Name: 세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 배우세요 인간 호중구에서 고처리량으로 세포 외 DNA 릴리스 및 NET 형성을 정량화하는 방법을. 이 기법은 염증 질환 연구와 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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인간 호중구 분리 작업을 지속적으로 지원해 주신 조지아 대학교 보건 센터 실험실 직원들에게 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 UGA 연구 담당 부사장실에서 제공한 Dr. Rada의 창업 기금으로 지원되었습니다.

조지아 대학의 임상 시험 심사위원회는 건강한 지원자 (UGA 번호 2012-10769-06)에서 말초 혈액을 수집하는 인간 대상 연구를 승인했다. 5,7,8 자원 봉사자 혈액 그리기 전에 필요한 정보 동의서에 서명했다. 이 문서에서 수행 된 연구는 헬싱키 선언의 인체를 이용한 의학 연구에 대한 윤리 지침을 준수합니다. 주변 인간의 혈액에서 호중구의 1. 분리 (그림 1) 주 : 말초 혈액 호중구를 분리하는 방법에는 여러 가지가있다. 다음 프로토콜은 하나의 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 외부 자극에 그물을 방출 할 수있는 비 - 활성화 인간 호중구 다수 산출한다. 40 ml의 정맥 천자에 의한 건강한 지원자에서 얻은 전체 혈액을 사용합니다. 7,9 <ol><li> 두 50 ML 원뿔 튜브로 나누어지는 20 ml의 혈액입니다. 10 ml의 6 % 덱스 트란을 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 20 분 이전 백혈구 후에 RIC깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 어떤 펠렛 적혈구를 복용하고, 멸균 PBS로를 작성하지 않고 시간 상위 단계입니다. </li><li> 400 XG에 10 분 원심 분리기. 4 용액에 재현 탁 펠렛은 PBS를 멸균. </li><li> 85 %의 5 단계 퍼콜 구배를 준비 -80 % -75 % -70 % -65 %이 15 ML 원뿔 튜브 및 레이어 2 ㎖의 백혈구 서스펜션의 각 그라데이션의 상단에. </li><li> 브레이크 해제와 함께 30 분 동안 원심 분리기 800 XG. </li><li> 모든 셀 75 % / 80 %에서 레이어 (호중구) 70 % / 75 % 인터페이스를 수집합니다. </li><li> PBS에 두 번 (350 XG, 10 분, RT)을 세포를 씻으과 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li></ol> 마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 세포 외 DNA 자료의 속도론 2. 측정 참고 :이 방법은 막 불 투과성 DNA 결합 96 웰 마이크로 포맷에 DNA 자료를 나타내는 염료 (그림 2)의 형광의 변화를 측정 할 수 있습니다. <ol><li> + 분석 매체에서 호중구의 현탁액 (HBSS 준비2 × 106 세포 / ml의 농도에서 1 % (v / v)의자가 혈청 + 5 mM의 포도당). </li><li> 막 투과성 DNA 결합 염료의 5 μmol / L를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 나누어지는 인간 호중구 (50 μL / 웰) 마이크로 96 웰 블랙, 투명 바닥 위에. 확인 분석 배지를 웰의 전체 바닥을 포함합니다. 그렇지 않은 경우, 측면에 부드럽게 판을 누릅니다. </li><li> 37 ° C에서 10 분간 플레이트 포함 호중구을 따뜻하게. </li><li> 한편 최종 농도의 두 배에 자극의 솔루션을 준비하는 것은 사용되는 (37 ° C 따뜻한 분석 매체에서). 긍정적 인 NET 컨트롤이 최대 NET 자료를 트리거하기 위해 4 시간 동안 100 나노 포르 - 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)와 인간 호중구를 사용할 때 자발적 NET 형성이 낮은 5,8 남아있다. 4 시간 동안 5,8 PMA 자극은 최대 NET 자료를 보장합니다. </li><li> 측정 (4 시간, 37 ° C, 여기에 대한 530 nm의 및 배출을위한 590 ㎚)에 대한 마이크로 형광 계를 준비​​합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 50 μL 호중구 현탁액 50 μL 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극한다. 