Name: 사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 사이토카인 캡처 시스템을 사용하여 CMV pp65 특이적 임상용 T 세포를 자동으로 분리하는 방법입니다. 이 기술은 GMP 시설 없이도 채택 면역요법에 필요한 고순도 CD4 및 CD8 양성 T 세포를 효율적으로 생산합니다.

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평가 연구를 위해 시약을 제공하고 CliniMACS Prodigy 장비를 제공한 독일의 Miltenyi Biotec에 감사드립니다. 원고를 읽어준 George T. McNamara(MD Anderson Cancer Center 소아과)에게 감사드립니다. 보조금 지원: Cancer Center Core Grant(CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); 버로우즈 웰컴 펀드; 텍사스 암 예방 및 연구소; CLL 글로벌 연구 재단; Noelan L. Bibler의 재산; Gillson Longenbaugh 재단; Harry T. Mangurian, Jr., 백혈병 면역 요법 기금; 맞춤형 암 치료 연구소; 백혈병 및 림프종 학회; 림프종 연구 재단; MDACC의 자매 기관 네트워크 기금; 밀러 재단; 허브 시몬스 씨; Joe H. Scales 부부; 토마스 스콧 씨; 국립 암 연구 재단; 소아암 연구 재단; 윌리엄 로렌스와 블랑쉬 휴즈 아동 재단.

