Name: 세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 세포주 및 조직 샘플에서 deubiquitinating 효소 활성을 측정하는 방법을. hemagglutinin 유래 프로브와 웨스턴 블롯팅을 활용하여 여러 효소 활성을 동시에 시각화하고 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

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우리는 사용 된 마우스 척수 조직 샘플을 제공하기 위해 미네소타 대학의 리 실험실에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB의 랜디 면도기 암 연구 및 지역 사회 기금과 미네소타 난소 암 연맹 (MOCA)이 MB의에 의해, 국방 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB의 OC093424의 부서에 의해 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

1. 용해 버퍼 준비 <ol><li> 2 M 원액을 만들기 위해 탈 (DI) 물에 설탕을 녹인다. 0.22 ㎛의 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 필터를 구동 진공을 사용하여 수크로오스 2 M 용액 필터. </li><li> 혐기성 조건에서 500 mM의 스톡 용액을 저장하기 위해 DI 물에 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 녹인다. 100 mM의 스톡 용액을 제조하기 위해 DI 물에 염화 마그네슘 (의 MgCl 2)을 녹인다. 50 mM의 스톡 용액을 제조하기 위해 DI 물에 아데노신 삼인산 (ATP) 나트륨 수화물을 녹인다. </li><li> DI 물에 후, Trizma 염산염을 용해시키고 수산화 나트륨 (NaOH)을 이용하여 pH를 조정하여 pH를 7.4 트리스 용액을 구성한다. </li><li> 250 mm의 1mm를 5mm의의 MgCl 2 농도 1mM이 ATP 농도 및 50 mm의 트리스 농도 DTT 농도의 슈 크로스 농도의 용해 완충액을 만들기 위해 DI 물에 원액의 일부를 겸용 . 예를 들어, 트리스, 50 μL를 혼합 535.30의 MgCl 2 μL, 1.25 수크로오스 ㎖, 20 μL의 DTT, ATP 200 μL 및 DI 물 7.4947 ml의 용해 완충액 10 mL로한다. 이것은 약 20 실험에 사용될 수있다. </li></ol> 실험 2. 배양 세포 <ol><li> DMEM + 10 %, 50㎖ 태아 소 혈청 (FBS) 원추형 튜브의 30 ㎖를 분취하여 미디어를 확인. </li><li> 미지근한 물을 작은 비커에 액체 질소 저장에서 냉동 M17이나 헬라 세포를 전송합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. 첫째, 세포 바이알에 일부 미디어를 추가합니다. 그리고 해동 5 초 이내에 재현 탁 세포를 전송합니다. </li><li> 세포 펠렛을 얻기 위해 5 분 동안 450 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. T75 플라스크에 매체의 20 ML을 추가합니다. </li><li> 흡입을 사용하여 세포에서 용지를 제거합니다. 세포 펠렛 및 재현 탁에 신선한 매체의 5 ML을 추가합니다. </li><li> T75 플라스크에 미디어의 20 ㎖에 5 ml의 세포 현탁액을 전송하고 37 ° C에서 품어. 채널3 일마다 미디어를 앙. </li></ol> 3. 셀 수확 <ol><li> 세포를 만지지 않도록 조심하면서, 흡입을 통해 용지를 제거합니다. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)와 세포를 씻으십시오. 흡입을 사용하여 PBS를 제거합니다. </li><li> T75 플라스크에 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 ㎖를 추가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 플라스크에 신선한 미디어 6 ML을 추가하고 세포를 재현 탁. </li><li> 5 분 동안 290 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 현탁액을 전송합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 PBS 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 조심스럽게 펠렛을 분쇄하기 위해 튜브의 바닥을 누릅니다. 5 분 동안 290 XG에 원심 분리기. </li><li> 단계를 반복 3.6 세 번. </li><li> PBS를 제거하고 신선한 PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁. 