최대 DNA 해제 신호를 측정하기 위해 잘 한 0.5 μg의 / ㎖ 사포닌을 사용합니다. </li><li> 리더 플레이트를 놓고없이 진탕 매 2 분에서 4 시간 동안 형광의 변화를 측정한다. </li><li> 데이터 분석을 위해, 시간에 따른 형광의 증가 정규화를 계산한다. <ol><li> 사포닌을 포함한 모든 우물 용 엔드 포인트 값에서 빼기 기준 형광 (그림 2A, B). 사포닌 형광 상승이 가장 높은 신호이어야한다. 이것은 &quot;DNA 최대 방출&quot;(도 2A)로 지칭된다. </li><li> 최대 DNA 릴리스 미지 시료의 형광의 증가를 분할하여 미지 시료에서 DNA 방출의 비율을 계산합니다. </li><li> 복제의 평균 결과는 &quot;최대 DNA의 출시 %&quot;(그림 2C)로 제시. </li></ol></li></ol> NET 양식 3. 정량MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험에 의해 ATION 참고 : 우리의 실험실에서이 분석 수정 (MPO-DNA) 또는 설립 (HNE-DNA)를 MPO-DNA와 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량 5. <ol><li> 코트 96 웰 높은 결합 하룻밤 캡처 항체 (50 μL / 웰) 용량 ELISA 플레이트 : 안티 - MPO (1 : 2,000 희석) 또는 안티 HNE (1 : 2,000). </li><li> PBS로 세척 ELISA 플레이트는 세 번 (200 μL / 웰)와 RT에서 2 시간 동안 5 % BSA 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 블록 (200 μL / 웰). PBS로 3 회 세척 할 것. </li><li> 시드 96 웰 마이크로 / 웰로 100 ㎕를 분석 배지 중 100,000 세포의 밀도로 호중구 및 NET 형성을 자극한다. 세포를 품어 : 37 ° C 4 시간. </li><li> 그들을 잘 혼합, 호중구 상층 액 2 U / ㎖ DNase를 추가하여 제한된 DNase의 소화를 수행합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 11 μL 25 밀리미터 EGTA (최종 농도 2.5 mm)를 추가하여 15 분 후 DNase의를 중지합니다. 잘 섞다. 스와 수집청소의 microfuge 튜브 pernatants. 스핀 샘플 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 파편을 제거한다. 청소의 microfuge 튜브에 자신의 상층 액을 전송합니다. 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 이전에 준비 &quot;NET 표준&quot;의 나누어지는을 사용합니다. 주 : NET-표준은 적어도 5 개의 다른 독립적 인 인간 공여자로부터 수득 PMA 자극 호중구의 DNase 소화 상등액의 혼합이다. <ol><li> 오랫동안 동일한 표준을 사용하여 수집하고 각 공여자로부터 호중구 상청액 대량 나누어지는한다. 예를 들어 PMA 자극 호중구의 DNase의 소화 상층 액을 2 ㎖를 수집하는 것은 200 분량 씩 200 ELISA 플레이트에 충분한 (10 μL 각)가 발생합니다. 인터넷 표준을 특성화 데이터는 그림 5에서 발견된다. </li><li> 4 시간 동안 100 nm의 PMA와 인간 호중구를 자극하고 DNase의이 단계 3.4-3.5있어서 자신의 상층 액을 소화 적용됩니다. </li><li> 수집, 수영장, 나누어지는 (10 μL) 무료ZE (-20 ° C) 호중구 상층 액. </li><li> 적어도 5 개의 개별 기증자로부터 획득 한 나누어지는 / 기증자 해동, &quot;표준 NET의&quot;를 준비하려면를 혼합하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 해동 샘플을 취소하고 다음 실험을 위해 신선한 것을 사용합니다. </li><li> PBS + EGTA에서 NET-표준의 2 용액을 희석 : 1을 준비합니다. </li></ol></li><li> DNase1 소화 시료 (표준 및 알 수없는 상층 액) PBS + EGTA 20 배 희석 캡처 항체로 코팅 된 ELISA 플레이트에 그들을 나누어지는. </li><li> 4 ° C에서 밤새 ELISA 플레이트를 품어 PBS로 세 번 씻는다. </li><li> 검출 항체 용액을 적용 (100 μL / 웰) : 말 래 디쉬 퍼 옥시다아제 접합 항 DNA 항체 (1 : 500, 마우스). 어둠 속에서 1 시간 동안 품어. </li><li> PBS와 네 세척 후 TMB 퍼 옥시 다제 기판을 추가 : 100 μL / 웰, 30 분. 