세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법
2015년 5월 10일
현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.
다음 실험의 전반적인 목표는 세포에서 de 유비퀴틴 효소의 활성을 시각화하는 것입니다. 이는 세포를 높은 co-fluency로 배양하고 두 번째 단계로 농축 용해물의 생산을 촉진하기 위해 세포를 수확함으로써 달성됩니다. 부드러운 기계적 용해는 세포의 세포질에 대한 대사 그림을 유지하는 용해물을 생산하는 데 사용됩니다.
다음으로, 활성 부위 시스테인 잔기와 반응하여 de 유비퀴틴 효소를 표지하기 위해 효소를 헤마글루티닌 유래 프로브로 배양하고, 결과는 웨스턴 블로팅 및 후속 화학발광 검출을 기반으로 많은 de 유비퀴틴 효소의 활성 프로파일을 보여줍니다. 일반 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 사용자가 여러 효소의 활성을 시각화할 수 있다는 것입니다. 한 실험에서, 30 밀리리터의 도브 도코, 변형 독수리 배지 또는 DMEM과 10 % 태아 소 혈청을 50 밀리리터 원뿔 튜브에 인용하여 Ali에 의한 세포 배양 배지를 준비하여 배양합니다.
실험을 위한 세포는 액체 질소 저장고에서 동결된 M 17 또는 A 세포를 미지근한 물이 담긴 작은 비커로 옮깁니다. 그런 다음 30ml의 배지가 들어 있는 50ml 원추형 튜브로 세포를 옮깁니다. 다음으로, 세포 바이알에 일부 배지를 추가하고 해동 후 5초 이내에 재현탁 세포를 이식합니다.
세포 현탁액을 450Gs에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 그런 다음 T 75 플라스크에 20ml의 매체를 추가합니다. 흡입을 사용하여 세포에서 배지를 제거합니다.
세포 펠릿에 5ml의 새로운 배지를 추가하고 Suspend를 복원합니다. 5ml의 세포 현탁액을 T 75 플라스크의 20ml 배지로 옮기고 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포를 수확하기 위해 3일마다 배지를 교체합니다.
세포를 만지지 않도록 주의하면서 흡입을 통해 매체를 제거합니다. 5ml의 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세포를 세척합니다. 흡입을 사용하여 PBS를 제거합니다.
다음으로, T 75 플라스크에 3ml의 트립신 EDTA를 넣고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 배양 후 6ml의 신선한 배지를 플라스크에 넣고 소생시킵니다. 셀을 일시 중단합니다.
현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 290Gs에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 PBS 5ml를 추가합니다. 튜브 바닥을 부드럽게 두드려 펠릿을 분해한 후 290Gs에서 5분 동안 원심 주입합니다. PBS 세척을 세 번 반복한 후 기존 PBS를 제거하고 1ml의 새 PBS에 세포를 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 세포를 einor 튜브로 옮기고 290GS에서 5분 동안 회전합니다. 세포 용해를 수행하려면 피펫을 사용하여 펠릿의 대략적인 부피를 측정하고 유리 구슬과 1:1의 질량 대 부피 비율을 계량합니다. 펠릿 부피의 두 배로 펠릿에 용해 완충액을 추가합니다.
그런 다음 유리 구슬을 펠릿에 넣고 용해시킵니다. 차가운 방에서 와류를 일으켜 섭씨 4도에서 30분 동안 최대 교반으로 einor 튜브의 세포를 완충합니다. 200GS에서 30초 동안 잠시 원심분리기를 사용합니다.
구슬을 침전하고 상등액을 수집합니다. 이전과 동일한 부피의 유리 구슬을 상등액 와류에 첨가하고, 다시 한 번 섭씨 4도에서 30분 동안 최대 교반으로 200Gs에서 30초 동안 잠시 원심 주입 후 교반합니다. 유리 구슬을 가라앉히려면 상층액을 수집하십시오.
마지막으로 5, 030 GS에서 5분 동안 원심분리기를 합니다. 핵, 막 및 끊어지지 않은 세포를 제거하려면 Cinco nimic acid 또는 BCA 분석으로 수행되는 조직 유도체화를 위한 세포 용해물인 상층액을 수집합니다. 96웰 플레이트에서 BCA 단백질 분석 키트 프로토콜에 지정된 대로 콜레 메트릭 96 웰 플레이트 리더를 사용하여 용해물의 단백질 농도를 측정합니다.