무균 조건에서 재료 1. 준비 (재료 및 장비 표 참조) <ol><li> 0.5 %의 최종 농도로 인간 혈청 알부민 (HSA)가 보충 된 PBS / EDTA 완충액을 제조 3 L (W / V). </li><li> 임상 등급 0.9 %의 염화나트륨 수용액 1 L 가방 및 GMP 급 세포 배양액 2 L을 준비한다. </li><li> 멸균 8 ml의 CMV pp65 유래의 한 유리 병을 재구성하여 CMV 특정 펩타이드 항원 칵테일의 60 nmol의를 준비합니다. </li><li> 루어 / 스파이크 인터 커넥터를 사용하여 50 ml의 볼륨 동결 가방에 거대 세포 바이러스 pp65 유래 펩티드 칵테일을 전송하고 튜브 세트에 칵테일 이후의 유통을 방지하기 위해 집게를 잠금으로 고정. 멸균 조건에서 열기 세포 농축 튜브 세트 (TS 500). </li><li> 멸균 튜브 용접기를 사용하여,이 시간에 펩티드 칵테일 가방 클램프를 열지 마십시오 튜브 세트의 밸브 2 TS (500)에 대한 튜브 연결에 펩티드 칵테일 냉동 가방을 연결합니다. </li><li> 제거 1 × 10 9 T셀룰러 출발 생성물로부터 NC 및 50 ㎖의 전체 부피로 2.5 % HSA를 함유하는 PBS / EDTA 완충액에서 중단. 150 ㎖ 전송 가방에 휴대 제품을 주입. </li></ol> 2. 준비 및 사용 자동화의 세포 농축 시스템 (재료 및 장비 표 참조) <ol><li> 셀 농축 시스템 (그림 1B)에 전환하고 프로그램 &quot;CCS_IFN-γ 심화&quot;를 선택합니다. 절차를 통해 운전자를 안내 지침과 함께 스크린 이미지를 나타내는 사용자 인터페이스를 관찰한다. </li><li> 매개 변수 &quot;운영자&quot;와 &quot;튜브 세트 P / N 번호&quot;를 입력합니다. 다음으로, 대화 형 모니터 화면에 표시되는 지시 사항에 따라 튜브 세트 (500) 자동화 된 세포 농축에 장치를 설치합니다. </li><li> 장치에 중간 버퍼를 연결하는 화면에 표시 단계별 지침을 따른다. 기록 카탈로그 번호와 connectin 전에 시약의 로트 번호악기에 들어. </li><li> 튜브 세트의 최종 점검 한 후, 펩티드 칵테일 가방의 클램프를 엽니 다. 매체 가방을 열고 튜브 세트의 자동 프라이밍을 시작합니다. </li><li> 프라이밍 공정이 완료된 후, 멸균 튜브 용접기의 도움으로 저장 주머니 (200 mL) 중의 염화나트륨 완충액으로 HSA (2.5 %)을 보완. 멸균 튜브 용접기를 사용하여 &quot;응용 프로그램 가방&quot;로 시작하는 휴대 제품을 전송합니다. </li><li> 어댑터를 통해 각각의 튜브에 CCS (IFNγ) 시약을 연결합니다. 농축 과정을하기 전에 세포 물질의 일부​​를 수집하기 원하는 시간을 입력합니다. 검토 및 모든 데이터의 정확성을 확인 / 입력 파라미터. 프로세스를 시작합니다. </li><li> 자동화 된 세포 농축 과정을 시작하기 전에, 품질 관리 가방 (QCB는, 원래의 분수 (오라)는 PBS / EDTA 버퍼로 희석하여 100 ㎖ 실 내용에서 약 1.3 ml에 포함)를 제거합니다. , QCB 인감 무게, 4 ° C에서 저장. </li><li> enrichme 시작NT 과정. 프로세스의 끝에서, 표적 세포는 저류 백에서 용출 완충제 대략 부피로 용출 될 것이다. </li><li> 비 대상 휴대 가방 (NTCB, 부정적인 부분 = NEG)와 대상 휴대 가방 (TCB, 긍정적 인 부분 = POS)를 밀봉하고 각 가방의 무게. 가중치는 나중에 세포 수의 계산에 사용한다. </li><li> 즉시 농축 과정을 거친 후 유동 세포 계측법 분석을위한 분수 당 두 개의 분취 량을 수집하고, 4 ° C에서 샘플의 나머지를 저장합니다. 세포 수의 결정과 농축 성능 분석 (표 1)에 대한 다른 샘플 나누어지는 하나의 샘플 나누어지는을 사용합니다. </li><li> 셀 농축 장비에서 설정 한 튜브를 제거합니다. 장래의 사용을 위해 USB 드라이브에 로그 파일을 전송. 참고 : 모든 시약은 무균 상태에서 준비를해야합니다. 바이오 안전성 II 형 후드의 사용을 적극 권장합니다. 건강한에서 분리 된 정상 상태의 성분 채집 세포 제품 (비는-동원)를 사용하여CMV 혈청 검사 양성인 공여자가 CMV 항원 특이 T 세포를 풍부하게합니다. 만 FDA는 HSA를 사용해야 라이센스. 셀 제조 버퍼 감소 순도와 표적 세포의 수율 감소를 초래할 것이다 낮거나 높은 주변 온도로 +25 ° C로 19 ℃에서 보관한다. </li></ol> 3. 세포 수의 결정 <ol><li> 표 1과 같이. 세포 수에 대한 QCB, NTCB 및 TCB의 분취 량을 4 ℃에서 10 분 동안 어둠 속에서 각각 나누어지는 (역가 1시 11분)에 CD45-VoBlue를 추가하고 품어. </li><li> 원래 분획 및 음 분획 양 분획 450 ㎕의 새로 제조 된 적혈구 세포 용해 액에 1.5 ml의 신선하게 제조 된 적혈구 세포 용해 용액 (1X)를 첨가하고, RT에서 15 분 동안 모든 분획을 배양한다. </li><li> (100 μg의 / ㎖로 희석 한 100) 직전에 분석, 1 μg / ML의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가한다. 세포 수 및 VI를 결정하기 위해 자동 세포 계수기를 사용하여능력. 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 카운터 장치 권장 소프트웨어를 사용합니다. 원래의 음과 양의 분수에 대한 백혈구의 절대 수를 결정합니다. 주 : 세포 수 분석 취한 시료 1 ㎖ 당 가능한 백혈구 세포 수는 세포 분석기 권장 소프트웨어를 이용하여 결정된다. </li><li> 그림 2 (지역 5, 가능한 백혈구)와 같이 영역을 설정합니다. 세포 수를 결정하기 위해 다음과 같은 게이팅 전략을 사용한다. 원래의 분수에서 가능한 백혈구는 그림 2에 표시됩니다. </li><li> 다음과 같이 표시 영역 (그림 2, 1-6) 계층은 다음과 같습니다 1 : 타임 게이트 → 2 : 단일 세포 → 3 : CD45 + 세포 → 4 : 백혈구 (파편 제외) 5 → : 실행 가능한 백혈구 → 6 : 실행 가능한 림프구 </li><li> 음과 양의 분수에 대한 세포 수를 결정하기 위해 동일한 단계를 반복합니다. 전체 분획물의 세포 수를 계산샘플 분획 (표 2)의 전체 부피의 희석 인자를 고려하여. </li></ol> 분리 성능 4. 시험 <ol><li> 사전 냉장 PBS / EDTA 버퍼 / 0.5 % AB 혈청 QCB, NTCB 및 TCB 분획 세포의 분취 액을 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 대기음. </li><li> 포함 된 100 μL 항체, 형광 염색 혼합물에 재현 탁 세포 : CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-를 PerCP, CD20-를 PerCP, CD45-VioBlue 및 안티 IFNγ-PE (역가 1:11)과 4 ℃에서 10 분 동안 어둠 속에서 부화. </li><li> 1 ml의 신선하게 제조 된 적혈구 세포 용해 용액 (1X)를 첨가하고, RT에서 15 분 동안 배양한다. 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기와 뜨는을 대기음. PBS / EDTA 버퍼 / 0.5 % AB 혈청의 적절한 부피로 세포를 재현 탁. </li><li> 100 diluti 1 μg의 / ㎖ 직전 분석 (1의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가) 100 μg의 / ㎖의에. 샘플의 순도를 평가하기 위해 유세포 분석을 수행한다. </li><li> CCS 농축 처리 후의 긍정적 분획에 도시 된 CD3 + T 세포를 결정하기위한 실행 가능한 백혈구 게이팅 전략 CD3 + T 세포를 계산하는 다음 게이팅 전략을 사용한다. 다음과 같이 표시 영역 (도 3a 및도 3b, 1-6)는 계층 적으로 연결되어있다 : 1 : 타임 게이트 → 2 : 단일 세포 → 3 : CD45 + 세포 → 4 : 세포 (파편 제외) 5 → : 실행 가능한 백혈구 → 6 : 실행 가능한 CD3 + 세포 인구 </li><li> CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ +와 CD8 + IFN-γ + CCS 농축 공정 후 T 세포 (표 2)의 주파수를 결정합니다. </li><li> F 아래 도시 CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + CD8 + 및 IFN-γ + T 세포의 빈도를 판별 게이팅 전략을 사용또는 CCS 처리 후 원본과 농축 (캡처) 긍정적 인 부분. 다음과 같이 표시된 영역은 계층 적으로 연결되어 이름이 지정됩니다 : 1 : 타임 게이트 → 2 : 단일 세포 → 3 : CD45 + 세포 → 4 : 세포 (파편 제외) 5 → : 실행 가능한 백혈구 → 6 : 실행 가능한 CD3 + 세포 → 7 : CD4 + 세포 → 7A : CD4 + IFN-γ + 세포 (상자) → 8 : CD8 + 세포 → 8A : CD8 + IFN-γ + 세포 (박스) </li></ol> 주 : 링크 계층의 제 6 표시 영역 (1-6)도 3과 동일하며, 2 영역 최후로도 4 (6-8a)에 나타낸다.

