하이브리드 μCT-FMT 및 촬상 화상 해석

형광 매개 단층 촬영(Fluorescence mediated tomography)은 형광 분포를 정량적으로 평가할 수 있는 고감도 영상 기술입니다. 마취된 마우스의 경우, 혈관 신생, 세포 사멸, 염증 등을 영상화할 수 있는 다양한 표적 형광 프로브를 사용할 수 있습니다. 본 영상에서는 본 연구소에서 FMT와 Micro CT를 이용한 하이브리드 영상 촬영이 어떻게 수행되는지 보여드리겠습니다.

첫 번째 장인 장치 부분에서는, 저희의 F-M-T, 즉 형광 분자 단층 촬영(fluorescence molecular tomography)에 대해 설명하겠습니다. 단층 촬영이란 3D 이미지가 생성됨을 의미합니다. FMT는 생쥐의 체내 형광을 영상화하는 데 매우 민감합니다.

이제 FMT의 내부를 보여주기 위해 전면 패널이 열려 있습니다. 하단에는 2D 서버에 장착된 레이저가 있습니다. 레이저는 부분적으로 투명한 마우스 베드에 고정된 마우스 내부로 빛을 방출합니다.

마우스 베드 위에는 대체 광원으로서 LED 어레이가 배치되어 있어, FMT를 일반적인 반사 이미지 장치로 작동시킬 수 있습니다. 필터 휠은 렌즈 아래에 장착되어 있으며, 이 렌즈는 장치 상단의 검출기로 빛을 포착합니다. 이것이 저희의 micro ct입니다.

마이크로 CT에는 두 개의 X선 튜브와 두 개의 평판 검출기가 장착되어 있어 듀얼 에너지 스캔 획득이 가능합니다. 제2장, 마이크로 CT FMT 스캔 프로토콜. FMT와 마이크로 CT 모두 마우스 영상 촬영을 위해 제작되었으며, 촬영 전 마우스는 이소플루레인으로 마취됩니다.

FMT 스캐닝을 위해 마우스의 털을 제거해야 하며, 이때 제모 크림을 사용하면 효과적입니다. 일부 마우스 계통은 제모 크림으로 인해 발진이 발생할 수 있습니다. 따라서 마우스의 피부 변화를 관찰하고, 필요한 경우 수의진에게 연락하여 조치를 받을 것을 권장합니다.

또한, 우선 새로운 마우스 계통의 소수 개체군을 대상으로 내성을 테스트하십시오. 저체온증을 방지하기 위해 마우스를 가열 패드 위에 놓습니다. 조영제를 주입하기 위해, 크기가 작으므로 꼬리 정맥에 카테터를 삽입합니다.

이 과정은 상당히 까다로우며 어느 정도의 숙련도가 필요합니다. 카테터로 혈액이 역류한다면 카테터가 적절하게 배치된 것입니다. 용량 과부하를 방지하기 위해 형광 조영제와 CT 조영제를 주입할 수 있습니다.

최대 체중 kg당 5 mL를 주입해야 하며, 이는 30 g 생쥐의 경우 150 µL에 해당합니다. 스캐닝을 위해 생쥐를 다중 모드 생쥐 베드 내부에 배치합니다.

식별을 위해 마우스 꼬리에 일부 기호가 표시되어 있을 수 있습니다. 몸통에 이러한 표시를 하는 것은 광학 스캐닝에 영향을 줄 수 있으므로 피하는 것이 중요합니다. 마우스 베드를 닫고 깊이를 조절하여 마우스가 고정된 위치에 단단히 고정되도록 합니다.

마우스의 호흡을 주의 깊게 관찰하십시오. 베드를 너무 세게 조이면 마우스가 질식할 수 있습니다. 누드마우스는 면역 억제 특성 때문에 종양 연구에 흔히 사용됩니다. 누드마우스가 털이 없는 것은 유전자 변이로 인한 유용한 부작용입니다.

따라서 힘들게 털을 제거하는 과정을 생략할 수 있습니다. 마우스가 적절하게 호흡하는지 확인해야 하며, 필요한 경우 마우스 베드를 그에 맞게 조정해야 합니다. 그런 다음 마우스 베드를 micro ct 내부에 배치합니다.

장치 내부의 가스 흐름을 유지하기 위해 ISO 불소 가스를 운송하는 튜브를 전환합니다. 그런 다음, X선 차폐가 가능하도록 micro C를 닫습니다. 덮개가 닫혀 있어야만 micro C의 스캐닝이 시작됩니다.

micro CT의 버튼을 사용하여 마우스를 micro CT 내부로 진입시킬 수 있습니다. micro CT 제어 컴퓨터에서 토포그램(topogram)을 획득하여 화면에 표시하고, 마우스를 더 잘 관찰할 수 있도록 윈도잉(windowing) 설정을 조정합니다. 하나 이상의 ZUP 스캔을 설정할 수 있으며, 해당 위치는 연한 파란색 영역으로 표시됩니다.

