Name: 유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 학습하세요 유해 화학 물질에 노출된 후 내피 세포 이동을 평가하는 방법을 알아보세요. 수정된 보이든 챔버 분석, 상처 치유 분석 및 세포 추적을 사용하여 세포 이동 역학과 미토콘드리아 막 전위 변화를 연구합니다.

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다음 프로토콜은 초기 내피 세포 이동의 조사 방법을 설명합니다. 혈관 내피 세포의 적절한 재배 내피 표현형의 적절한 증식과 유지 보수를 보장하기 위해 젤라틴과 세포 배양 플라스크의 사전 코팅이 필요합니다. 세포 배양 플라스크 1. 사전 코팅 <ol><li> 0.1 %의 최종 농도 0.1 M PBS에 젤라틴을 녹인다. </li><li> (자세한 내용은 특정 오토 클레이브의 지침을 참조하십시오) 액체 고압 증기 멸균에 대한 매개 변수를 사용하여 솔루션을 압력솥. </li><li> 무균 세포 배양 플라스크 (T25 세포 배양 용 플라스크 예, 적어도 5 ㎖)을 오토 클레이브 젤라틴 용액의 충분한 양을 추가한다. </li><li> 인큐베이터로 플라스크로 이동 (37 ℃, 5 % CO 2는 필요하지 않지만 방해하지 않는) 적어도 30 분 동안. </li><li> 나머지 젤라틴 용액을 제거합니다. 이후 사전 코팅 된 플라스크를 사용하십시오 (세포 배양) 또는 S사용할 때까지 무균 상태에서 찢었다. </li></ol> 초기 내피 세포의 2. 세포 배양 주 : 앞서 설명 된 바와 같이 10, 11, 배아 줄기 세포 유래의 초기 내피 세포 (EEC)를 PECAM-1 양성 세포 분획의 자기 활성화 세포 정렬하여 차별화 뮤린 배양체로부터 수득 하였다. <ol><li> DMEM에서 젤라틴 코팅 된 세포 배양 접시에 배양 EEC 15 % FCS, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 U로 보충 / ㎖ 스트렙토 마이신, 200 μM L- 글루타민, 100 μM의 ß 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산. 멸균 조건에서 세포를 처리합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 세포를 배양하고, 95 % 습도의 합류 부 (최대. 80 %)까지. </li><li> 5 비율 : 하위 합류, 1에서 세포를 분리. 참고 : 내피 세포의 박리가 중요한 단계입니다. <ol><li> RT의 accutase와 세포를 수확. 용지를 제거 PBS로 씻어 25cm 당 accutase 1 ㎖를 추가 <sup&gt; 2. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 2 내지 10 분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이션. 세포를 분산하고 원하는 응용 프로그램으로 전송합니다. 참고 : accutase의 화학적 중화가 시드 세포는 37 ° C에서 인큐베이터에 저장됩니다 때 발생으로 필요하지 않습니다. 그러나 accutase 활동도 FCS 함유 DMEM을 첨가함으로써 감소 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 보이든 상공 회의소 주 : 보이든 챔버 분석은 8 ㎛의 공경을 갖는 광 불 투과 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 삽입 시스템을 사용하여 수행된다. <ol><li> 프리 코트를 적어도 30 분 동안 0.1 M PBS에 용해시킨 0.1 % 젤라틴의 500 μl를 첨가하여 필터 인서트 (따라서 보이 덴 챔버를 생성하는 세포 배양 웰 내부 그 착용감). </li><li> 세포 독성 화학 물질에 노출 될 경우, 세포를 수확하기 전에 특정 실험 디자인에 따라 노출. 주 : 세포 / ㎖ DMEM 12.5 μg의 클로 노출시켰다24 시간 동안. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 수확 EEC는 카운팅 셀 챔버를 이용하여 세포 수를 확인하고. 참고 : 자동 계산 장치를 사용할 수 있지만,주의하여 사용되어야한다 : 수동 세포 계수가 더 정확하며 강력히 추천된다. </li><li> 보이든 챔버의 하부 챔버 구획에 500 μL 세포 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 상부 챔버 구획에 필터를 삽입 당 500 μL 세포 배양 배지에서 정확히 10 4 EEC를 추가합니다. 거품을 제거합니다. </li><li> 정확히 8 시간 동안 인큐베이터에서 필터 삽입을 품어. </li><li> PBS로 한번 씻어 세포 고정 용 25 분 동안 두 구획에 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 매체를 교체합니다. 광범위하게 필터를 세척하지만 0.1 M PBS로 3 회 이상. </li><li> 메스와 점막을 절제. </li><li> 핵 stainin에 대한 DAPI를 포함하는 설치 매체와 함께 두 개의 유리 커버 전표 사이의 막 마운트G. 방향에주의를 기울이십시오. 멤브레인의 낮은 구획쪽으로 마이그레이션 만 세포가 계산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 400X 배율 형광 현미경으로 막의 하부 구획실쪽으로 이주 셀 개수. 마이그레이션 세포 (그림 1A, 1B)와 막 모공을 혼동하지 마십시오. 생물 복제의 적절한 수 (조건 당 적어도 3 생물 복제)을 조사합니다. </li></ol> 4. 