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MD 앤더슨 암 센터 박사 쿠퍼 모두 ZIOPHARM 종양학, Inc. 및 Intrexon 회사에 재무 적 이해 관계를 가지고있다. 2015년 5월 7일에서 박사 쿠퍼는 ZIOPHARM 종양학의 최고 경영자 (CEO)로 임명되었다. 쿠퍼 박사는 지금 MD 앤더슨에서 방문 과학자입니다. 쿠퍼 박사가 설립 그는 인공 뉴 클레아와 Sangamo 생명 과학으로 특허를 보유 InCellerate, 주식을 소유하고있다. 그는 Targazyme, 주식 회사 (이전에 미국의 줄기 세포, 주식 회사), GE 헬스 케어, FERRING 제약, 운명 치료학, 얀센 제약, 브리스톨 - 마이어스 스 퀴브 (BMS)와 참조합니다. 그는 Cellectis의 과학 자문위원회에 있습니다. 그는있는 Miltenyi Biotec은에서 사례금을 받는다.

T 세포 대체 요법은 B 세포 악성 종양을 치료하기 위해 4 실행 가능한 옵션으로 떠오르고있다. 그 치료 가능성은 복제 성 노화 2 부족 표적 항원 특이 T 세포의 수를 주입에 의존한다. 이것은 현재의 양호한 제조 방법을 준수하여 확장 T 세포로부터 항원 특이 T 세포의 순수 인구를 선별함으로써 달성 될 수있다. 두 정렬 절차는 널리 즉, 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)을 정렬 사용되고, 우리가 최근 5 검토 한 바와 같이, 자기 활성화 세포 분류 (MACS)는 CMV 항원 특이 T 세포를 생성한다. 하나 위에 다른 전략을 사용하는 장점은 표 5에 요약되어있다. MACS 기술 FACS 기술에 비해 저렴하고 빠른 방법으로 높은 세포 농축 순도를 제공한다. 세포 농축을위한 일회용 열 및 시약의 추가 사용에 완전히 그것을 만드는 샘플 오염 샘플을 방지쉽게 임상에 적용 할 수 있습니다. 반자동 세포 농축 장치는, 노동 집...