단백질 농도를 측정한 후 탈이온수를 사용하여 총 단백질 20마이크로그램에 해당하는 부분 표본을 50마이크로리터로 가져옵니다. 그런 다음 1.35 마이크로 몰의 HAUB 비닐 휴대 전화 2 마이크로 리터를 용액에 추가합니다. 그 결과 최종 반응 혼합물에서 20마이크로그램의 용해물에서 50나노 몰의 프로브가 생성됩니다.
이것은 큰 어금니 과잉입니다. 기능성 de 유비퀴틴 효소 또는 더빙의 태깅을 보장하려면 용액을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하도록 두십시오. 다음으로, laly 샘플 버퍼를 용액에 추가합니다.
52 마이크로리터 반응 부피의 경우 26 마이크로리터의 2 x 샘플 버퍼, 13 마이크로리터의 4 x 샘플 버퍼, 또는 8.87 마이크로리터의 6 x 샘플 버퍼를 사용합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 배양합니다. 얼음에 식히십시오.
웨스턴 블롯을 수행하기 위해 겔을 로드하기 전에 먼저 12, 4-20%트리스 글리신 겔에 준비된 샘플 40마이크로리터를 로드합니다. 이온 전면이 바닥에 도달할 때까지 95볼트에서 젤을 실행합니다. 그런 다음 다음 폴리 덩굴 DI 불화물 또는 PVDF 멤브레인에 젤을 밤새 옮깁니다.
이송 먼저, AMDO 블랙 염색에서 멤브레인을 배양하고 멤브레인을 스캔하여 각 레인의 단백질 양을 보여주는 이미지를 얻습니다. 다음 막을 억류하고 막기 위하여 1 시간 동안 PBS에 있는 5%milk에서 배양하십시오. 다음으로, PBS에 있는 5%milk에서 1 1에서 10, 000의 농도로 1차 항 HA 항체의 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 또는 실온에서 4시간 동안 배양합니다.
배양 후 0.1% 트윈 20 세제를 사용하여 PBS에서 각각 5분씩 3회 세척합니다. 다음 1개에서 10의 농도에 쥐 양고추냉이 peroxidase에 있는 막을 잠복시키십시오, 적어도 2 시간 동안 PBS에 있는 5%milk에서 000. 이전과 같이 세 번 씻은 다음 PBS에서 5분 동안 한 번 씻습니다.
마지막으로, 화학발광 검출 시약에 멤브레인을 10분 동안 배양하고 발광 검출기를 사용하여 검출합니다. 감지기의 자동 노출 설정을 사용합니다. 단백질 로딩은 AM 미토블랙 염색을 사용하여 확인하였다.
이 제어 단계는 활성의 차이가 불균등한 단백질 부하가 아닌 실제 세포 과정에 기인한다는 것을 보장합니다. 여기에 표시된 레인은 첫 번째 실험에서 동일한 양의 단백질이 사용되었음을 나타냅니다. 두 번째 실험에서는 차이점 세포주의 활성 프로필에서 예상되는 차이로 인해 불균등한 단백질 양이 로드되었습니다.
이는 M 17 세포에 대한 활동 프로파일의 검출을 보장하기 위해 수행되었습니다. 용해물은 시스틴 억제제인 에틸 메이드로 배양되었으며 웨스턴 블롯에서 감소된 신호로 이어져야 합니다. 멤브레인은 항 HA 1차 항체에서 배양되었습니다.
쥐 말 무 peroxidase, 그리고 나서 화학발광 이미징을 사용하여 검출. 프로브를 사용하여 dubs를 성공적으로 태깅하면 멤브레인의 각 레인에 프로파일이 생성됩니다. 서로 다른 분자량에서 밴드의 강도는 dub 효소의 활성 수준에 해당합니다.