블루 착색은 퍼 옥시 다제 활성 (현재 그물)에 대한 표시입니다. </li><li> 잘 100 μL / 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그만큼블루 솔루션은 노란색 (그림 5A)를 설정합니다. </li><li> 마이크로 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li><li> 데이터 분석을 위해, NET 표준에 비해 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 계산한다. <ol><li> 모든 샘플에서 분석 배지의 배경 광 밀도 값을 뺀다. </li><li> 상대 NET 콘텐츠 (Y 축) (도 5a)에 대한 희석하여 표준 시료의 흡광도 값 (X 축)을 그린다. </li><li> 이 표준 곡선의 nonsaturated 범위를 사용하면 (그림 5A) (사용되는 소프트웨어에서 최상의 지수 맞게 사용) 추세선을 설정합니다. 이 추세선 방정식 그물의 양을 양적하기 OD 값의 변환을 결정한다. </li><li> 인터넷 표준 (그림 5A)의 비율로 미지 시료에 그물의 양을 줄 것이다 3.13.3에서 추세 줄 식으로 미지의 측정 된 OD 값을 삽입합니다. </li><li> 계산하다복제 (삼중)의 평균 (그림 5C) &quot;MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체 (표준의 %)의 양&quot;으로 최종 데이터를 제시한다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

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그물 그물의 문학은 지속적으로, 생물학,기구 및 규제에서의 역할에 관한 몇 가지 중요한 질문이 불분명 남아 자신의 발견 이후 지난 10 년에 걸쳐 확대되고 있지만 병원균을 죽인다. 1 호중구하는 매혹적인 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 적절한 방법은 그물이 매우 독특한 항균 메카니즘을 측정하기 위해 개발되어야한다. 이 문서는 높은 처리량 방식으로 그물을 정량하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 첫 번째 분석은 막 불 투과성 DNA 결합 염료의 형광 반응 속도를 다음과 같습니다. 이 분석은 슬로프 및 호중구에서 DNA 방출 속도에 많은 양의 정보를 제공한다. 이 정보는 NET 형성으로 이어지는 초기 신호 이벤트를 연구 조사에 매우 중요합니다. 모든이 정보는 인큐베이션의 끝에 DNA 분리 측정 종료점 분석에서 손실된다. 세포 외 DNA 염료 계 분석은 그물에 특이하지 않다. 이것단지 DNA 자료를 측정한다. 그물을 확인하기 위해 널리 NET-형성 호중구에 면역을 수행하고 과립 마커 (MPO, HNE) 또는 ...

NET 형성은 호중구가 병원체와 싸우는 새로운 메커니즘입니다. 1 NET의 핵심은 핵 DNA입니다. 1 이 DNA 네트워크는 호중구 과립 단백질 및 히스톤과 관련이 있습니다. 1 NET 형성의 주요 형태는 염색질 축합 제거, 과립 및 핵 막의 소실, 호중구 엘라스타아제의 핵으로의 전좌, 히스톤의 시트룰린화, 마지막으로 DNA 기반 NET의 유출을 특징으로 하는 호중구의 사멸을 필요로 합니다. 2 개NET은 다양한 미생물을 포획하고 죽이며 선천성 면역 무기 레퍼토리의 필수적인 부분입니다. 그러나 통제되지 않은 그물 형성은 수많은 자가염증성 질환과 관련이 있습니다. 3,4 관련성이 점점 더 확립되고 있음에도 불구하고 NET 릴리스의 메커니즘과 규정에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 
NET을 방출하여 죽는 호중구는 자가사멸 또는 괴사성 호중구와 다릅니다. 3,5 호NET 방출 호중구는 NET 형성에 특징적인 몇 가지 특징을 보여줍니다. 과립 성분은 NET의 DNA와 관련이 있습니다. 1 개골수과산화효소(MPO)와 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)는 모두 휴지 세포의 1차 과립에서 발견되지만 NET의 DNA에 결합하기 위해 핵으로 전위됩니다. 1 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체는 NET에 특이적이며 자가사멸성 또는 괴사성 호중구에서 발생하지 않습니다. 1,3,5 염색질 축합은 NETosis의 또 다른 전형적인 특징입니다. 2 개NET 릴리스는 또한 펩티딜 아미니다아제 4(PAD4)에 의한 히스톤의 시트룰린화를 필요로 합니다. 6 시트룰린 화 히스톤은 NET 방출을 거친 호중구의 특징입니다. 6
여기서는 높은 처리량 규모로 NET을 정량화할 수 있는 훌륭한 도구를 제공하는 세 가지 방법을 소개합니다. 첫 번째 분석은 다양한 변화가 있는 현장에서 사용되었으며 마이크로플레이트 형식으로 세포 외 DNA 방출을 정량화합니다. 두 번째 및 세 번째 분석은 NET 특이적 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체를 측정하여 NET을 확인합니다.