상처 치유 분석 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 라이브 세포 이미징에 적합한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 4cm의 유리 바닥 배양 접시에 적합) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 않습니다. </li><li> 멸균 10 μL 피펫 팁 단일 층을 긁어. 접시 표면에 너무 많은 압력없이 부드럽게 끝을 누르고 분리 된 세포를 제거하기 위해 0.1 M PBS로 세포를 두 번 other.Wash 한 측에서 원활하게 직선으로 이동합니다. </li><li> 배양 접시에 매체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 해당되는 경우, 조사해야 화합물을 추가합니다. 주 : 1.5 mL를 함유하는 배지 15 NG / ㎖ 알파 리놀렌산을 첨가 하였다. </li><li> 라이브 세포 이미징 할 수있는 현미경으로 배양 접시를 탑재합니다. 이산화탄소 5 %, 37 ° C와 가습 분위기를 확인합니다. 주 : 가습 매체 증발을 방지하는 것이 특히 중요하다. </li><li> 10 분 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 큰 파일 크기에 대한 계획. 주 : 512 X 512 픽셀의 해상도가 충분합니다; 그러나, 우리는 적어도 1,024 X 1,0의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다(24). </li><li> 오픈 소스 소프트웨어 (예를 ImageJ에) 현미경 구비 길이 소프트웨어 도구를 사용 = 24 시간 t = 0에서 시간 t와의 갭 폭을 측정하거나 사용한다. 참고 : 일반적으로 특정 이미지 수집 및 분석 소프트웨어의 제조업체에서 제공합니다. 따라서, 소프트웨어의 사용에 대한 기술적 인 세부 사항은 설명서를 참조하십시오. </li></ol> 5. 셀 추적 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 적합한 세포 배양 장치에 보충 DMEM에 5 × 104 EEC 시드 (예, 24 멀티 웰 플레이트), 37 ° C, 1-2 일 동안 95 %의 습도에서 5 % CO 2 세포를 배양. </li><li> 세포는 80까지 성장하는 경우%의 합류는, 각각의 시험 물질의 존재의 미디어와 문화를 새로운 매체를 사용하여 세포를 제거 (예를 들어, 12.5 μg의 클로 람 부실 / ㎖ DMEM). 항상 (개별 분석 시스템에 따라 24 시간)에서 일정 시간 동안 37 ° C에서 (용매, 예를 들면, 에탄올로 처리) 대조군 세포를 포함한다. </li><li> 라이브 세포 이미징 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도) 가능한 현미경 배양 접시를 탑재. 미리 정의 된 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 10 분 간격으로 화상을 취득. </li><li> ImageJ에 플러그인 MTrackJ를 사용하여 수동으로 EEC의 추적을 수행합니다. 시야에서 무작위로 10 셀을 선택하고이 MTrackJ의 명령을 &quot;추가&quot;를 사용하여 시간에 포인트 당 데이터 포인트를 추가하여 그들의 움직임을 추적 할 수 있습니다. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ가에서 무료로 사용할 수 있습니다 및 ImageJ에는 availab입니다 참고 :[Rasband, ImageJ에. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]에서 제작 :. MTrackJ 플러그인에 대한 상세한 매뉴얼은 &quot;http://www.imagescience.org&quot;에서 확인할 수있다. 6. 라이브 세포 이미징 / 미토콘드리아 막의 평가 가능성 <ol><li> 적절한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 라이브 세포 이미징에 적합한 4cm의 유리 바닥 페트리 접시) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 마십시오. </li><li> 해당되는 경우, 화학 물질로 세포를 노출. 참고 : 세포는 24 시간 동안 12.5 μg의 / ㎖의 클로 람 부실에 노출되었다. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 테트라 메틸에 DMSO (TMRM)의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다. 주 : 원액 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> (: 1000 희석 1) 10 μM의 농도로 작동 용액 세포 배양 배지에 원액을 희석. 빛으로부터 보호가능한 한 빨리 사용한다. 주 : 작업 용액은 몇 시간 (&gt; 1 시간) 동안 실온에서 유지 될 수 있지만, 새로운 작동 용액의 조제 추천된다. </li><li> 1ml의 신선한 세포 배양 배지 (로딩 용액)로 작동 용액 2 μl를 추가. </li><li> 로딩 용액으로 세포 배양 배지로 대체하여 세포를로드. 37 ° C, 5 % CO 2 및 가습 분위기 (배양기)에서 15 분 동안 인큐베이션. 주의 : 거의 모든 형광 지표는 시간이 지남에 살아있는 세포 내 보낸; 따라서 오랜 로딩 또는 지연 분석을 피하십시오. </li><li> 세척하지 않고, 살아있는 세포 이미징에 적합한 현미경으로 접시를 놓습니다. 중요 : 형광 지표 따라서, 불필요한 빛 노출을 방지, 빛에 매우 민감하다. </li><li> 다른 이미지 사이의 비교를 위해 획득 파라미터를 변경하지 않고 이미지를 획득. </li></ol>