세포주에 걸친 다양한 dubs의 활성 수준 차이는 he a 및 M 17 세포에서 U CHL 1과 같은 유사한 단백질을 비교할 때 분명해집니다. 이 절차를 수행한 후. 병리학적 과정이 막 결합 소기관에서 유비퀴틴 효소 활성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 질문에 답하기 위해 세포 내 분획과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 활성 부위 유도 프로브를 사용하여 유비퀴틴화 효소 활성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 특수한 프로브를 사용하여 세포 내 탈유비퀴틴화효소의 활동을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 여러 효소 활동의 검출을 가능하게 하여 잠재적인 치료 표적에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 생화학
배경
- 탈유비퀴틴화효소는 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다.
- 이들의 활동을 이해하면 새로운 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.
- 현재의 방법은 여러 효소 활동을 효과적으로 시각화하지 못할 수 있습니다.
- 이 프로토콜은 이러한 한계를 해결하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 배양된 세포에서 탈유비퀴틴화효소의 활동을 시각화합니다.
- 효소 활동 프로파일링을 위한 검출 방법을 개선합니다.
- 효소 활동 분석을 통해 잠재적인 치료 표적을 식별합니다.
사용된 방법
- 세포를 고집도로 배양하고 수확합니다.
- 농축된 용해액을 생성하기 위해 부드러운 기계적 용해를 수행합니다.
- 효소를 헤마글루티닌 유래 프로브와 함께 배양합니다.
- 웨스턴 블로팅 및 화학 발광 검출을 사용하여 활동을 평가합니다.
주요 결과
- 이 방법은 여러 탈유비퀴틴화효소 활동의 시각화를 가능하게 합니다.
- 웨스턴 블로트 결과를 기반으로 활동 프로파일을 생성합니다.
- 결과는 기존의 방법과 비교하여 이 기술의 효과를 입증합니다.
- 이 접근법을 통해 잠재적인 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 탈유비퀴틴화효소를 연구하기 위한 강력한 방법을 제공합니다.
- 세포 환경에서 효소 활동을 시각화하는 능력을 향상시킵니다.
- 이 결과는 새로운 치료 전략의 개발에 기여할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Measuring deubiquitinating enzyme activity enables target validation in neurodegenerative and oncological pathways where ubiquitin-proteasome dysregulation is implicated. This assay provides a rapid, multiplexed readout of functional enzyme states, supporting early hypothesis testing and mechanistic de-risking. By capturing activity profiles across cell lines, it informs portfolio triage and lead identification efforts in target-rich disease areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking enzyme activity to disease-relevant phenotypes.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct visualization of active site engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing active from inactive enzyme pools in complex lysates.
- Operational Value: Accelerates target triage by profiling multiple deubiquitinating enzymes in a single assay format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized lysate systems for downstream compound screening against deubiquitinating enzyme activity.
- Operational Value: Generates quantitative, reproducible activity readouts compatible with Western blot detection platforms.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by using active site-directed probes that report functional enzyme states.
- Operational Value: Enables scalable evaluation of compound effects on enzyme activity across multiple targets simultaneously.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase activity measurements to preclinical validation through disease-relevant cell line comparisons.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying conserved activity patterns across models.
- Scientific Value: Aligns with translational biomarker strategies by monitoring enzyme activity as a functional readout of pathway modulation.
- Operational Value: Provides mechanistic de-risking data that informs target selection for IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, enabling activity-based screening and validation cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing differential enzyme activity between disease and control models.
- Screening: Delivers assay-ready lysates with quantifiable activity outputs for compound library evaluation.
- Analytics: Generates chemiluminescent signal intensities that enable comparative analysis of enzyme activity states.
- Translational Research: Connects early activity profiles to preclinical continuity through cross-model validation in neuronal and cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling deubiquitinating enzyme activity across diverse therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in target mechanism of action.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized probe-based labeling and lysis procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on measurable activity changes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, lysis optimization, and Western blot detection.
- Depends on access to hemagglutinin-derived active site probes and chemiluminescent imaging systems.
- Necessitates standardization of lysis buffer composition and protease inhibitor use across teams.
- Involves adaptation considerations for tissue samples versus cultured cells in probe accessibility.
- Limited by probe specificity and potential off-target labeling under suboptimal incubation conditions.