에펜 도르프 튜브 (1.5 ㎖)에 전송합니다. 5 분 동안 290 XG 스핀. </li></ol> 4. 세포 용해 <ol><li> 피펫을 사용하여 펠릿의 대략적인 체적을 측정1 부피비 : 질량에 유리 비드를 달아 (D1). 용해 완충액의 펠릿 두번 볼륨. 참고 : 유리 구슬을 추가하기 전에 버퍼를 추가합니다. </li><li> 를 Lyse 냉장실의 텍싱하여 4 ° C에서 30 분 동안 교반 최대의 에펜 도르프 튜브에 세포. </li><li> 200 XG 30 초 원심 분리기 짧게 구슬을 해결합니다. 상층 액을 수집합니다. </li><li> 상층 액에 이전과 유리 구슬의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 다시 한번 최대 교반에서 4 ℃에서 30 분 동안 소용돌이. </li><li> 200 XG 30 초 원심 분리기 짧게는 유리 구슬을 해결합니다. 상층 액을 수집합니다. </li><li> 5 분 5,030 XG에 원심 분리기는 핵, 세포막 손상되지 않은 세포를 제거합니다. 세포 용 해물 인 상층 액을 수집합니다. </li></ol> 5. 조직의 균질화 <ol><li> 용해 버퍼에 마우스 척수 조직의 9 해결책 : 1의 부피 : 질량을 확인합니다. 참고 :이 방법은 다른 다양한에 적용 할 수있다ENT 조직 샘플. </li><li> 남아있는 청크가 없다는 것을 보장하기 위해 30 초 동안 균질 기에서 2 레벨의 설정을 사용하여 조직을 균질화. </li><li> 핵, 세포막 손상되지 않은 세포를 제거하기 위해 3 분 동안 5,030 XG에 스핀 다운. </li><li> 해물 인 상층 액을 수집합니다. </li></ol> 6. 샘플 유도체 화 <ol><li> 피어스 BCA 단백질 분석 키트 프로토콜에 의해 지정된대로 비색 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 조직 파쇄 액의 단백질 농도를 결정하기 위해 96 웰 플레이트 분석 bicinchoninic 산 (BCA)을 수행한다. </li><li> 탈 이온화 (DI) 물을 사용하여 50 μL에 총 단백질의 20 μg의에 해당하는 나누어지는 가져와. </li><li> 솔루션 HA-UB-비닐 설폰 (VS)의 1.35 μm의 2 μl를 추가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이것은 최종 반응 혼합물에 프로브를 50 nm의 용 해물 20 μg의 결과. 이 더빙 기능들의 태깅을 위해 큰 몰 과량이다. </li><li> 나는95 ° C에서 5 분간의 램 믈리 시료 완충액에서 샘플 ncubate. 52 ㎕의 반응 부피로 사용 배 샘플 완충액 26 μL, 4X 샘플 완충액 13 μL 또는 6X 샘플 완충액 8.87 μL를 들어. </li><li> 젤을로드하기 전에 얼음 쿨. </li></ol> 7. 서쪽 오점 <ol><li> 준비된 샘플의 40 μL와 12 웰 4-20% 트리스 - 글리신 젤로드 </li><li> 이온 전면이 바닥에 도달 할 때까지 95 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 상에 겔의 하룻밤 전송을 수행합니다. </li><li> 아미 검은 얼룩의 막을 인큐베이션하고 각 레인에있는 단백질의 양을 보여주는 화상을 얻을 membane 스캔. </li><li> 막 Destain 및 차단하는 1 시간 동안 PBS에 5 % 우유에 품어. </li><li> 1의 농도 차 항 HA 항체에 막을 인큐베이션 : 어느 밤새 4 ℃에서 또는 실온에서 4 시간 동안 PBS에서 10,000 5 % 우유. </li><li> f를 3 세척을 수행0.1 % 트윈 20 세제와 PBS에 5 분마다. </li><li> 1의 농도로 마우스 고추 냉이 퍼 옥시 다제에 막을 인큐베이션 : PBS 10,000 5 % 우유를 적어도 2 시간 동안. </li><li> 0.1 % 트윈 20 세제와 PBS에 5 분마다 3 세척을 수행합니다. </li><li> PBS에서 5 분 동안 1 세척을 수행합니다. </li><li> 10 분 동안 화학 발광 검출 시약에서 부화 막과 화학 발광 검출기를 이용하여 검출한다. 검출기에 자동 노출 설정을 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-+based+ubiquitin-specific+%28USP%29+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