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독성 화학 물질에 대한 피부 노출은 종종 심한 상처 치유에 장애를 초래한다. 기본 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 상처 치유는 서로 다른 단계 (지혈, 염증, 증식 및 리모델링)로 구성된 복잡한 과정이다. 세포 이동은 그러나, 육아 조직의 형성에 가장 중요하고, 모든 단계에 관여한다. 여기서, 새로운 혈관은 혈관 형성 또는 angio- 의해 하나 형성된다. 두 과정은 전구체 및 초기 내피 세포의 영향을받지 이동이 필요합니다. 세포 이동 및 방해 세포의 이동에 대한 기본 메커니즘을 명확히의 평가는 독성 물질에 의한 상처 치유 질환에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 관련이있다. 세포 이동은 다른 방법에 의해 평가 될 수있다. 일반적으로 사용되는 기술은 원래 항체 antig를 분석 도입 된 Boyden 챔버 에세이 인EN은 백혈구 (13)에 화성을 일으키는 원인이되었다. 이 분석은 화학 유인 물...

세포 이동은 피부 손상 후 개발, 각종 질병 및 상처 치유 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에 중요하다. 피부 손상에 따라, 염증은 손상 또는 괴사 조직과 육아 드라이브를 예비 상처 봉합을 제거하고 혈관 생성을 통해 새로운 모세 혈관의 네트워크 형성 (소설 형성) 또는 혈관 신생 (기존 소포의 발아) 1-3 수 있습니다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 이동을 필요로한다. 혈관의 네트워크가 증가하는 궁극적 각질화를 받아야 각질 세포 증식에​​ 산소와 영양분을 운반하는 것이 필수적이며, 새로운 상피를 형성하고 상처 봉합을 제공한다. 내피 세포의 손상 마이그레이션 장애 4,5 상처 치유의 근본 원인이다. 초기 내피 세포의 따라서, 방법을 평가하기 위해 마이그레이션 pathophysiol을 탐구하는 데 필요한세포 이동이 ogy 질환 및 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인한다. 알킬화제 (예를 들면, 황 및 질소 머스타드)에 피부 노출 장애 (6) 상처 치유됩니다. 이러한 화합물로 인해 정치적으로 불안정한 지역과 비교적 간단한 합성의 기존 비축에 강한 우려에 대한 이유를 20 세기에 여러 갈등 화학 전쟁 에이전트로 사용 남아 있었다. 황 머스타드 먼저 1822 년 합성되었지만, SM 노출의 분자량과 임상 병리학 상세히 이해되지 않고 SM 노광용 해독제가 확인되지 않았다. 몇몇 연구는 이해하고 SM 노광 후에 손상된 상처 치유를 모델링하고 그 효과를 확보 할 수있는 잠재적 후보 화합물을 시험하기 위해 수행되었다. 슈미트 외. (2009) 클로 람 부실의 영향, 양해 각서 (MOU)에 SM과 유사한 특성을 가진 알킬화 화합물을 테스트SE 배아 체 모델 및 혈관 형성 7 극적인, 때때로 99 % 이상의 감소를 알았다. 이 부작용은 대부분, 생리 학적 조건 하에서, 증식 및 혈관 내피 전구 세포의 이동에 의해 지배된다 개발 단계에서 두드러졌다. 따라서, 이들 세포는 알킬화제에 특히 민감한 것으로 확인되었다. Steinritz 외. (2010)에, 마우스 배아 체 모델에서 특히 SM 독성을 감소시키는 그들의 능력에 대하여 특히, N- 아세틸 시스테인 (NAC)과 알파 리놀렌산 (ALA)에서 반응성 산소 종 (ROS)의 청소부 테스트 혈관 형성 (8)를 복원합니다. 임시 보호 효과는 과도한 활성 산소의 형성은 상처 치유에 SM의 부작용에 ​​기여할 가능성이되었음을 나타내는, 관찰되었다. 이러한 효과는 영구 없었고 두 후보 화합물은 장기 8에서 혈관 형성 및 상처 치유를 복원 할 수 없을 수도있다. HoweveR, 그 실험은 세포 이동의 조사를 허용했다 복잡한 3D 모델에서 실시 하였다. 따라서, 우리는 이후 용기 (9)의 형성 과정에서 중요한 역할을 EEC의 세포 이동에 대한 유익한 효과에 대한 ALA NAC 및 시험. 또한, 셀 극성 세포 이동을 위해 필요하다는 증거가있다. ROS의 형성으로 이어지는 미토콘드리아 기능 장애 세포 극성을 저해하는 것으로하고, 따라서 악영향 세포 이동에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 미토콘드리아 기능에 관한 라이브 세포 이미징을 수행하고, ROS 제거제의 효과를 조사 하였다. 다음 프로토콜은 EEC, 보이든 챔버 분석, 세포 추적 분석 및 세부에서 미토콘드리아 기능의 평가 TMRM의 사용을 포함하여 분석 상처 치유의 재배에 대한 일반 요구 사항에 대해 설명합니다. EEC 재배 및 마이그레이션을위한 실험 프로토콜의 중요한 측면이 강조된다.

<table><tbody><tr><td>보이든 챔버&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC) 처리 인서트, 24 well - 3 &micro; m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC) 처리 인서트, 24 well - 8 &micro; m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td>와 함께 사용)상처</tr><tr><td>&nbsp; 치유 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>미토콘드리아 전위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>평가 TMRM (테트라메틸로다민 메틸 에스테르)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

(황 및 질소 겨자 등의 알킬화 화학 전쟁 에이전트 포함) 화학 물질에 노출되면 상처 치유 장애를 포함하여 임상 증상의 과다 발생합니다. 상처 치유의 생리 학적 과정은 매우 복잡하다. 어느 혈관 생성을 통한 (신규 형성) 또는 혈관 생성 (기존 용기의 돋) - 육아 조직의 형성은 예비 상처 봉합의 결과 및 새로운 모세 혈관의 네트워크가 제공하는이 과정에서 중요한 단계이다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 기능, 지시 마이그레이션을 필요로한다. 따라서, 초기 내피 세포 (EEC) 이전의 조사는 잠재적으로 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인 장애를 치유 화학 물질에 의한 상처의 병태 생리를 이해하고하는 것이 중요하다. 우리는 에이전트 노출을 알킬화 후 손상된 상처 치유를 평가하고, TR에 대한 잠재적 인 후보 화합물을 테스트eatment. 우리는이 프로토콜에 설명 된 기법들을 사용 하였다. 수정 된 보이든 챔버는 정량적 EEC의 chemokinesis 설명한다보고자 하였다. 더욱이, 정 성적으로 마이그레이션을 평가하기 위해 트랙 분석과 조합하여 분석 상처 치유의 사용이 예시된다. 마지막으로, 우리는 교란 된 세포 이동의 기본 메커니즘을 식별하는 미토콘드리아 막전위의 조사 TMRM 형광 염료의 사용을 입증한다. 다음 프로토콜은 EEC의 조사를 위해 적응 된 기본 기술에 대해 설명합니다.