<table><tbody><tr><td>항인간 호중구 엘라스타제&nbsp; 토끼 Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2,000x 코팅</td></tr><tr><td>Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2,000x 코팅</td></tr><tr><td>DNase-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; 소화에 사용되는 g/ml</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>세포 사멸 감지 ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Eon Microplate 분광 광도계</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 All-in-One microplate 소프트웨어</td><td>Biotek</td><td></td><td>분석 도구(ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0.2% 최종 농도/부피</td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>10mM 최종 농도를 사용합니다.</td></tr><tr><td>1M 포도</td><td>당 시그마</td><td></td><td>는 5mM 최종 농도를 사용합니다.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM 최종 사용</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 50ml</td><td>열과학</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>퍼콜 (pH 8.5-9.5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>염화나트륨, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>덱스트란</td><td>스펙트럼</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 분석 플레이트 블랙 플레이트 투명 바닥</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 외 dna 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 net 형성<em&gt; 체외</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

호중구 과립구는 인간의 혈액에서 가장 풍부한 백혈구입니다. 호중구는 감염 부위에 가장 먼저 도착합니다. 호중구는 식세포작용(phagocytosis), 탈과립화(degranulation) 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET) 형성을 포함한 여러 항균 메커니즘을 개발했습니다. NET은 히스톤으로 장식된 DNA 골격과 골수페록시다아제(MPO) 및 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)를 포함한 여러 과립 마커로 구성됩니다. NET 방출은 호중구의 특징적인 형태학적 변화를 수반하는 능동적인 과정으로, 호중구의 DNA가 세포 외 공간으로 배출되는 과정입니다. NET은 미생물과 싸우는 데 필수적이지만, NET의 통제되지 않은 방출은 여러 질환과 관련이 있습니다. 임상적 관련성과 NET 형성 메커니즘에 대해 자세히 알아보려면 NET 정량 분석이 가능한 신뢰할 수 있는 도구가 필요합니다. 
 여기에서는 in vitro에서 인간 호중구의 NET 방출을 평가할 수 있는 세 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째는 멤브레인 불투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 인간 호중구에서 세포 외 DNA 방출을 측정하는 고처리량 분석입니다. 또한 NET 특이적 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량화할 수 있는 두 가지 다른 방법이 설명됩니다. 이러한 마이크로플레이트 기반 방법을 함께 사용하면 인간 호중구의 NET 형성 메커니즘과 조절을 효율적으로 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 사용할 수 있습니다.

이 원고의 수치. 호중구 격리, 실험 절차 및 데이터 분석의 설명과 함께 현재 대표적인 결과의 방법을 서술 한 인간 호중구 준비의 순차적 인 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 호중구 격리의 하나의 가능한 방법을 나타냅니다. 그것은 자극에 그물을 방출 할 수있는 호중구 휴식의 많은 양을 산출한다. 형광 기반의 DNA 자료 분석의 작동 방식 2는 그림. 인간의 호중구는 웰 (96) 마이크로의 준수에 DNA 자료의 형광 마이크로 플레이트 리더 반응 속도를 사용하여. 그림 3은 데이터 분석의 각 단계를 설명합니다. 먼저, 사포닌 (도 3a)으로 처리 호중구의 최대 DNA 신호를 계산한다. 형광의 증가는 항상 최고 형광 값 및 배경 형광 레벨 (차이로서 계산된다 <strong&gt;도 3a). 이는 각 웰에 대해 계산된다. 이 ...

