습니다(이 에 따라 달라질 수 있습니다.) 예를 들어,MC 세포질 과립에 저장된 중재자의 함량은38시에꾸준히 증가한다.) 도 2는 IL-3의 원천으로서 20%의 WEHI-3 세포 조절 배지를 함유하는 DMEM 배지에서 1, 15 및 45일 배양 후 BMCmC의 대표적인 유동 세포 분석 및 토루이딘 블루 염색을 나타낸다. 45일 동안 배양된 BMCmCs는 95% 순수하며, 세포질 과립의 수가 많으며 이식 실험에 사용할 수 있으며, 15일 동안 배양된 세포는 이식에 적합하지 않습니다. 도 3은 i.d. engraftment(도 3...

우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

다음 방법의 전반적인 목표는 비만세포 녹인(knockin) 마우스를 사용하여 생체 내(in vivo) 비만세포의 기능을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 골수 유래 배양 비만세포(BMC MCs)를 생성하거나 비만세포 결핍 마우스에 이식함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 BMC MC를 비만세포 결핍 마우스의 다양한 해부학적 부위에 입양 전이하여 비만세포 녹인 마우스를 생성합니다.최종적으로, 입양 전이된 비만세포의 수와 해부학적 분포를 유세포 분석 및 면역조직화학적 분석을 통해 평가하여, 생착된 세포군이 야생형 마우스에서 발견되는 세포군과 어느 정도 유사한지 확인합니다. 이 기술의 주요 장점은 생착된 야생형 또는 유전자 변형 비만세포군의 기능을 생체 내(in vivo)에서 직접 평가할 수 있다는 점입니다. 따라서 이 방법은 비만세포나 그 생성물이 인간 질환 모델을 포함하여 생리학적, 면역학적 또는 병리학적 과정의 마우스 모델의 특징에 어느 정도 기여하는지와 같은 비만세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 학습하는 연구자들은 BM CMC를 생성하는 방법, 주입 부위, 주입된 BMC MC의 수, 그리고 생체 내 실험을 수행하기 전 생착 후 대기 기간에 따라 비만세포의 생착 및 결핍 정도가 달라질 수 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. 생착 과정의 일부 단계는 실제로 어떻게 수행되는지 정확히 보지 않고서는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저 골수를 추출하기 위해, 멸균된 해부 도구를 사용하여 야생형 생쥐의 골단부를 손상시키지 않고 대퇴골, 경골 및 비골을 채취하십시오.각 뼈를 해부할 때마다 포셉으로 고정한 후 모든 외부 조직을 긁어내어 제거합니다. 그런 다음 뼈를 얼음 위의 PBS에 넣습니다. 모든 뼈를 수집한 후 멸균 조직 배양 후드로 옮기고, 포셉으로 뼈를 하나씩 고정하여 양쪽 골단(epiphyses)을 절단함으로써 골수강을 노출시킵니다. 다음으로, 30 gauge 바늘이 장착된 3 mL 주사기에 차가운 배지를 채워 각 뼈의 적골수를 새로운 페트리 접시에 모두 씻어냅니다. 모든 뼈를 씻어낸 후, 동일한 주사기를 사용하여 부드럽게 반복적으로 흡입 및 배출함으로써 골수 세포 클러스터를 분리합니다.그런 다음 세포 현탁액을 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브에 차가운 세척액을 채우고 세포 현탁액을 원심분리합니다. 세포 펠릿을 10 milliliters의 배양액에 현탁합니다.그 다음 골수 세포를 적절한 크기의 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 1~2일 동안 배양한 후, 다음 몇 주 동안 마리당 10 milliliters의 신선한 배양 배지와 함께 비부착 세포를 새 플라스크로 옮깁니다. 시연된 바와 같이 3~4일마다 세포에 배지를 공급합니다.귀 핀나(ear pinna)로의 피내 이식을 위해 부착되지 않은 세포를 일주일에 한 번씩 새로운 플라스크로 옮겨 부착 세포가 남지 않을 때까지 배양합니다. BMC MCs를 차가운 DMEM에서 4 × 10⁷ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 그런 다음 30 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기로 세포를 흡입하여 주사기를 얼음 위에 둡니다.다음으로, 4~6주령의 비만세포 결핍 수용 마우스의 상단 꼬집기 반응을 통해 적절한 마취 깊이를 확인하고, 세포 주입을 위해 안연고를 도포합니다. 집게손가락을 사용하여 귀 핀나(pinna)의 복면을 노출시키고 당겨서 귀의 배면에 수직 압력을 가합니다. 그 후, 귀 중앙에 1×10⁶ BMC MCs 25 µL를 진피 내 주사하고, 동일한 용량 25 µL를 핀나 끝부분을 향해 두 번째로 주사합니다.복강 내 이식을 위해 BMC MC를 차가운 DMEM에서 1×10⁷ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 그 다음, 25 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 200 µL 배지에 포함된 2×10⁶ BM CMCs를 비만세포 결핍 수용 동물의 복강 내로 주입합니다. 정맥 내 이식을 위해서는 BM CMCs를 차가운 DMEM에서 2.5×10⁷ cells/mL 농도로 재현탁한 후, 200 µL 배지에 포함된 5×10⁶ BMC MC를 꼬리 정맥을 통해 주입합니다.복강 내 이식 후 4~6주가 지나면, 25 gauge 바늘이 장착된 5 mL 주사기를 사용하여 수 recipient 동물의 복강 내에 차가운 PBS 5 mL를 주입합니다. 복부를 20초 동안 마사지하여 복강 세포를 수집합니다. 그런 다음 22 gauge 바늘이 장착된 5 mL 주사기를 사용하여 복강 세척액을 천천히 흡입합니다.이후 복강 세척액 내의 비만세포 백분율과 총 세포 수를 유세포 분석법 또는 조직 화학법으로 평가할 수 있습니다. 장간막 창(mesenteric windows)의 비만세포를 평가하려면 복막을 절개하여 소화관을 노출시킵니다. 마우스당 4~5개의 장간막 창을 슬라이드 위에 배치한 후, 카노아(carnoy) 용액에서 1시간 동안 고정합니다.배양 종료 후 실온 상태에서 슬라이드를 자연 건조하고 장을 제거하십시오. 고정된 장간막 창(mesenteric windows)은 슬라이드에 부착된 상태로 유지됩니다. 마지막으로, 실온에서 20분 동안 chaba 염색액으로 표본을 염색하십시오. IL-3가 첨가된 DMEM에서 1일, 15일 및 45일 동안 배양한 후 BM CMCs의 유세포 분석 및 odine blue 염색 결과가 나타나 있습니다. 45일 동안 배양된 BM CMCs는 95%의 순도를 보이며 다량의 세포질 과립을 포함하고 있습니다.따라서 이러한 배양액의 세포들은 이식 실험에 적합하지만, 해당 이미지들에서 15일 동안 배양된 세포들은 그렇지 않습니다. 진피 내 이식 4주 후의 귀, 장간막창 이식, 복강 내 이식 6주 후의 복강, 그리고 정맥 내 이식 12주 후의 폐에서 예상대로 성공적인 이식이 이루어진 것이 나타납니다. 야생형 마우스에서 분리한 조직 샘플에서는 마스트 세포가 관찰되는 반면, 마스트 세포 결핍 동물 및 마스트 세포 넉인 마우스에서는 마스트 세포가 검출되지 않습니다.하지만, 입양 전이된 BMC MC는 야생형 동물에서 관찰되는 것과 유사한 위치에서 나타납니다. 이 절차를 수행할 때, 생착 후 실험 분석까지의 간격은 비만세포 주입 부위에 따라 달라질 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 생착된 세포가 성숙하여 체내 최종 위치에 자리 잡을 수 있도록 충분한 시간을 확보하기 위해 이러한 간격을 엄격히 준수하는 것이 매우 중요합니다.이러한 접근 방식은 질량 세포와 그 생성물이 생체 내(in vivo)에서 할 수 있는 일과 할 수 없는 일에 대한 중요한 정보를 제공해 왔으며 현재도 제공하고 있습니다. 살아있는 동물을 대상으로 하는 실험에는 특정한 훈련, 실험 프로토콜에 대한 적절한 검토 및 승인이 필요하며, 이러한 절차를 수행할 때 동물의 통증과 스트레스를 줄이기 위한 노력을 포함하여 동물 관리의 최고 표준을 엄격히 준수해야 함을 항상 명심하십시오.