유비퀴틴은 기본적인 셀룰러 활성이기 때문에, 규제 메커니즘을 이해하는 것이 질병의 병리 과정을 발굴하는 키가 될 수있다. HA의 사용은 여기에보고 UB 유래 활성 부위 감독 프로브는 UB-매개 단백질 분해 연구를위한 쉬운,하지만 매우 적용 할 수있는 방법을 제공하는 태그. 이 방법은 신속하고 저렴 개별적 더빙 각각 공부보다 길다. 유리 비드를 사용하는 -이 방법에서, 세포의 용해는 기계적 수단을 통해 달성된다. 용해의이 부드러운 방법은 신진 대사 세포 내 사진을 유지합니다. 그러나,이 균법의 주요 단점은 60-70 %로 낮은 효율이다. 이것은 세포 용 해물은 많은 실험을 충분히 농축 보장하기 위해 요구되는 것을 의미한다. 80 T75 플라스크 - 90 % 융합 성 세포 층을 농축 분해물을 생산하는 데 사용한다. 또한, 실험의 트립신 처리 공정이 중요부착 된 세포의 대부분은 용액에 현탁되어야하기 때문이다. 문화에 세포의 상당 부분이 50 ㎖ 튜브에 전송하기 전에 떠 있는지 확인...

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)은 포유 동물 세포에서 주요 분해 경로의 하나로서 역할을한다. 프로 테아 좀 저하 행 기판을 공유 유비퀴틴 (UB) 1 중합체와 태그. 타겟 기판 분해 테아로 들어가기 전에, 폴리 - 유비퀴틴 태그는 제거되어야한다. 효소 (더빙) deubiquitinating 알려진 효소 클래스 유비퀴틴 분자 (2)의 제거 및 재활용 할 책임이있다. 이는 셀 3의 백 작업 거의 더빙이 있다는 인간 게놈으로부터 예측되어왔다. UB-매개 세포 과정을 조절 움직여 같은 많은 수의,이 효소를 공부에만 발현 수준에 대한 정보를 제공 mRNA의 기술 활동 및 서부 블로 팅에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에 문제를 제시한다. 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA)의 사용은 공유 개조를 허용 활성 부위 지향 프로브 UB 유래, 태그기능 더빙 따라서의 형 치수는 웨스턴 블롯 4에이 효소의 활동의 직접적인 시각화를 제공합니다. 프로브는 활성 부위 시스테인 잔기 5 자살 기질로서 작용 C 말단 티올 반응성기를 갖는다. 이러한 프로브, 상기 셀의 양쪽 병리 생리 학적 상태에 따라 다수의 더빙의 활성 및 발현 가능성을 연구 할 수있다. DUB 활성의 변화는 파킨슨, 알츠하이머, 빈혈 및 각종 암 6-10 같은 병리 적 상태의 범위에 연루되어왔다. 이 기술은 질병의 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 논문에서는 유리 비드를 사용하여 용해 된 헬라 세포 및 M17에서이 기술의 애플리케이션을 도시한다. 또한, 우리는 마우스 척수 조직 샘플에서이 방법을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법에서 얻은 정보를 식별하기위한 출발점으로 사용될 수있다치료 대상뿐만 아니라 다른 질병 상태의 연구를위한 모델을 확립. 이 기술의 진정한 유틸리티는 단일 분석에서 여러 더빙에 대한 정보를 제공 할 수있는 능력에있다.