High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

본 절차의 전체적인 목표는 인간 호중구에서 방출되는 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NETs)을 고처리량 규모로 정량화하는 것입니다. 여기에 제시된 방법들은 인간 호중구 내의 in vitro 호중구 세포외 트랩 형성 기전 및 조절 연구를 통해, 염증 분야의 핵심 질문에 답하고 염증성 질환을 변화시키는 연구에 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 함의는 중심적인 NET 매개 신호 전달 경로와 NET 억제 또는 NET 자극 분자를 식별하는 것을 포함합니다.혈액에서 호중구를 분리하려면, 250 milliliter 원심분리관에 인간 혈액 20 milliliters를 분주합니다. 6% dextran 10 milliliters를 첨가한 후, 가볍게 혼합하고 상온에서 20분 동안 방치합니다. 백혈구가 풍부한 상층액을 깨끗한 50 milliliter 원심분리관으로 조심스럽게 옮기고, 멸균된 PBS를 사용하여 튜브의 윗부분까지 가득 채웁니다.그런 다음 샘플을 400 ×g에서 10분 동안 원심분리하고, 15 mL의 멸균 PBS를 사용하여 펠렛을 재부유시킵니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 215 mL 원추형 튜브에 85, 80, 75, 70, 65%의 5단계 Percoll 밀도 구배를 준비하고, 각 구배 위에 백혈구 현탁액 2 mL를 층층이 쌓습니다.그런 다음, 감속 모드를 끈 상태에서 800 ×g로 30분 동안 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 원심분리가 끝나면 75-80% 및 70-75% 계면 층에 있는 세포를 수집합니다. PBS를 사용하여 세포를 2회 세척한 후, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.세포 외 DNA 방출의 역학을 측정하려면, 어세이 배지에서 밀리리터당 2×10⁶ cells 농도로 호중구 현탁액을 준비하십시오. 막 투과성이 없는 DNA 결합 염료인 SYTOX orange를 5 µmol/L 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 어세이 배지가 웰의 바닥 전체를 덮도록 하여 인간 호중구를 멸균된 96-웰 검정색 투명 바닥 마이크로플레이트에 분주하십시오.그렇지 않은 경우, 플레이트 측면을 가볍게 두드립니다. 플레이트를 37 °C에서 10분 동안 가온합니다. 그동안 37 °C의 분석 배지를 사용하여, 사용할 자극제가 최종 농도의 2배가 되도록 용액을 준비합니다.양성 NET 대조군으로서, 인간 호중구에 4시간 동안 처리하여 최대 NET 방출을 유도할 수 있도록 100 nanomolar의 phorbol myristate acetate(PMA)를 준비합니다. 다음으로, 측정을 위해 마이크로플레이트 형광 분석기를 준비합니다. 50 microliters의 호중구 현탁액에 50 microliters의 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극합니다.최대 DNA 방출 신호를 측정하기 위해, 한 웰에 saponin을 최종 농도 0.5 mg/mL가 되도록 첨가합니다. 플레이트를 리더기에 넣고, 흔들지 않은 상태에서 4시간 동안 2분 간격으로 형광 변화를 측정합니다. 데이터를 분석하려면, saponin을 포함한 모든 웰의 최종 측정값에서 기저 형광값을 빼서 시간 경과에 따른 정규화된 형광 증가량을 계산합니다.사포닌 형광의 증가는 가장 높은 신호여야 하며, 이를 최대 DNA 방출량으로 정의합니다. 반복 실험 결과의 평균을 구하고 이를 최대 DNA 방출량의 백분율로 나타내십시오. MPO-DNA 및 HNE-DNA ELISA 분석을 통해 NET 형성을 정량화하려면, 96-well 고결합 용량 ELISA 플레이트에 항-MPO 또는 항-HNE 캡처 항체를 첨가하고 코팅을 위해 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날 아침, 웰당 200 µL의 PBS를 사용하여 ELISA 플레이트를 3회 세척합니다. 그런 다음 5% bovine serum albumin(BSA) 및 0.1% human serum albumin(HSA) 200 µL를 사용하여 상온에서 2시간 동안 웰을 블로킹합니다. 그동안 96-well 플레이트의 웰당 100,000 cells 밀도로 neutrophil을 100 µL의 assay medium에 분주하고, 자극제를 첨가한 후 37 °C에서 4시간 동안 배양하여 NET 형성을 유도합니다.다음으로, 호중구 상층액에 mL당 2 unit의 DNase를 첨가하여 제한적 DNase 소화를 수행한 후, 잘 섞어 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음, 25 mM EGTA 15 µL를 첨가하여 반응을 중단시키고 잘 섞습니다. 