조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 1 이식편 대 종양 효과를 향상시키고, 기회 감염 (2)에 내성을 제공하는 T 세포 대체 요법과 결합 될 수있다. 주입을위한 항원 특이 기증자 유래 T 세포의 생성은 역사적으로 숙련 된 인력 및 GMP를 준수합니다 전문 시설의 사용을 요구하고있다. 이러한 T 세포의 전달 기회 감염 3 해상도뿐만 아니라 하부 암 (4)의 처리 결과이다. 최근 연구자들은 증명 그 천 단지 몇 바이러스 특이 적 T 세포의 대체 전송 (~ 1 × 10 4-2.5 × 105 세포 / kg받는 체중) 성공적 동종 조혈 모세포 5-9 후 편의적 CMV 감염을 치료할 수있다. 관련된 숙련 제조 요건 GMP 시설 제한된 수 및 셀 생산과 관련된 높은 비용 그러나 restr을 갖는다T 세포 치료 (10)를 약속에 icted 환자 액세스 할 수 있습니다. 항원 특이 적 T 세포를 분리하는 한 가지 방법은 CD45 및 IFN-γ을 인식하는 이중 특이 시약을 사용 CCS에 기초한다. 도시 된 바와 같이,이 방법은 자동화 된 세포 농축 CCS 장치 (도 1B)를 이용한 임상 등급 CMV 특이 T 세포를 생성하는데 사용될 수있다. CMV 특정 T 세포는 CMV 혈청 검사 양성인 기증자로부터 백혈구 성분 채집 총 핵 세포 (TNC)와 CMV pp65 유래의 항원에서 중복 펩티드를 배양에 의해 생성됩니다. 인간 백혈구 항원 (HLA)의 맥락에서 디스플레이 이들 펩타이드, IFN-γ를 분비하는 TNC 내의 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 활성화. 이러한 T 세포는 &quot;캡쳐&quot;및 자기 적으로 분리 될 수있다. 제 세대 셀 농축 장치의 운전 (도 1a)는 복수의 착수 GMP 조건 하에서 세포 배양에서 숙련 된 사람이 필요하고, 직원의 코디&quot;캡처 된&quot;생성물을 생성하는 데 필요한 TEPS. 절차는 일반적으로 연속 운전의 12 시간에 10를 요구, 따라서 직원은 가능성이 GMP 시설에서 2 교대에 걸쳐 작업을 할 필요가있다. 이러한 제약은 이제 (도 1b에 도시 된) 제 2 세대의 장치에 의해 구현되어 없어진다. 이 장치는 1 세대 디바이스와 유사한 자기 농축을 수행하고 있지만, unbreached CCS 접근법의 다른 측면을 자동화한다. 이로 인해 공정의 대부분의 직원에 의해 자동으로 달성 될 수 GMP 팀의 부담을 감소시킨다. 장치는 밀폐 시스템으로서 동작하기 때문에, 항원 특이 적 T 세포를 포착하고 측량기를 시작하기 전에 백혈구 성분 채집 분리 및 재료의 제조에 포함 된 단계를 제외한 벤치 탑에서 처리 될 수있다. 전체 계측 및이 제 2 세대 세포 농축 장치의 기능의 세부 사항은 펍 된11 졌으. 여기서는 자동 세포 농축 CCS 시스템을 이용하여 정상 성분 채집 생성물로부터 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 풍부하게하는 단계를 설명한다. 일단 격리 이들 CMV 특이 T 세포는 즉시 환자에 주입 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA 버퍼 3 L 백</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy 튜빙 세트 TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr><tr><td>5 L 폐기물 백</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS 사이토카인 캡처 시스템 (IFN-gamma)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>알부민 (인간) 25%&nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Luer/Spike Interconnector</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % NaCl 용액 (1 L)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>주사용 물</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>MILLEX GV 필터 유닛 0.22 &mu; 엠&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP 미디엄 2L 백</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 백, 150ml(세포 출발 물질용)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS 냉동 백 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>60ml 주사기, 멸균</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Belgium</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CMV 혈청 양성 성분채집술 제품</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Materials</td><td>Manufacturer</td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>AB Serum, GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&gamma;-PE, human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액 (100 &micro; g/ml)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>제조업체</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Device&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS쿼리 분석기 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5415R&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>멸균 튜빙 용접기 SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 t 세포

