의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상

본 절차의 전반적인 목적은 제브라피쉬 유충에 세균성 병원체인 streptococcus IEA를 미세 주입하여 숙주의 면역 반응을 비침습적으로 실시간 영상화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 미세 주입 바늘에 세균 현탁액을 채우고, 마취된 제브라피쉬 유충을 아가로스 주입 몰드 위에 정렬시킵니다. 그다음, 세균 현탁액을 유충의 이낭(otic vesicle)에 미세 주입합니다.

그런 다음 주입된 치어를 저융점 아가로스(low melt agarose)에 고정합니다. 마지막으로 추적을 용이하게 하기 위해 숙주 면역 세포를 광표지(photo label)하고, 공초점 현미경을 사용하여 감염 상태를 이미지화합니다. 궁극적으로 이와 같은 귀포(otic vesicle) 내 streptococcus IEA 미세 주입과 이어지는 광표지 및 공초점 현미경 관찰은 제브라피시 치어의 숙주 면역 반응을 연구하는 데 사용됩니다.

꼬리 정맥 주사와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이낭 주입법이 국소적인 세균 감염을 유도하여 투명한 제브라피시 유생 내에서 숙주와 병원균의 상호작용을 비침습적으로 이미징할 수 있게 한다는 점입니다. 우선 E3 배지에서 1.5~2% 고융점 agar 용액을 준비하고, 용액이 투명해질 때까지 전자레인지로 가열합니다. 용액이 식으면 페트리 접시에 agar를 붓되, 접시 바닥을 덮을 정도로만 적당량을 넣고 가볍게 돌려 펴줍니다.

aros가 응고되면, 헹궈서 건조시킨 젤 콤(gel comb)의 고정단이 페트리 접시 상단에 걸치고 홈이 파인 끝단이 aros에 닿도록 위에 놓습니다. 콤이 최대한 수평을 유지하며 하단 aros 층과 30도 각도를 이루도록 합니다. 콤과 하단 aros 층 사이의 접점에 aros를 소량 더 부어 새로운 aros 층이 콤의 웰(well) 부분을 덮도록 합니다.

빗(comb)을 제거하기 전에 완전히 식히십시오. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 웰에서 돌출된 아가로스 조각들을 제거하십시오. 주입 몰드 위에 E three 배지를 붓고 4 °C에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 SNEA 접종원과 주입용 제브라피쉬 치어를 준비한 후, 마이크로 인젝터를 켜고 시간 범위를 밀리초(milliseconds)로 설정하십시오. 이산화탄소 탱크의 밸브를 열어 가스가 라인으로 유입되도록 합니다. 마이크로 인젝터의 압력이 약 20 PSI가 되어야 합니다. 페놀 레드 및 PBS가 포함된 준비된 SNEA 배양액을 볼텍싱하고, 마이크로 로더 팁을 사용하여 배양액 2~3 µL를 뽑아낸 모세관 주입 바늘에 로딩하십시오. 로딩된 바늘을 마그네틱 스탠드에 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고, 바늘이 현미경 바닥면과 약 45~65도 각도를 이루도록 실체 현미경 아래에 배치하십시오.

먼저 정밀 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨린 후, 마이크로 인젝터의 풋 페달을 눌러 접종액 한 방울을 바늘 끝에 분사합니다. 현미경 접안렌즈의 스케일 바를 사용하여 방울의 직경을 측정합니다. 방울의 직경은 약 0.10 millimeter여야 하며, 이는 부피로 환산 시 약 1 nanoliter에 해당합니다.

방울 크기를 조절하려면 마이크로 인젝터의 지속 시간 설정을 조정하거나 미세 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 더 많이 잘라내십시오. 조직 손상을 최소화하기 위해 주입 시간은 20에서 35 milliseconds 사이로 설정해야 합니다. 다음으로, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 주입 몰드의 12개 웰 각각에 물고기를 한 마리씩 옮깁니다.

그 다음 유리 막대, 헤어 루프 또는 플라스틱 팁을 사용하여, 유충의 머리가 현미경 뒷방향을 향하고 난황낭이 웰의 왼쪽 면에 닿도록 조심스럽게 위치시킵니다. 유충의 왼쪽 귀가 천장을 향하게 합니다. 주입 준비가 완료되면, 마이크로 매니퓰레이터의 노브를 사용하여 장착된 바늘을 이낭(otic vesicle)과 일직선으로 맞추어 두 대상이 모두 동일한 시야에 들어오게 합니다.

바늘 끝으로 이낭(otic vesicle)의 외측 상피층을 뚫어 바늘 끝이 이낭 내부에 위치하도록 합니다. 이제강(cavity)이 파열되지 않도록 충분히 낮은 압력을 사용하여 발판 스위치를 눌러 원하는 용량의 SNEA 1 nanoliter를 주입합니다. 주입이 성공적이라면, 주변 조직이 아닌 이낭 내부만이 phenol red 접종액으로 채워져야 합니다.

바늘을 유충에서 조심스럽게 뽑아낸 후, 5배율 확대 상태에서 주입 플레이트를 손으로 이동시켜 유충이 시야에 들어오게 합니다. 형광 현미경 하에서 형광 표지된 박테리아를 주입하는 경우, 주입된 유충을 시각적으로 스캔하여 박테리아의 침착이 이낭(otic vesicle) 내부에만 일어난 개체만을 선별함으로써 실험 과정 동안 주입량이 일정하게 유지되도록 합니다. 매 48번째 배아를 주입할 때마다, 100 µL의 멸균 PBS가 들어 있는 1.7 mL 원심분리 튜브에 박테리아 현탁액 한 방울을 주입합니다.