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 수집하고, 실온에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거합니다.제한적 소화를 거치지 않고 NETs를 수집하면 데이터의 일관성이 떨어지게 됩니다. 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 제한적 DNA 소화 단계가 매우 중요합니다. 따라서 DNase I 효소의 농도와 소화 시간을 최적화하였습니다.상층액을 깨끗한 마이크로 튜브에 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 그다음, 이전에 준비한 NET 표준액의 일부를 사용하여 PBS와 EGTA로 1:2 희석액을 준비하십시오. 이제 EGTA가 포함된 PBS를 사용하여 DNase I로 소화시킨 시료를 20배 희석하고, 캡처 항체가 코팅된 ELISA 플레이트에 분주하십시오.플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 플레이트를 3회 세척하기 전, horseradish peroxidase 접합 anti DNA 항체와 같은 검출 항체 솔루션을 웰당 100 µL씩 처리하고 암소에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 4회 세척한 후, TMB peroxidase 기질을 웰당 100 µL씩 첨가하고 30분 동안 배양합니다.푸른색은 peroxidase 활성과 NETs의 존재를 나타냅니다. 반응을 중단시키려면 1 M HCl 100 µL를 첨가하십시오. 푸른색 용액은 노란색으로 변할 것입니다.마이크로플레이트 포토미터를 사용하여 450 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. NET 표준 물질과 비교하여 측정된 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 비교하려면, 모든 샘플에서 배경 광학 밀도를 뺀 후 희석된 표준 샘플의 흡광도 값을 상대적 NET 함량에 대해 도표로 나타냅니다. 이 표준 곡선의 비포화 범위를 사용하여, 사용 중인 소프트웨어의 최적 지수 적합(best exponential fit)을 통해 추세선을 설정합니다.미지의 시료에서 측정된 OD 값을 추세선 방정식에 대입하여, NET 표준물질 대비 미지 시료 내 NETs의 양을 백분율로 구합니다. 마지막으로 반복 실험 값의 평균을 계산하여 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양으로 최종 데이터를 제시합니다. 여기에는 자극을 주지 않았거나 PMA 또는 P-aeruginosa로 활성화시킨 인간 호중구의 형광 기반 DNA 방출 분석법을 통해 얻은 대표 데이터가 나타나 있습니다.P-aeruginosa는 인간 PMN에서 NET 형성을 유발합니다. 이 그래프는 반복 실험 웰의 형광 증가 평균값을 계산하고, 이를 최대 형광 값으로 정규화하여 DNA 방출량으로 나타낸 것입니다. 이 형광 이미지들은 처리하지 않은 중성구와 PMA로 자극한 중성구를 보여줍니다.여기에 MPO-DNA 및 HNE-DNA ELISA 분석을 통해 얻은 비자극, PMA 및 PA01로 활성화된 인간 호중구의 면역형광 이미지가 제시되어 있습니다. 세포 외 DNA는 전형적인 NET 형태를 보이며, NET 형성의 표지자인 MPO 및 시트룰린화된 히스톤 H4와 공동 국소화됩니다. 이 실험은 동일한 분석법을 사용하여 인간 호중구에서 MPO-DNA 및 HNE-DNA 방출을 보여줍니다.NET 표준물질은 평균적으로 밀리리터당 19.5 µg의 세포 외 DNA, 밀리리터당 399 ng의 MPO 및 밀리리터당 103.4 ng의 HNE를 함유하고 있습니다. MPO와 HNE의 분자량, 그리고 DNA 1 µg에 9.91 × 10¹⁴개의 뉴클레오타이드가 포함된다는 점을 근거로 할 때, NET 표준물질은 뉴클레오타이드 1,000개당 109개의 HNE 분자와 147개의 MPO 분자를 함유하고 있습니다. 마지막으로, NET 표준물질의 2배 연속 희석 실험 결과, MPO-DNA 및 HNE-DNA ELISA 분석의 동적 범위는 모두 DNA 기준 밀리리터당 19 ng에서 609 ng 사이인 것으로 나타났습니다.숙달되면 SYTOX orange 기반의 산성 용액은 한 시간 내에 쉽고 빠르게 조제할 수 있으며, 다음 날 결과를 확인할 수 있습니다. NET 정량 분석법 또한 수행하기 쉬우며, 적절하게 수행될 경우 다음 날 데이터를 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 호중구 내의 naturalase를 고효율 방식으로 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

배우세요 인간 호중구에서 고처리량으로 세포 외 DNA 릴리스 및 NET 형성을 정량화하는 방법을. 이 기법은 염증 질환 연구와 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성

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