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

병원균 특이 T 세포의 대체 전송이 방지 및 동종 조혈 줄기 세포 이식 후 발생하는 감염 (CMV)와 같은 사이토 메갈로 바이러스 기회 감염을 치료하는데 사용될 수있다. 타사 도너 포함한 동종 공여자로부터 바이러스 특이 T 세포를 선택적으로 목적하는 T 세포를 전파 항원 구동 자극 반복 라운드를 이용하는 현재 우수 제조 CGMP ()을 준수 생체 전파 될 수있다. 항원 특이 적 T 세포의 식별 및 분리는 감마 인터페론 (IFN-γ)를 분비하는 활성화 된 T 세포의 사이토 카인 캡처 시스템에 기초하여 수행 될 수있다. 제조 공정은 시간 소모적이며, 숙련 작업자를 필요로하지만, 면역 복원 돕는 사이토 카인 캡쳐 시스템 (CCS)의 광범위한 인간 응용이 제한되어왔다. 이제 이러한 CliniMACS 프로디지 같은 2 세대 셀 농축 장치의 개발자동화 덜 노동 집약적 인 시스템을 이용하여 바이러스 - 특이 T 세포를 생성 할 수 있도록 연구자. 이 장치는 자기 임상 등급의 제품을 생성하기 위해, 자기 활성화 세포 분류 기술을 이용하여 표지 된 세포로부터 세포를 분리한다 표지, 폐쇄 시스템으로 설계되며, 벤치 탑에 액세스하여 조작 할 수있다. 우리는이 새로운 자동화 된 세포 농축 장치의 동작은 CMV 혈청 양성 공여자로부터 얻은 정상 성분 채집 생성물로부터 수득 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 제조하는 것이 입증. 이러한 고립 된 T 세포는 다음 직접 기관 및 연방 정부의 규제 감독하에 환자에 주입 할 수있다. 적혈구의 제거를 비롯한 모든 생물 처리 단계는, T 세포, 항원 특이 적 T 세포를, 정제, 분리 및 세정의 자극은 완전 자동화된다. 이와 같은 장치는 애플리케이션에 대한 인간 T 세포 GMP (전용 우수 제조 밖에 제조 할 수있는 가능성을 높이기) 대신 시설은 직원이 여러 제품을 생산하는 자동화 된 프로토콜을 감독 할 수 혈액 은행 시설에서 생산 될 수있다.

이 연구에서, 자동화 된 세포 농축 CCS 시스템 CMV pp65 유래 특이 T 세포의 자동화 제조에 사용 하였다. CMV 특이 T 세포는 세 성분 채집 셀 제품에서 농축 하였다. 정상 상태의 성분 채집 제품은 10 총 10 핵 세포 (TNC)를 CMV 혈청 검사 양성인 기증자에서 2 시간에 걸쳐 수확 생성되었습니다. 10 9 TNC는 다음의 CMV pp65 유래 유래 펩티드 (60 nmol의) 4 시간 및 T 세포는 자동화 된 세포 농축 장치의 CCS를 사용하여 분리 하였다 분비 IFN-γ에 대한 활성화되었다. 운영자는 모든 시약 및 튜브 세트를로드 할 실험의 시작 부분에 필요했다. 장치를 시작으로 개봉 초기에서 시스템의 설정은 120 분에 약 60했습니다. 기계는 시약 및 배관 세트는 (예 밤새) 무인 작동 시스템을 가능하게함으로써,로드 된 후에 시작하도록 프로그램 될 수 있습니다. 연산자의 특성을 수행하기 위해 15 시간 후 다시 필요했다세포의 순도 및 생존 능력에 대한 최종 제품....

