세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성 체외

이 절차의 전반적인 목표는 인간 호중구에서 방출된 호중구 세포외 트랩(NET)을 높은 처리량 규모로 정량화하는 것입니다. 여기에 제시된 방법은 인간 호중구에서 체외 호중구 세포 외 트랩 형성의 메커니즘 및 조절에 대한 연구를 통해 염증 및 염증성 질환 변경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 중앙 NET 매개 신호 경로 및 NET 억제 또는 NET 자극 분자의 식별과 관련이 있습니다.

혈액에서 호중구를 분리하려면 20ml의 인간 혈액을 250ml의 원추형 튜브로 분취합니다. 10ml의 6%덱스트란을 첨가한 다음 용액을 부드럽게 섞어 실온에서 20분 동안 그대로 둡니다. 백혈구가 풍부한 상부기를 깨끗한 50ml 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 멸균 PBS를 사용하여 튜브를 위쪽으로 채웁니다.

그런 다음 400배 G에서 10분 동안 샘플을 원심분리하고 15ml의 멸균 PBS를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 215 밀리리터 원뿔형 튜브에 85, 80, 75, 70 및 65%의 5단계 퍼콜 그래디언트를 준비하고 각 그래디언트 위에 2밀리리터의 백혈구 현탁액을 레이어

그런 다음 800배 G에서 분리된 상태에서 30분 동안 그래디언트를 원심분리합니다. 원심분리 후 75-80% 및 70-75% 인터페이스에서 레이어의 세포를 수집합니다. PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척한 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

세포외 DNA 방출의 동역학을 측정하려면 분석 배지에서 밀리리터당 6개의 세포에 대해 2배의 농도로 호중구의 현탁액을 준비합니다. 멤브레인 불침투성 DNA 결합 염료인 SYTOX 오렌지 1리터당 5마이크로몰을 넣고 부드럽게 섞습니다. 인간 호중구를 멸균 96웰 검은색 투명 바닥 마이크로플레이트로 분취하여 분석 매체가 웰 바닥 전체를 덮도록 합니다.

그렇지 않은 경우 측면에 있는 접시를 부드럽게 두드립니다. 접시를 섭씨 37도에서 10분 동안 데웁니다. 그 동안 섭씨 37도의 분석 매체를 사용하여 사용할 최종 농도의 두 배로 자극을 포함하는 용액을 준비합니다.

양성 NET 대조군으로, 100 나노몰 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 준비하여 4시간 동안 인간 호중구를 치료하고 최대 NET 방출을 유발합니다. 다음으로, 측정을 위해 마이크로플레이트 형광계를 준비합니다. 50마이크로리터의 호중구 현탁액에 50마이크로리터의 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극합니다.

사포닌 1밀리리터당 0.5mg의 최종 농도를 첨가하여 최대 DNA 방출 신호를 측정합니다. 플레이트를 리더기에 놓고 흔들림 없이 4시간 동안 2분 간격으로 형광 변화를 측정합니다. 데이터를 분석하려면 사포닌을 포함한 모든 웰의 종말점 값에서 기준선 형광을 빼서 시간 경과에 따른 형광의 정규화된 증가를 계산합니다.

사포닌 형광의 증가는 가장 높은 신호여야 하며 이를 최대 DNA 방출이라고 합니다. 반복 결과의 평균을 구하고 이를 최대 DNA 방출의 백분율로 표시합니다. MPO-DNA 및 HNE-DNA ELISA 분석을 사용하여 NET 형성을 정량화하려면 96웰 높은 결합 용량의 ELISA 플레이트에 항-MPO 또는 항-HNE 포획 항체를 추가하고 하룻밤 동안 배양하여 코팅합니다.

다음날 아침 PBS 웰당 200마이크로리터를 사용하여 ELISA 플레이트를 세 번 세척합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 5% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.1% 인간 혈청 알부민(HSA)을 사용하여 실온에서 2시간 동안 웰을 차단합니다. 그 동안, 100-well plate에 100 μl의 분석 매체에 100 μl의 분석 매체에 seed, well 당 000 개의 세포를 파종하고 37 °C에서 4 시간 동안 배양하여 자극을 추가 한 후 NET 형성을 유도합니다.

다음으로, 호중구 상층액에 DNAse 1밀리리터당 2단위를 첨가하여 제한된 DNase 분해를 수행한 다음 잘 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 15마이크로리터의 25밀리몰 EGTA를 첨가하여 반응을 중지하고 잘 섞습니다. 상층액을 모으고 마이크로분리 튜브를 세척하고 샘플을 회전시켜 300배 G와 실온에서 5분 동안 세포 파편을 제거합니다.