analyzing-functions-mast-cells-vivo-using-mast-cell-knock

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기에 설명하는 것은 lipopolysaccharide가 유선염을 시뮬레이션 할 수있는 유두, 일반적으로 세균 감염에 의한 조건을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술입니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에 Lipopolysaccharide 사출 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스의 발광 생물 이미징을 통해 시각화.

유선염의 마우스 모델로 LPS의 Intraductal 주입 : 신호는 NF-κB 리포터 트렌스 제닉을 통해 시각화

이 동영상은 비만 세포의 탈과립 활성을 결정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 비만 세포에서 방출되는 효소는 기질을 가수분해하고 착색된 생성물을 생성합니다. 비만 세포의 탈과립 활성은 세포 내 총 효소 함량으로 정규화된 세포 외부의 효소 방출 비율로 측정되었습니다.

표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

이 비디오는 성체 마우스의 복막강에서 성숙한 결합 조직형 비만 세포를 분리하기 위한 복막 세척 방법을 보여줍니다. 복막강에서 1차 면역 세포의 혼합물을 분리한 후, 적절한 배양 조건에서 비만 세포의 선택적 증식을 수행합니다.

쥐 복막강에서 일차 비만 세포를 분리하는 기술

비만 세포와 호염기구의 활성화를 특징으로 알레르기 반응은, IgE 항체의 가교 및 염증 매개 물질의 방출에 의해 구동된다. 알레르기 반응의 정량적 인 평가는 알레르겐 공격 후 혈관 투과성의 변화를 모니터하는 에반스 블루 염료를 사용함으로써 달성 될 수있다.

마우스에 현지 아나필락시스 측정

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를...

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

배우세요 골수 유래 배양 비만 세포를 비만 세포 결핍 마우스에 이식하여 생체 내 기능을 분석하는 방법을. 유세포 분석 및 면역조직화학으로 분포와 표현형을 평가하여 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

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