이 프로토콜의 목표는 폐쇄형 사이토카인 포획 시스템을 통합하고 전담 직원이나 GMP 시설의 사용이 필요하지 않은 벤치탑의 자동화된 2세대 세포 농축 장치를 사용하여 병원체 특이적 임상 등급 T 세포를 제조하는 것입니다. 생성된 거대세포바이러스 pp65 특이적 T 세포는 환자에게 직접 투여할 수 있습니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

본 절차의 목적은 사이토카인 캡처 시스템을 사용하여 입양 면역 요법을 위한 임상 등급의 항원 특이적 T 세포를 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 CMV 양성 공여자로부터 얻은 단핵 세포를 CMV PP 65에서 유래한 중첩 펩타이드 패널과 함께 배양하여 T 세포를 활성화합니다. 그다음, 활성화된 항원 특이적 CD 45 양성 IFN gamma 발현 T 세포를 사이토카인 캡처 방식으로 분리합니다.그 후 유세포 분석법을 통해 CMV 특이적 T 세포의 수와 순도를 평가합니다. 결과적으로, 이 사이토카인 캡처 시스템을 사용하여 CD4 및 CD8 양성이며 IFN gamma를 발현하는 CMV 특이적 T 세포를 높은 비율로 수확할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 완전히 자동화되어 있으며, 캡처된 임상 등급 T 세포를 분리하는 데 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(GMP)을 준수하는 시설이 필요하지 않다는 점입니다.이 방법은 세포 생산과 관련된 비용을 줄이는 동시에 이러한 세포의 접근성을 높이는 방법과 같이, 입양 세포 치료 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 다수의 환자에 대해 CMB 항원 특이적 T 세포의 분리에 관한 통찰을 제공할 수 있습니다. 관심 있는 특정 감염원으로부터 유도된 펩타이드 항원으로 세포를 자극함으로써 다른 병원체에 대한 T 세포의 반응 연구에도 적용할 수 있습니다.이 자동화 시스템은 사이토카인 포획 과정을 간소화하며, 작업자의 직접적인 감독 없이도 포획된 T 세포 생성물을 필요에 따라 생산할 수 있게 합니다. 절차를 시작하기 전, 루어 스파이크 인터커넥터를 사용하여 새로 재구성한 C-M-V-P-P 65 펩타이드 칵테일을 50 milliliter 용량의 냉동 백으로 모두 옮깁니다. 잠금 포셉으로 백을 고정하고 멸균 조건에서 세포 농축 튜빙 세트를 개봉한 후, 튜빙 세트에서 벤트 바이알 어댑터와 멸균 필터를 제거하고 루어 스파이크 인터커넥터를 루어 연결부에 나사식으로 결합하여 펩타이드 칵테일 백을 연결합니다.그 다음, 총 10억 개의 핵 세포를 갓 조제한 50 milliliters의 P-B-S-E-D-T-A 완충액 및 인간 혈청 알부민 혼합액에 부유시키고, 이 세포 생성물을 150 milliliter 전송 백에 주입합니다. 이제 세포 농축 시스템의 전원을 켜고 사이토카인 캡처 시스템의 IFN Gamma Enrichment Program을 선택합니다

automated-cell-enrichment-cytomegalovirus-specific-t-cells-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

이 비디오는 자기 분리기를 사용하여 음성 선택을 통해 마우스의 비장에서 T 세포를 농축하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 특정 세포 표면 항원에 대한 항체 또는 리간드를 사용하여 고갈을 위해 샘플의 다른 세포를 표적으로 삼는 것을 포함합니다.

T-세포 농축: 자기 분리를 통해 혼합 세포 집단에서 T-세포를 분리하는 기술

순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포의 단핵 세포 유래 사이토카인 유도 CD3+CD56+ 킬러 세포의 격리 및 확장을 수행하는 프로토콜을 제시하고 시험관 내 진단 유세포 분석 시스템을 사용하여 혈액학적 및 고체 암 세포에 대한 그들의 세포 독성 효과를 예시한다.

암 치료를 위한 사이토카인 유발 킬러 T 세포의 격리 및 확장

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

이 프로토콜은 기체 투과성 급속 증식(G-Rex) 장치를 사용하여 채택 세포 치료(ACT) 제품인 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포와 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포의 확장 가능성을 설명하며, 임상적으로 중요한 환경에서 효율적이고 견고한 성장을 입증합니다.

GMP 확장 가능한 장치에서 CAR-T 및 사이토카인 유도 킬러 세포의 효율적이고 빠른 생성

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

배우세요 사이토카인 캡처 시스템을 사용하여 CMV pp65 특이적 임상용 T 세포를 자동으로 분리하는 방법입니다. 이 기술은 GMP 시설 없이도 채택 면역요법에 필요한 고순도 CD4 및 CD8 양성 T 세포를 효율적으로 생산합니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

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