알킬화제에 대한 피부 노출은 홍반, 수포 형성 및 상처 치유 장애와 관련된 피부 궤양을 유발. 상처 치유는 내피 세포의 이동을 기반으로 angio- 및 혈관 생성을 필요로한다. 정량적 마이그레이션 된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 평가 될 수있다. 알킬화제 클로 람에 EEC의도 1c에 도시 한 바와 같이 노광시에 세포 이동 (9)에 상당한 감소 결과. 직접 24 시간 동안 클로 람 부실에 노출 된 후 활성 산소 폐품 알파 리놀렌산 (ALA)의 추가는 상당히 거의 제어 수준으로,이 표현형을 구출. 보이든 챔버 분석 마이그레이션 셀의 수 (양)를 평가하기에 적합한 도구이다. 그러나, 분석은 세포의 이동 동작에 대한 정보를 제공하지 않습니다.이 그림은 노출되지 않은 EEC 상처와 치유 엉덩이에 격차를 할 수 있는지 보여줍니다24 시간 9 내 님. 대조적으로, 알킬화제의 클로 람...

조기 내피 세포(EEC) 이동에 대한 조사는 특정 질병의 병태생리학을 이해하고 잠재적으로 치료 개입을 위한 새로운 전략을 식별하는 데 중요합니다. 다음 프로토콜은 EEC 조사에 맞게 조정된 세포 이동을 평가하는 기술을 설명합니다.