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125 (homogenizer)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>진공 구동 필터 0.22 & 마이크로; m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬, 산성 세척 &le; 106 &마이크로; m (~ 140 미국 체)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>수당</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL- 디티 오 트레이톨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'- 트리 포스페이트 디 소듐 염 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr>마우스 <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td>유비퀴틴 비닐 설폰(HA-태그)<td>에서 생성된 단클론 항-HA 항체</td></tr><tr><td></td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli의 SDS-샘플 버퍼(4x, 감소)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 어세이 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

세포주 및 조직 샘플에서 deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템은 최근 신경 변성 질환 및 암을 비롯한 다양한 병리에 관여한다. 이러한 관점에서,이 시스템의 조절 메커니즘을 연구하는 기술은 전술 한 질환의 세포 및 분자 적 프로세스를 해명에 필수적이다. 이 논문에 설명 된 적혈구 응집소 유래 유비퀴틴 프로브의 사용은이 시스템의 연구를위한 유용한 도구로서 기능한다. 이 논문은 효소 활성을 deubiquitinating의 직접적인 시각화를 제공 분석을 수행 할 수 있도록 해주는 방법을 자세히 설명합니다. Deubiquitinating 효소는 프로 테오 열화를 제어하고, 사용자가 하나의 분석에서 여러 효소의 활성을 조사 할 수 있도록 자신의 활성 부위에서 기능적 유사성을 공유한다. 해물을 부드러운 기계 세포 파괴를 통해 얻은 액티브 사이트 감독 프로브와 함께 배양한다. 비활성 효소가 결합되지 않은 유지하면서 기능 효소는 프로브와 태그. 실행으로닝이 분석에서, 사용자는 활성 및 빠르고 손쉽게 방식으로 여러 deubiquitinating 전위 효소 발현 모두에 대한 정보를 획득한다. 현재의 방법은 인간 세포에서 예측 백 deubiquitinating 효소 개별 항체를 사용하는 것보다 훨씬 더 효율적이다.

배양 된 M17과 헬라 세포는 프로토콜 (3 셀 수확)에 자세히 방법 및 마우스 척수 조직을 얻었다을 사용하여 수확했다. 세포 펠렛 / 척수 조직은 시약 제조 섹션에 기재된 용해 완충액으로 튜브에 넣었다. 세포 펠릿을 균질화 (도 1b)를 이용하여 균질화시켰다 유리 비드 (도 1a) 및 마우스 척수 조직 샘플을 사용하여 용해시켰다. 용해 또는 균질화 한 후, 샘플을 유리 비드 및 / 또는 막 파손되지 소기관 및 (도 2)를 제거하기 위해 5030 XG에서 원심 분리 하였다. 이들 방법은 모두 효소 활성을 유지하기 용해의 기계적인 수단이다. 세포의 단백질 농도는 BCA 방법을 사용하여 측정 하였다. 총 단백질의 20 μg의 37 ° C (그림 3)에서 1 시간 동안 1.35 μm의 프로브의 2 μL와 함께 배양 하였다. 샘플은 다음의 4X 램리 배양 하였다95 ° C에서 샘플 버퍼는 반응을 종결. 준비된 시료...

