루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질

이 절차의 전반적인 목표는 세포를 활성화하지 않고 Luciferase 보고서 구조를 원시 2, 6, 4, 0.7 세포로 transfection하는 것입니다. 이는 먼저 부드러운 피펫팅을 통해 스톡 플레이트에서 원시 2 6 4 0.7 세포를 수확하고 24웰 조직 배양 처리된 플레이트에 세포를 파딩하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 플라스미드의 Firefly 루시페라아제 보고서를 cot transfection하고 대조군은 루시페라제 플라스미드를 세포에 주입

이러한 플라스미드는 내독소가 없어야 합니다. 다음으로, 세포는 원하는 처리로 자극된 후 세포 용해가 수행되고 바닥이 투명한 흰색 96웰 플레이트로 이동합니다. 마지막 단계는 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 분석한 다음 루시페라아제 활성을 실행하여 반딧불이 대 비율을 계산하는 것입니다.

궁극적으로, 자극되지 않은 대조군과 비교한 접힘 변화는 루시퍼 리포터에 대한 자극의 효과를 보여주는 데 사용되며, 이는 관심 유전자의 발현 수준과 상관관계가 있습니다. 기존의 하룻밤 절편과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 transect cell이 세포에 대한 손상을 최소화하면서 휴지 상태로 유지된다는 것입니다. transfection에 사용되는 plaid DNA는 이전에 시판되는 maxi prep kit를 사용하여 추출하고 500마이크로리터의 te buffer에 다시 현탁시켰습니다.

박테리아 세포벽 구성 요소인 lipopolysaccharide 또는 LPS의 존재가 transfection을 방해하기 때문에 흄 후드의 DNA에서 잔류 박테리아 오염 물질을 제거해야 합니다. 500마이크로리터의 페닐 클로로포름 이소아밀 알코올을 플라스미드 DNA에 넣고 15초 동안 세게 흔듭니다. 페놀이 심각한 피부 화상을 일으키므로 주의하십시오.

혼합물을 13, 000 회 G에서 실온 원심 분리기의 5 분 동안 10 분 동안 실온 이동의 상부 수성상의 350 마이크로 리터를 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브로 배양합니다. 350마이크로리터의 TE 완충액을 하부 유기상이 포함된 튜브에 추가합니다. 15초 동안 세게 흔듭니다.

13, 000 번 G에서 5 분 동안 원심 분리기. 실온에서 350마이크로리터의 상부 수성상을 동일한 1.5ml 수집 튜브로 이동합니다. 아세트산나트륨 용액 70마이크로리터를 넣고 잘 섞는다.

700 마이크로 리터의 100 % 이소프로판올을 첨가하십시오. 잘 섞고 13, 섭씨 4도의 10 분 동안 10 분 동안 g 시간 g에 실내 온도 원심 분리기의 10 분 동안 배양하십시오. supinate를 제거하고 펠릿 Vortex에 75%ethanol의 500 마이크로리터를 섞을 것이다 표본, 4 섭씨 온도의 5 분 동안 000 시간 g에 분리기를 추가하고십시오, 상등액을 제거하십시오.

플라스미드 DNA는 펠릿에 있습니다. 튜브의 캡을 열고 실온의 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킵니다. 펠릿은 반투명해야 합니다.

DNA 펠릿에 500마이크로리터의 TE 완충액을 추가하고 섭씨 50-60도에서 10분 동안 가열하여 DNA 펠릿을 용해시킵니다. 마지막으로 분광계로 260나노미터 및 280나노미터에서 DNA 현탁액의 흡광도를 측정합니다. DNA의 농도를 계산하고 그 품질을 평가하기 위해 DMEM에서 엄폐된 원시 2 6 4 0.7 대식세포 세포는 섭씨 37도의 태아 송아지 혈청 9%와 5%의 이산화탄소 인큐베이터를 보충하고 이틀에 한 번씩 배양했습니다.

각 통로 동안, 오래된 배지를 더 작은 부피의 신선한 배지로 교체하고 부드럽고 연속적인 피펫팅 종자로 플레이트에서 세포를 분리합니다. 10cm 조직 배양 처리 접시에 1.5-200만 개의 세포를 transfection 종자 당일에 재고로 사용합니다. 웰당 200, 000개의 세포.

500마이크로리터 용량의 24웰 플레이트에서 9%FCS는 섭씨 37도의 인큐베이터에서 4시간 동안 세포를 배양합니다. 이 절차를 시작하려면 transfection 시약을 어두운 온열 예열, 무혈청 배지 및 DMEM 9%FCS에서 섭씨 37도까지 실온으로 예열합니다. 1.5 밀리리터 튜브에 50 마이크로리터의 무혈청 배지에 0.5 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 첨가합니다.

피펫 팁이 있는 2마이크로리터의 transfection 시약을 액체 와류 표면 아래에 6초 동안 추가합니다. 시약 DNA 혼합물을 실온의 어두운 곳에 30분 동안 그대로 두십시오. 30분 배양 동안 24웰 플레이트의 웰에서 매체를 제거하고 각각에 250마이크로리터의 새로운 DMEM 9%FCS를 추가합니다.