제한된 소화 없이 NET을 수집하면 일관되지 않은 데이터가 생성됩니다. 제한된 DNA 분해 단계는 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서 DNase I 효소의 농도와 분해 길이가 최적화되었습니다.

상층액을 마이크로디퓨즈 튜브를 청소하고 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 이전에 준비된 NET 표준물질의 분취액을 사용하여 PBS 및 EGTA에서 1-2 희석을 준비합니다. 이제 PBS와 EGTA를 사용하여 DNase I 분해 샘플을 20배 희석하고 포획 항체로 코팅된 ELISA 플레이트에서 분취합니다.

섭씨 4도에서 밤새 접시를 배양합니다. PBS를 사용하여 플레이트를 세 번 세척하기 전에 horseradish peroxidase conjugated anti DNA 항체와 같은 검출 항체 용액을 웰당 100마이크로리터로 적용하고 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 4회 세척한 후 TMB 과산화효소 기질의 웰당 100마이크로리터를 추가하고 30분 동안 배양합니다.

파란색은 과산화효소 활성과 NET의 존재를 나타냅니다. 반응을 중지하려면 100마이크로리터의 1몰 HCL을 첨가하십시오. 파란색 솔루션이 노란색으로 바뀝니다.

마이크로플레이트 광도계를 사용하여 450나노미터에서 흡광도를 읽습니다. NET 표준물질과 비교하여 측정된 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 비교하려면 모든 샘플에서 백그라운드 최적 밀도를 빼고 상대적 NET 함량에 대해 희석된 표준 샘플의 흡광도 값을 플롯합니다. 이 표준 곡선의 불포화 범위를 사용하여 사용된 소프트웨어에서 가장 적합한 지수 맞춤을 사용하여 추세선을 설정합니다.

미지의 측정된 OD 값을 추세선 방정식에 삽입하면 미지 샘플의 NET 수를 NET 표준의 백분율로 제공합니다. 마지막으로, 반복실험의 평균을 계산하고 최종 데이터를 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양으로 제시합니다. 여기에 표시된 것은 PMA 또는 녹농균으로 자극되지 않거나 활성화되지 않은 인간 호중구에 대한 형광 기반 DNA 방출 분석의 대표적인 데이터입니다.

녹농균은 인간 PMN에서 NET 형성을 유발합니다. 이 그래프는 복제 웰의 형광 증가 평균이 계산되고 최대 형광에서 정규화되며 DNA 방출로 표현됨을 보여줍니다. 이러한 형광 이미지는 PMA로 처리되지 않거나 자극된 호중구를 나타냅니다.

여기에 표시된 것은 MPO-DNA 및 HNE-DNA Elisa 분석에서 얻은 비자극, PMA 및 PA01 활성화 인간 호중구의 면역형광 이미지입니다. 세포외 DNA는 전형적인 NET 형태를 보여주며 NET 형성의 마커인 MPO 및 시트룰린 히스톤 H4와 공동 국소화합니다. 이 실험은 동일한 분석을 사용하여 인간 호중구에서 MPO-DNA 및 HNE-DNA 방출을 보여줍니다.

NET 표준은 평균적으로 세포 외 DNA의 밀리리터당 19.5마이크로그램, MPO의 밀리리터당 399나노그램, HNE의 밀리리터당 103.4나노그램을 포함합니다. MPO와 HNE의 분자량에 기초를 두고, DNA의 1 마이크로 그램은 14 개의 뉴클레오티드에 9.91 곱하기 10을 포함하며, NET 표준은 1, 000 뉴클레오티드 당 109 HNE 분자와 147 MPO 분자를 포함합니다. 마지막으로, NET 표준의 두 차례 연속 희석 실험은 MPO-DNA 및 HNE-DNA ELISA 분석의 동적 범위가 DNA 밀리리터당 19-609 나노그램 사이라는 것을 보여줍니다.

SYTOX 오렌지 기반 산은 한 시간 안에 쉽고 빠르게 조립할 수 있으며 다음 날 결과를 얻을 수 있습니다. NET 정량 분석도 수행하기 쉬우며 제대로 수행되면 다음 날 데이터를 얻을 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 호중구에서 고처리량 방식으로 자연분해효소를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.