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 내 탈유비퀴틴화 효소의 활성을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포를 높은 밀도로 배양하고 수확하여, 두 번째 단계에서 농축된 용해물을 생성할 수 있도록 합니다. 세포질의 대사 상태를 유지하는 용해물을 얻기 위해 완만한 기계적 용해법을 사용합니다.다음으로, 활성 부위의 시스테인 잔기와 반응시켜 탈유비퀴틴화 효소를 표지하기 위해, 효소를 헤마글루티닌 유래 프로브와 함께 배양합니다. 결과는 웨스턴 블로팅 및 후속 화학발광 검출을 기반으로 한 여러 탈유비퀴틴화 효소의 활성 프로파일을 보여줍니다. 일반적인 웨스턴 블로팅과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 사용자가 여러 효소의 활성을 시각화할 수 있다는 것입니다. 한 실험에서, 50 mL 원추형 튜브에 30 mL의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)을 분주하여 세포 배양 배지를 준비합니다.실험에 사용할 세포를 위해, 액체 질소 저장소에서 냉동된 M 17 또는 he A 세포를 미온수가 담긴 작은 비커로 옮깁니다. 그다음, 세포를 30 mL의 배지가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 이어서, 세포 바이알에 배지를 약간 추가하고, 해동 후 5초 이내에 재현탁된 세포를 옮깁니다.세포 현탁액을 450 Gs에서 5분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛을 얻습니다. 그런 다음 T 75 플라스크에 배지 20 milliliters를 넣습니다. 흡입 장치를 사용하여 세포에서 배지를 제거합니다.신선한 배지 5 mL를 세포 펠릿에 첨가하고 재현탁합니다. 5 mL의 세포 현탁액을 T 75 플라스크 내의 배지 20 mL로 옮기고 37 °C에서 배양합니다. 세포를 수확할 때까지 3일마다 배지를 교체합니다.세포에 닿지 않도록 주의하며 흡입 장치로 배지를 제거합니다. 5 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. 흡입 장치를 사용하여 PBS를 제거합니다.다음으로, T 75 플라스크에 trypsin EDTA 3 mL를 넣고 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 플라스크에 신선한 배지 6 mL를 넣고 세포를 재현탁합니다.현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 290 Gs에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 PBS 5 mL를 첨가합니다. 290 Gs에서 5분간 원심분리하기 전에 튜브 바닥을 가볍게 두드려 펠렛을 풀어줍니다. PBS 세척 과정을 3회 반복한 후, 기존의 PBS를 제거하고 신선한 PBS 1 mL에 세포를 재현탁합니다.그런 다음 세포를 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮기고 290 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 용해를 수행하려면, 피펫을 사용하여 펠렛의 대략적인 부피를 측정하고 질량 대 부피 비율이 1:1이 되도록 유리 비드를 정량하여 넣습니다. 펠렛 부피의 2배에 해당하는 용해 버퍼를 펠렛에 첨가합니다.그 다음 펠렛에 유리 비드를 추가하고 용해 버퍼를 넣습니다. 저온실에서 볼텍싱을 통해 최대 진동으로 4 °C에서 30분 동안 에펜도르프 튜브 내의 세포를 용해시킵니다. 200 ×g에서 30초 동안 짧게 원심분리합니다.비드를 가라앉히고 상층액을 수집합니다. 이전과 동일한 부피의 유리 비드를 상층액에 추가하고, 200 Gs에서 30초 동안 짧게 원심분리한 후 4°C에서 최대 강도로 30분 동안 다시 한번 볼텍싱합니다. 유리 비드를 가라앉히고 상층액을 수집합니다.마지막으로 5,030 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 핵, 세포막 및 파쇄되지 않은 세포를 제거하기 위해 상층액을 수집하며, 이 상층액은 시아닉산(cyanic acid)을 이용한 조직 유도체화 또는 BCA 분석을 위한 세포 용해물로 사용됩니다. BCA 단백질 분석 키트 프로토콜에 명시된 대로, 컬러메트릭(colorimetric) 96웰 플레이트 리더를 사용하여 96웰 플레이트에서 용해물의 단백질 농도를 측정합니다.단백질 농도를 결정한 후, 총 단백질 20 µg에 해당하는 분취액을 탈이온수를 사용하여 50 µL로 맞춥니다. 그 다음 1.35 µM HAUB vinyl cell phone 2 µL를 용액에 첨가합니다. 결과적으로 최종 반응 혼합물 내 단백질 용해물 20 µg에 프로브 50 nM이 포함되게 됩니다.