'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

다음 방법의 전반적인 목표는 비만 세포 노킨 마우스를 사용하여 in vivo에서 비만 세포의 기능을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 골수 유래 배양 비만 세포 또는 BMC MC를 생성하거나 비만 세포 결핍 마우스에 생착함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 BMC MC를 비만 세포 결핍 마우스의 다양한 해부학적 부위로 채택하여 비만 세포 knockin 마우스를 생성합니다.

궁극적으로, 양적으로 이식된 비만 세포의 수와 해부학적 분포는 유세포 분석 및 면역조직화학 분석을 통해 평가되어 생착된 집단이 야생형 마우스에서 발견되는 것과 어느 정도 유사한지 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 생착된 벽 유형 또는 유전적으로 변형된 MA 세포 집단의 기능을 in vivo에서 직접 평가할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 MA 세포 또는 그 산물이 인간 질병 모델을 포함하여 생리학적, 면역학적 또는 병리학적 과정의 마우스 모델 기능에 어느 정도 기여할 수 있는지와 같은 MA 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

일반적으로 비만세포 생착 및 결핍은 BM CMC를 생성하는 데 사용되는 방법, 주입 뿌리, 주입된 BMC MC의 수 및 생체 내 실험을 수행하기 전 생착 후 1주 동안의 수에 따라 달라질 수 있기 때문에 이 방법을 배우는 개인은 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 생착 절차의 측면이 어떻게 수행되는지 정확히 않으면 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 골수를 추출하려면 멸균 해부 도구를 사용하여 뼈 골단을 저주하지 않고 야생형 마우스에서 대퇴골, 경골 및 비골을 채취합니다.

뼈 하나하나를 해부할 때, 집게로 뼈를 고정하고 외부 조직을 모두 긁어낸다. 그런 다음 모든 뼈가 수집되면 PBS의 뼈를 얼음 위에 놓고 멸균 조직 배양 후드로 옮긴 다음 한 번에 하나씩 집게로 각 뼈를 고정하고 두 골단을 잘라 수강을 노출시킵니다. 다음으로, 30 게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기를 사용하여 차가운 매체를 세척하여 각 뼈의 모든 붉은 골수를 새 페트리 접시에 넣습니다.모든 뼈가 세척되면 동일한 주사기를 사용하여 부드러운 흡인과 배출을 반복하여 골수 세포 클러스터를 해리합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 콜드 플러싱 매체를 채우고 세포를 원심분리하여 소생시킵니다. 세포 펠릿을 10 밀리리터의 배양 배지에 현탁시킵니다.

그런 다음 골수 세포를 적절한 크기의 조직 배양 플라스크에 옮깁니다. 1-2일 배양 후, 비접착 세포를 새 플라스크와 함께 10ml의 신선한 배양액과 함께 다음 몇 주 동안 마우스당 배지로 옮깁니다. 3-4일마다 세포에 영양을 공급하는 것이 시연되고 있습니다.

접착 세포를 일주일에 한 번 새 플라스크로 옮겨 피내 생착을 위해 접착 세포가 남지 않을 때까지 귀 피너 Resus에 넣습니다. 저온 DMEM에서 BMC MC를 10배의 4배로 10배로 매달아 밀리리터당 7개의 셀로 매달아 놓습니다. 그런 다음 30게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기에 세포를 흡인하고 주사기를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 4-6주 된 비만세포 결핍 수혜자 마우스의 상단 핀치로 적절한 마취 깊이를 확인하고 안연고를 도포하여 세포를 주입합니다. 검지 손가락을 사용하여 귀 피너의 복부 면을 노출시키고 늘려 귀의 등쪽 면에 수직 압력을 가합니다. 그런 다음 6개의 BMC MC에 1회 10회 25마이크로리터의 피내 주사 1회를 귀 중앙으로 투여하고, 피너 끝을 향해 동일한 25마이크로리터 주사를 두 번째 25마이크로리터 주사합니다.

복강내 생착의 경우, 저온 DMEM에서 BMC MC를 10배에서 10배로 재현탁합니다. 그런 다음 25게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 200마이크로리터의 배지에 있는 6개의 BM CMC에 10배로 2회 주입하여 정맥 생착을 위해 비만 세포 결핍 수용자의 복강에 주입합니다. BM CMC를 차가운 DMEM에서 밀리리터당 7개의 세포에 2.5배10으로 재현탁시킨 다음 꼬리 정맥을 통해 200마이크로리터의 배지에 있는 6개의 BMC MC에 5배 10을 주입합니다.

복강내 생착 후 4-6주 후, 25 게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 5ml의 차가운 PBS를 수용 동물의 복강에 주입합니다. 복막을 20초 동안 마사지하여 복막 세포를 채취한다. 그런 다음 22게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 복막 세척을 천천히 흡인합니다.

그런 다음 복막 세척액의 비만 세포 비율과 총 세포 수를 유세포 분석 또는 히스토 화학으로 평가할 수 있습니다. 장간막창의 비만 세포를 평가하려면 복막을 잘라 장관을 노출시킵니다. 슬라이드에 마우스 당 4-5 개의 장간막 창을 배치 한 다음 자동차 소음 솔루션에 1 시간 고정합니다.

배양이 끝날 때 실내 온도를 추가하고 슬라이드를 자연 건조시키고 장을 제거합니다. 고정된 장간막 창은 슬라이드에 부착된 상태로 유지됩니다. 마지막으로, 제제를 실온에서 20분 동안 chaba 염색 용액으로 염색하여 15일 및 45일 배양 후 BM CMC의 유세포 분석 및 오딘 블루 염색을 나타내고, DMEM에서 IL 3를 보충하여 45일 동안 배양하고 순도 95%의 BM CMC를 함유하고 있으며 많은 수의 세포질 과립을 함유하고 있음을 보여줍니다.

따라서 이러한 배양액의 세포는 생착 실험에 적합하지만 15일 동안 배양된 세포는 이러한 이미지에 없습니다. 피내 생착 4주 후 귀 페니, 생착 장간막 창, 복강내 생착 6주 후 복막강, 정맥 생착 12주 후 폐의 성공적인 생착이 예상대로 나타났습니다. 야생형 마우스에서 분리된 조직 샘플에는 비만 세포가 존재하는 반면, 비만 세포 노킨 마우스의 비만 세포 결핍 동물에서는 비만 세포가 검출되지 않습니다.

그러나 입양으로 이식된 BMC MC는 야생형 동물에서 관찰되는 것과 유사한 위치에 나타납니다. 이 절차를 시도하는 동안 생착과 실험 연구 사이의 간격은 비만 세포 주입 부위에 따라 다르다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 생착된 세포가 성숙하고 최종 위치 vivo를 차지할 수 있는 충분한 시간을 허용하기 위해 이러한 간격을 존중하는 것이 매우 중요합니다.

이 접근법은 질량 세포와 그 산물이 in vivo에서 할 수 있는 것과 할 수 없는 것에 대한 중요한 정보를 제공해 왔으며 계속해서 제공하고 있습니다. 살아있는 동물과 함께 작업하려면 특정 교육, 실험 프로토콜에 대한 적절한 검토 및 승인, 이러한 절차를 수행할 때 동물의 통증과 스트레스를 줄이기 위한 주의를 기울이는 것을 포함하여 최고 수준의 동물 관리 표준을 엄격하게 준수해야 한다는 점을 항상 명심하십시오.