일반적으로 1~3회의 ZUP 스캔이면 충분합니다. 스캔을 시작하면 진행 상황이 진한 파란색 진행 표시줄로 나타납니다. 본 장비의 flat panel micro CT는 임상용 spiral CT와 달리 ZUP 스캔을 순차적으로 수행합니다.

버튼을 사용하여 마우스 베드를 전면으로 이동시킵니다. 다시 차폐 덮개를 열고 마취 튜브를 교체합니다. 홀더를 마우스 베드에서 조심스럽게 분리하고 마취 튜브를 뽑아냅니다.

AN과 FMT는 이 작은 튜브에 의존하지 않기 때문에 이 과정이 필요합니다. 대신 FMT 내부의 작은 챔버에 마취 가스를 가득 채웁니다. 이제 마우스가 놓인 마우스 베드를 FMT로 가져와 FMT 제어 컴퓨터에 삽입합니다.

스캐닝 시야와 샘플링 밀도를 조정합니다. 일반적으로 약 120개의 포인트가 사용됩니다. 버튼을 누르면 스캔이 시작됩니다.

FMT의 첫 번째 패스에서는 각 레이저 광원 지점에 대한 투과 조명 또는 여기 이미지를 획득합니다. 이 영상에서는 배속 모드로 보여지지만, 일반적으로 약 5분이 소요됩니다.

상체는 하체에 비해 통과하는 빛의 양이 훨씬 적은 것을 볼 수 있습니다. 이는 심장, 간, 신장과 같이 상대적 혈액량이 많은 장기들이 상체에 더 많이 분포해 있기 때문입니다. 혈액은 근적외선의 주요 흡수체입니다.

두 번째 패스에서는 다른 필터를 사용하여 동일한 소스 포인트들을 스캔하며, 이 필터는 형광광선만 통과시킵니다. 제3장, 인터랙티브 오일 및 분할. 두 장치에서 얻은 데이터를 융합하기 위해 마우스 베드에 내장된 마커가 사용됩니다.

마커는 FMT로 획득한 반사 이미지에서도 확인 가능합니다. 마커는 실제로는 단순한 구멍이며, 형광 물질이나 CT 조영제를 채울 필요가 없습니다. 본 연구소에서는 마커 검출 및 융합을 자동으로 수행하는 소프트웨어 프로그램을 개발하였습니다.

최근 Theranostics에 발표된 논문에서 설명한 바와 같이, micro CT 데이터를 사용하여 마우스의 형태와 불균일한 흡수 및 산란 맵을 자동으로 추정합니다. 이러한 매개변수들은 정량적 형광 재구성에 중요합니다. 형광의 생체 내 분포를 측정하기 위해서는 장기 분할이 필요합니다.

다음 과정에서 본 연구소에서 개발한 imulitic preclinical이라는 소프트웨어를 사용하여 이러한 분할을 대화식으로 생성합니다. 이러한 분할 과정은 배속으로 표시되며, 숙련된 작업자는 약 10분에서 20분 정도에 수행할 수 있습니다. 먼저 CT 데이터 세트를 로드합니다.

ISO 표면 렌더링을 사용하여 3D로 검사할 수 있습니다. 윈도잉 설정을 변경하여 ISO 값을 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 베드와 함께 마우스 전신의 뼈를 시각화하려면 오버레이를 로드합니다.

이 예시의 신호는 방광에서 나타납니다. 이제 해부학적 분할에 집중하기 위해 오버레이 시각화를 끕니다.

네이티브 microt 스캔에서 폐는 다른 연조직과 강한 음성 대조를 이루기 때문에 쉽게 찾을 수 있습니다. 폐 내부의 커다란 구조물은 심장입니다. 먼저 폐 영역을 분할해 보겠습니다.

특정 값 미만의 모든 복셀은 임계값 설정(thresholding)을 통해 분할됩니다. 이는 녹색으로 표시됩니다. 폐는 연결된 영역이므로 채우기(filling) 연산을 사용하여 분리할 수 있습니다.

페인트 버킷 도구와 유사한 방식입니다. 페인팅 프로그램에서와 같이, 컷팅(cutting)과 필링(filling) 작업을 통해 폐에서 기관지를 분리할 수 있습니다. 방광과 같은 볼록한 장기는 장기의 경계를 따라 스크리블(scribbles)을 그려 세그멘테이션할 수 있습니다.