이는 몰 농도가 매우 과량인 상태입니다. 기능성 탈유비퀴틴화 효소(dubs)의 태깅을 확실히 하기 위해, 용액을 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 그다음, 용액에 Laemmli 샘플 버퍼를 추가하십시오.52 µL의 반응 부피의 경우, 2x 샘플 버퍼 26 µL, 4x 샘플 버퍼 13 µL 또는 6x 샘플 버퍼 8.87 µL를 사용하십시오. 샘플을 95 °C에서 5분 동안 인큐베이트하십시오. 그 후 얼음 위에서 냉각하십시오.western blot을 수행하기 위해 젤을 로딩하기 전, 먼저 12-well 4-20% tris-glycine 젤에 준비된 샘플 40 µL를 로딩합니다. 이온 전선(ion front)이 바닥에 도달할 때까지 95 V에서 젤을 전기영동합니다. 그 후, 다음 절차에 따라 poly vinylidene fluoride 또는 PVDF 막으로 젤을 하룻밤 동안 전이(transfer)시킵니다.먼저, 멤브레인을 AMDO black 염색액에서 인큐베이션하고 멤브레인을 스캔하여 각 레인의 단백질 양을 보여주는 이미지를 얻습니다. 그다음 멤브레인의 염색을 제거하고 PBS에 희석한 5% milk에서 1시간 동안 인큐베이션하여 블로킹합니다. 이어서 멤브레인을 PBS에 희석한 5% milk 내의 1:10,000 농도로 희석된 1차 anti HA 항체에서 4°C로 하룻밤 동안 또는 실온에서 4시간 동안 인큐베이션합니다.배양 후, 0.1% tween 20 세제가 포함된 PBS로 5분씩 세 번 세척합니다. 그 다음, PBS에 5% milk가 포함된 용액에서 1:10,000 농도로 희석된 mouse horseradish peroxidase에 멤브레인을 최소 2시간 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 세 번 세척한 후, PBS로 5분 동안 한 번 더 세척합니다.마지막으로 멤브레인을 화학발광 검출 시약에서 10분 동안 배양하고 발광 검출기를 사용하여 검출합니다. 검출기의 자동 노출 설정을 사용하십시오. 단백질 로딩량은 AM mito black 염색을 통해 확인하였습니다.이 대조 단계는 활성 차이가 단백질 로딩 양의 불균형이 아니라 실제 세포 프로세스로 인한 것임을 보장합니다. 여기에 표시된 레인은 첫 번째 실험에서 동일한 양의 단백질이 사용되었음을 나타냅니다. 두 번째 실험에서는 서로 다른 세포주의 활성 프로파일에서 예상되는 차이로 인해 서로 다른 양의 단백질이 로딩되었습니다.이는 M 17 세포의 활성 프로파일 검출을 보장하기 위해 수행되었습니다. 시스테인 억제제인 ethyl maide와 함께 배양한 용해물은 Western blot에서 신호가 감소해야 합니다. 막은 anti HA 1차 항체로 배양되었습니다.마우스 horse radish peroxidase를 처리한 후, 화학발광 이미징을 통해 검출합니다. 프로브를 이용해 dubs 태깅에 성공하면 멤브레인의 각 레인에 프로파일이 나타납니다. 서로 다른 분자량에서 나타나는 밴드의 강도는 dub 효소의 활성 수준에 해당합니다.HeLa 세포와 M17 세포에서 UCHL1과 같은 유사 단백질을 비교하면 세포주마다 다양한 DUB의 활성 수준에 차이가 있음이 분명해집니다. 이 절차 이후에는, 병리적 과정이 막 결합 소기관의 유비퀴틴 효소 활성에 어떤 영향을 미치는가와 같은 질문에 답하기 위해 세포 소기관 분획법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후에는 활성 부위 지향 프로브(active site directed probes)를 사용하여 탈유비퀴틴화 효소 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

method-for-measuring-activity-deubiquitinating-enzymes-cell-lines

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

여기에 사용된 실험은 중국 전통 의학의 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 프로브 기술과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

분자 도킹 및 탈유비퀴틴 효소 프로브 기술을 기반으로 UCHL3 활성을 억제하기 위한 전통 한의학 화합물 스크리닝

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

학습하세요 세포주 및 조직 샘플에서 deubiquitinating 효소 활성을 측정하는 방법을. hemagglutinin 유래 프로브와 웨스턴 블롯팅을 활용하여 여러 효소 활성을 동시에 시각화하고 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

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