30분 후에 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 시약 DNA 혼합물에 250 마이크로 리터의 DMEM 9 % FCS를 첨가하고 위아래로 퍼닝하여 잘 혼합하고, 300 마이크로 리터의 희석 된 혼합물을 섭씨 37 도의 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 2-4 시간 동안 2-4 시간 동안 배양하는 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가합니다. 2-4시간 후 transfection 용액을 제거하고 500마이크로리터의 DMEM 9%FCS 인큐베이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 24-48시간 동안 추가합니다.

무혈청 배지와 DMEM 9%FCS를 섭씨 37도로 예열하여 이 절차를 시작합니다. 0.75 마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 18.75 마이크로리터의 무혈청 매체 와류에 간단히 첨가하여 혼합하고 5분 동안 실온에서 배양합니다. 다음으로, 0.5 μl의 1 microgram per milliliter DNA 용액을 10분 동안 실온에서 배양된 희석된 transfection 시약에 첨가합니다.

10분 배양 동안 24웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거하고 10분 후에 각 웰에 250마이크로리터의 새로운 DMEM 9%FCS를 추가합니다. 250마이크로리터의 DMEM 9%FCS를 시약 DNA 혼합물에 첨가합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 희석된 혼합물 270마이크로리터를 첨가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 2-4시간 동안 배양합니다.

2-4시간 후 transfection 용액을 제거하고 각각에 500마이크로리터의 DMEM 9%FCS를 추가합니다. 섭씨 37도의 이산화탄소 비율 인큐베이터에서 24-48시간 동안 잘 배양합니다. 형질주입 후 24 내지 48시간 후, 세포를 자극하고 루시페라제 활성을 분석할 수 있습니다.

각 웰의 매체를 새로운 DMEM 9%FCS 방출 250회로 교체합니다.LPS 또는 LPS의 마이크로 방출 50개와 항염증성 사이토카인 IL 10을 원하는 농도로 웰에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터로 되돌리고 2-6시간 동안 자극합니다. 다음으로, 흡인에 의한 자극 용액을 제거합니다.

얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 각각에 200마이크로리터의 1개의 수동 용해 완충액을 추가합니다. 접시를 실온에서 30분 동안 흔듭니다. 30 분 후에, 긁어서 1.5 밀리리터 관에 용해물을 옮기고 20, 000 시간에 분리기를 해서 세포 파편을 제거하십시오.

G는 섭씨 4도 동안 10분 동안 지속됩니다. 40 마이크로 리터의 투명 용해물을 흰색 투명으로 옮깁니다. 하단 96 웰 플레이트는 전체 가시광선 스펙트럼에 걸쳐 광도계로 Lucifer 신호를 측정합니다.

제조사의 프로토콜에 따르면, GFP를 발현하는 플라스미드로 형질주입된 세포의 저세포분석 결과, 지질계 시약은 약 25%의 형질주입 속도를 보인 반면, 단백질 폴리아미드 기반 형질주입은 약 5%의 형질주입 속도를 나타냈으며, I capa b Zeta의 프로모터 영역과 형질주입된 세포에서 루시페라제 신호에서도 형질주입 효율의 차이가 관찰되었다. LPS를 추가하면 반딧불이 루시퍼라제 신호가 증가했습니다. 전형적으로, 세포는 ran luciferase 유전자를 함유하는 control plasmid와 cotransfection되고 반딧불이 luciferase 신호는 ran luciferase 신호로 정규화됩니다.

처리되지 않은 샘플과 처리된 샘플 간의 정규화된 신호를 비교한 결과, LPS는 상향 조절, 프로모터 리포터 및 IL 10의 활성이 LPS의 효과를 억제하는 것으로 나타났습니다. transfection과 stimulation 사이의 휴식 시간을 비교한 결과, 루시페라제 신호가 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 데이터 해석에만 영향을 미쳤습니다. 세포 사멸에 대한 각 형질주입 방법의 영향을 평가하기 위해 단백질 폴리아민 기반 형질주입 시약을 사용한 경우, 세포를 annexin five 및 propidium iodide로 염색하고 유세포 분석으로만 분석했습니다.

지질 기반 형질주입은 부속물 5개 양성 세포의 비율을 약간 증가시켰습니다. 면역 블래팅은 지질 기반 형질주입이 절단된 폴리 a DP 리보스 중합효소 단백질의 비율을 약간 증가시키는 것을 보여주었습니다. 단백질 폴리 기반 형질주입은 그렇지 않았습니다.

세포사멸 세포의 수가 증가했음에도 불구하고 광학 현미경에 의한 세포의 형태는 변하지 않았습니다. 더 중요한 것은, 지질 기반 형질주입된 세포의 생물학적 반응은 절제되지 않은 세포의 생물학적 반응과 동일하게 유지되었고, 둘 다 LPS에 대한 반응으로 유사한 양의 TNF 알파를 만들었고 IL 10의 첨가에 의해 억제되었습니다. 세포가 자극되지 않았을 때 TNF 알파가 만들어지지 않았으며, 이는 형질주입 후 세포가 순진한 상태로 남아 있음을 시사합니다.

세척 후 이 비디오 사용자는 세포의 기본 반응을 변경하지 않는 최소 침습적 방식으로 Lucifer 보고 플라즈마로 원시 2, 6, 4, 0.7 세포를 번역하는 방법을 잘 이해했습니다.