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

다음 실험의 전반적인 목적은 다양한 이동 분석법을 사용하여 독성 화학 물질이 혈관 내피 세포 이동에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 우선, 다음 실험에서는 변형된 회피 챔버 분석법을 사용하여 노출된 내피 세포의 화학 운동성을 조사하는 방법을 시연합니다. 이후 세포 추적 기술과 결합된 상처 치유 분석법을 통해 세포 이동 역학에 대한 추가적인 심층 정보를 제공합니다.최종 분석에서는 내피세포 이동 저해의 근본적인 메커니즘을 확인하기 위해 미토콘드리아 막 전위를 조사하는 과정을 보여줍니다. 궁극적으로, 이러한 이동 분석은 고독성 알킬화제가 미토콘드리아 막 전위와 내피세포 이동에 미치는 영향을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법들은 고독성 화학 물질로 인해 유발되는 상처 치유 장애 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 해당 절차는 저희 실험실의 기술자인 ramat, voer 및 Stefan Miller가 시연할 것입니다. 세포 배양 플라스크를 준비하려면, 멸균된 세포 배양 플라스크 바닥을 겨우 덮을 정도의 충분한 양의 갓 준비한 젤라틴을 추가하는 것으로 시작하십시오.플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 최소 30분 동안 둡니다. 그런 다음 남은 젤라틴 용액을 제거하고, 세포가 sub confluence 상태에 도달했을 때 배아 줄기 세포 유래 초기 내피 세포(EEC)를 세포가 80% confluence가 될 때까지 배양하기에 충분한 양의 배지와 함께 옮깁니다. 배지를 제거하고 PBS로 세포를 헹군 다음, 25 square centimeter당 1 mL의 Accutane으로 2분에서 10분 동안 배양합니다.세포가 떨어지면, Boyden chamber 분석을 이용한 내피세포 이동 분석을 위해 신선한 배지에서 1:5 비율로 분할하십시오. 필터 인서트를 갓 준비한 0.1% 젤라틴 500 µL로 사전 코팅합니다. 앞서 설명한 대로 EEC를 회수한 후, 세포 수를 측정하고 Boyden chamber의 하부 챔버에 세포 배양액 500 µL를 추가하십시오.다음으로, 각 필터에 배지 500 µL에 희석한 1 × 10⁴ EEC를 정확히 첨가합니다. 그 후 기포를 제거하고, Boyden chamber를 인큐베이터에 넣고 정확히 8시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 필터를 PBS로 1회 세척합니다.그 후 20분이 지나면 두 구획 모두에 4% 파라포름알데히드 0.5 milliliters를 첨가하여 세포를 고정합니다. 0.1 molar PBS로 필터를 최소 3회 세척하고 메스로 막을 절제합니다. DPI가 첨가된 마운팅 용액을 사용하여 각 막을 두 개의 유리 커버슬립 사이에 마운팅합니다.필터의 방향에 주의하여 기록하십시오. 그런 다음 400배 배율의 형광 현미경을 사용하여 하부 챔버로 이동한 세포만을 계수합니다. 이때 기공을 이동 세포와 혼동하지 않도록 주의하십시오.상처 치유 분석(wound healing assay)을 시작하려면, 80% 합류도(confluent)의 EEC 배양 접시 표면에 멸균된 10 µL 피펫 팁을 대고 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝까지 부드럽고 직선으로 밀어 세포를 수동으로 제거합니다. 분리된 세포를 제거하기 위해 플레이트를 0.1 M PBS로 두 번 세척합니다. 그 후, 관심 화합물이 첨가된 배지를 배양 용기에 넣습니다.