그 후 100 µL를 THY plus P auger 플레이트에 도말하고, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 주입 부피 내의 CFU를 결정하기 위해, 주입 램프 상의 유충 12마리 전체 그룹에 주입이 완료되면, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 웰에서 유충을 조심스럽게 꺼내어 새 Petri dish에 옮깁니다. trica 용액을 제거하고 약 2 mL의 신선한 E three 배지로 교체하여 유충이 회복될 수 있도록 합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 배아를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 trica가 포함된 aro를 준비한 후, 실체 현미경 스테이지에서 전이 피펫을 사용하여 마취된 치어 4~5마리를 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 55 °C 항온수조에서 trica 및 aro 용액을 꺼내 실온에서 1~2분 동안 식힙니다.

그동안 마취된 유충으로부터 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 그다음, 표면의 약 절반이 덮일 때까지 냉각된 agros를 디쉬에 붓습니다. 그런 다음 디쉬를 회전시켜 agros를 퍼뜨립니다.

배양 접시 가장자리로 떠오른 유충들을 채취하여 피펫으로 다시 중앙으로 옮깁니다. 그다음 실체 현미경 하에서 긴 피펫 팁을 사용하여 이미징에 적합한 위치로 유충을 조심스럽게 배치합니다. 이삭(otic vesicle) 관찰 시에는 오른쪽 이삭이 위를 향하고 왼쪽 이삭이 배양 접시 바닥에 평평하게 닿도록 유충을 배치하십시오.

디쉬를 옮기기 전, agarose를 약 10분 동안 식힙니다. 그런 다음, agarose 층이 마르지 않도록 trica 및 E three 용액을 소량 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 샘플을 시각화하기 위해 488 nanometer 및 543 nanometer 레이저가 장착된 Zack scan을 사용합니다.

연속 라인 스캔을 사용하여 레이저 출력과 검출기 게인을 조정하십시오. 이미지 획득 제어 창에서 실수로 광전환된 적색 형광이 없는지 확인하십시오. 자극 설정에서 스캐너 도구 사용을 선택하고 main을 선택한 후, 405 nanometer 레이저를 선택하고 출력을 70%로 설정하십시오.

그런 다음 원형 옵션을 사용하여 odic vesicle 내의 관심 영역을 지정하고, 자극 시작 설정에서 사전 활성화(pre activation)를 1프레임으로, 활성화 시간을 60,000 밀리초로 설정하여 직렬 활성화를 선택합니다. 타임 스캔 항목에서 광전환 전후로 각각 1분씩 두 개의 구간을 선택합니다. 타임랩스 시리즈를 시작하여 지정된 관심 영역의 광전환을 유도합니다.

마지막으로, Zack과 488 및 543 nanometer 레이저를 사용하여 샘플을 스캔합니다. 광전환된 적색 형광과 잔류 녹색 형광을 시각화하기 위해, phenol red에 SNEA를 섞어 이낭(otic vesicle)에 미세주입하면 초기에 국소적인 숙주 반응이 나타나며, 올바르게 주입되었다면 주변 조직이나 혈액이 아닌 이낭에서만 확인되어야 합니다. 또는, 표지된 박테리아를 주입한 경우, 주입 직후 감염된 유충을 빠르게 스캔하여 박테리아가 주변 조직이 아닌 이낭 내에만 존재하는지 확인할 수 있습니다.

여기에 표시된 바와 같이, 초기 국소 감염의 미세주입 부위는 백혈구 화학주성을 연구하는 데 유용합니다. 백혈구의 모집은 중성구 과립의 Sudan Black 염색 또는 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피쉬 라인을 이용한 포름알데히드 고정법을 통해 정량화할 수 있습니다. 특히 대식세포 또는 중성구에서 Dendra 2를 발현시킨 결과, 이낭(otic vesicle)에 NEA를 주입하면 감염 후 60분 이내에 중성구와 대식세포의 모집 및 박테리아의 식균 작용이 유도됨이 밝혀졌습니다.

이 그림에서는 감염 5시간 후 이낭(otic vesicle)으로 유도된 두 개의 DRA 라벨링된 대식세포를 광전환(photo converted) 시킨 후, 이후 24시간 동안 추적하였습니다. 광전환된 일부 세포는 이낭이나 머리 영역에 남아 있지만, 여기에서 볼 수 있듯이 일부는 유생의 몸 전체로 퍼져 나간 것이 확인되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 수정 후 3일 된 제브라피시의 이낭에 streptococcus n EEA를 미세 주입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

여기에는 마취된 유충을 주입 몰드에 정렬하고 바늘에 박테리아 접종물을 채우는 과정, 두 번째로 이낭(otic vesicle)에 박테리아를 미세 주입하는 과정, 세 번째로 감염된 유충을 저융점 아가로스에 고정하는 과정, 그리고 네 번째로 공초점 현미경을 사용하여 숙주 백혈구를 광표지하고 생체 내(in vivo)에서 백혈구와 병원균의 상호작용을 이미징하는 과정이 포함됩니다.