충분한 정확도에 도달할 때까지 더 많은 스크리블(scribbles)을 추가합니다. 장과 같은 비볼록(non convex) 장기는 부분별로 분할할 수 있습니다. 간은 균질한 영역으로 나타나며 더 복잡한 구조를 가지고 있습니다.

여러 개의 엽으로 구성되어 있으므로, 분할 결과를 디스크에 저장한 후 프로그램으로 불러올 수 있습니다. 이러한 분할 데이터를 사용하여 형광 신호를 각 장기에 할당할 수 있습니다. 프로그램은 이러한 양을 계산하여 별도의 시트로 저장합니다. 종단적 스캔의 경우, 대개 간격이 너무 길어 마우스를 고정된 위치에서 계속 마취 상태로 유지할 수 없으므로 각 시점마다 분할을 다시 수행해야 합니다.

따라서 많은 수의 마우스와 다수의 시점이 포함된 경우 세그멘테이션은 매우 힘든 작업이 됩니다. 결과를 정량화하려면 오버레이와 세그멘테이션 파일을 로드하십시오. 'Batch settings'를 클릭하여 프로그램이 현재 설정을 기억하도록 설정하십시오.

이제 일괄 통계(batch statistics)를 클릭하여 모든 micro CT FMT 스캔의 모든 영역에 대한 값을 계산하도록 프로그램에 명령하십시오. 이 작업은 몇 초 정도 소요됩니다. 그러면 통계 결과가 하나의 스프레드시트 파일로 저장됩니다.

사용자가 수십 개의 파일을 직접 병합할 필요가 없으므로 편리합니다. 이 파일을 바탕으로 장기 곡선을 계산할 수 있습니다. 4장, 대표 결과입니다.

퓨전이 제대로 작동하는지 테스트하기 위해 aros 팬텀을 사용하였습니다. 산란을 위해 티타늄 산화물 분말을 일부 첨가하였습니다. 불규칙한 모양을 구현하기 위해 일부 부분을 절단하였습니다.

형광 및 CT 조영제로 채워진 여러 개의 작은 봉입물을 팬텀 내에 제작하였습니다. FMT는 물체의 실제 모양을 알지 못하고 단순화된 모양으로 가정하기 때문에, 불규칙한 모양의 물체에 대해서는 재구성 정확도가 떨어집니다. 따라서 마이크로 시티(micro city) 데이터에서 도출된 모양을 이용하는 또 다른 재구성 방법을 구현하였습니다.

보시는 바와 같이, 팬텀 내의 신호 국소화가 훨씬 더 우수합니다. 생체 내 데이터를 확인하기 위해, 영상 촬영 시점별로 살펴보겠습니다. 이것이 사전 스캔 영상입니다.

현재 보이는 것은 기본적으로 노이즈와 아티팩트뿐입니다. 주입 후의 다음 시점으로 이동하면 훨씬 더 많은 신호가 보이지만, 윈도잉(windowing) 설정이 너무 강하게 잡혀 있습니다. 윈도잉 대화 상자를 사용하여 윈도잉 설정을 조정할 수 있습니다.

대부분의 신호가 방광에서 관찰됩니다. 주사 후 0.2시간이 지난 다음 시점으로 넘어가면, 마우스 외부에서 일부 신호가 보입니다. 이는 마우스가 마우스 베드 위에 형광 물질이 포함된 소변을 보았기 때문입니다.

윈도잉을 추가로 조정하면 척추와 무릎에서 일부 신호를 확인할 수 있습니다. 이제 주사 후 0.4시간 시점으로 이동해 보겠습니다. 소변에서의 신호는 이제 사라졌으며, 주사 후 다음 시점인 6시간과 24시간에서도 척추와 무릎에서 형광이 관찰됩니다. 동일한 결과가 나타나는 것을 볼 수 있습니다.

이제 다음 코로 넘어가 보겠습니다. 이 윈도잉 설정을 사용한 사전 스캔에서는 아무것도 나타나지 않습니다. 주입 15분 후의 스캔에서는 강한 방광 신호 등이 관찰됩니다.

본 연구에서 우리는 이 프로브의 빠른 신장 배설의 결과로, 주입 직후 방광에서 높은 농도가 나타나는 것을 확인하였습니다. 또한, 척추의 신호는 빠르게 상승하며 이후의 영상 촬영 시점 동안 비교적 안정적으로 유지됩니다. 제5장, 결론.

결론적으로, 본 연구에서는 형광 영상, 분자 단층 촬영 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영의 장점을 결합한 다중 모드 영상 프로토콜을 제시합니다. 해부학적 micro CT 데이터는 마우스의 형태를 활용함으로써 형광 재구성의 정밀도를 높여줍니다. 또한, 이는 영상 데이터에서 정량적 측정값을 추출하는 데 필요한 장기 분할 영상을 생성하는 데 유용합니다.