그다음 세포 배양 조건에서 라이브 셀 이미징이 가능한 현미경에 배양 접시를 거치하고, 이미징 세션 종료 시 최소 10 24 by 10 24 해상도를 사용하여 24시간 동안 10분 간격으로 타임랩스 이미지를 획득합니다. 적절한 소프트웨어 도구를 사용하여 0시간과 24시간 시점의 간격 너비를 측정함으로써 세포 추적 분석을 수행합니다. 이미지 시퀀스를 Image J로 가져온 후 MT track J Image J 플러그인을 활성화합니다.그런 다음 add 명령어를 사용하여 시야 내에서 무작위로 10개의 세포를 선택하고, 24시간의 이미징 기간 동안 세포의 이동을 수동으로 추적합니다. measure 명령어를 사용하여 결과를 표시합니다. 그 후 movie 명령어를 사용하여 트랙을 내보내고, 관심 있는 실험 화합물로 처리한 후 세포의 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 위해 세포 배양액을 신선한 세포 배양액 1 mL에 갓 제조한 TMRM 2 µL로 교체합니다.배지를 제거한 후 세척 없이 즉시 디쉬를 현미경 아래에 놓고, 획득 파라미터를 변경하지 않은 상태에서 대조군과 실험 처리된 세포의 이미지를 얻습니다. 서로 다른 그룹 간의 비교 가능성을 보장하기 위해, 상처 치유에는 혈관 신생이 필요하며 이는 그래프에 나타난 바와 같이 내피 세포의 이동에 의존합니다. EEC를 알킬화제인 Chlorambacil에 노출시킨 결과, Boyden chamber assay로 측정한 세포 이동이 유의하게 감소했습니다. 24시간 동안의 Chlorambacil 노출 직후에 활성 산소종(ROS) 제거제인 alpha-linolenic acid를 첨가하면, 해당 표현형이 거의 대조군 수준까지 유의하게 회복됩니다.그러나 Boyden 챔버 분석으로는 이 대표적인 상처 및 치유 분석에서 세포의 이동 행동에 관한 정보를 얻을 수 없습니다. 노출되지 않은 EEC는 24시간 이내에 간극을 메울 수 있었으나, chlorambacil 처리된 EEC는 그렇지 못했습니다. 또한, 개별 EEC의 세포 추적 결과, chlorambacil에 노출된 세포는 움직임이 거의 없었으며, 이는 ROS 제거제로 처리한 후 회복되었습니다.실제로 chlorambacil에 노출된 EEC는 TMRM 발현의 결핍에서 알 수 있듯이 미토콘드리아 막 전위의 붕괴를 나타냅니다. 그러나 ROS 소거제로 EEC를 처리하면 이러한 미토콘드리아 손상이 방지되어 미토콘드리아 막 전위가 유지되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 스크래치 상처 분석법(scratch wound assay)을 이용한 변형된 point-in-chamber assay를 통해 화학적으로 교란된 내피세포의 이동을 분석하는 방법과 미토콘드리아 막 전위를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 뇌실주위 내피 세포(PVEC)의 화학인력 신호에 대한 반응으로 뉴런 간 이동을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 인터뉴런은 중앙 구획에 배치되며, PVEC와 대조 세포는 양쪽에 있습니다. PVEC로의 이주가 증가하면 화학인력 신호에 대한 긍정적인 반응을 나타냅니다.

뇌실주위 내피 세포의 화학매력 신호에 대한 인터뉴런 반응 평가

우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

학습하세요 유해 화학 물질에 노출된 후 내피 세포 이동을 평가하는 방법을 알아보세요. 수정된 보이든 챔버 분석, 상처 치유 분석 및 세포 추적을 사용하여 세포 이동 역학과 미토콘드리아 막 전위 변화를 연구합니다.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

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