정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

본 절차의 전반적인 목표는 B 세포에서 생성된 항체를 클로닝하고 발현시키는 것입니다. 이는 먼저 혈액이나 흉선과 같은 관련 소스 조직에서 B 세포를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 FACS를 수행하여 IgG 생성 양성인 B 세포 집단을 선택하는 것입니다.

다음으로, Epstein-Barr virus 감염과 C-P-G-O-D-N 2006에 의한 toll-like receptor nine 활성화를 통해 세포를 불멸화하여 배양합니다. 마지막 단계로 ELISA를 통해 IgG 생성 양성 반응을 보인 클론에서 RNA를 분리하고, IgG 경쇄와 중쇄 모두에서 copy DNA를 생성합니다. 최종적으로, IgG 서열을 포유류 발현 벡터에 클로닝하여 다량의 단클론 인간 IgG를 생산할 수 있습니다.

파지 디스플레이 기술과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 원래의 IgG 중쇄 및 경쇄 쌍이 유지된다는 점입니다. 이 방법은 병원성 자가항체의 발견 및 기능적 특성 분석과 같이 자가면역 분야의 핵심 질문에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 환자 유래 시료 및 EBV 바이러스를 다루는 작업은 위험할 수 있음을 유의하십시오.

EB 바이러스는 인간 병원체이므로, 이러한 단계를 수행하는 동안 항상 VSL 2 수준의 예방 조치를 취하고 적절한 보호구를 착용해야 합니다. PBMC를 염색하기 전, 6 mL의 완전 RPMI 1640 배지가 담긴 25 cm 플라스크에 세포를 분주하고 하룻밤 동안 회복시킵니다. 세포를 블로킹하고 세척한 후, 0.5 mL의 배지가 들어 있는 튜브에 PBMC를 수집하여 원심 분리합니다. 그런 다음 세포를 라벨링 버퍼에 재부유시키고 세포 수를 측정합니다.

다음으로, 200 µL의 버퍼에 500만 개의 세포가 포함된 FACS 튜브 2개를 준비합니다. anti CD 22 P-E-R-C-P 10 µL 또는 anti IgG pe 40 µL를 첨가하고, 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 세척, 여과 및 분리합니다. 목적은 이중 양성 세포의 수를 측정하는 것입니다.

먼저 분류된 P BMC를 C PG 2006 및 EBV가 첨가된 완전 배지인 RPMI 1640에서 마이크로리터당 세포 1개 농도로 희석하는 것으로 시작합니다. 그 다음, 후드 내에서 EBV와 CPG 2006이 포함된 세포 희석액 110 µL를 WI 38 조사 세포가 미리 도말된 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 두 웰에 분주합니다. 웰당 50개의 세포를 감염시키는 조건이 최적화되어 있으며, 이는 단일클론 항체를 얻을 가능성을 높여줍니다.

하지만, 이를 PCR로 확인하는 것을 권장합니다. 일주일간 배양한 후, 현미경으로 세포를 관찰하여 B세포의 성장을 확인하십시오. 2주 후에는 배지를 교체하며, 각 웰에서 90 µL의 배지를 천천히 흡입하여 새 플레이트로 옮깁니다.

Eliza를 통해 IgG 생성 여부를 테스트합니다. 그 후 IL 2가 포함된 신선한 보충 배지 100 µL를 각 웰에 다시 첨가합니다. 배양 3~4주 차까지 클론의 성장을 계속 모니터링합니다.

매주 배지 교체를 반복합니다. 클론 확장 방법은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 배지 교체 시 수집한 상청액의 IgG 생산량을 확인합니다.

먼저, ELISA 플레이트를 준비하여 각 웰에 코팅 버퍼로 1:200으로 희석한 goat anti-human FC 항체 50 µL를 분주합니다. 플레이트를 배양하고 세척한 후, 웰당 100 µL의 블로킹 버퍼로 웰을 블로킹하고 플레이트를 다시 배양합니다. 블로킹 배양이 끝나면 플레이트의 액체를 페이퍼 타월에 털어 제거합니다.

플레이트 준비가 완료되면, 상층액을 4배 부피의 RPMI로 희석하십시오. 그다음 표준 대조군의 경우, RPMI 내의 인간 IgG 용액을 1000 nanograms per milliliter에서 15.6 nanograms per milliliter까지 연속 희석하십시오.

공시료(blank)도 함께 포함하십시오. 상층액 또는 표준물질 50 µL를 각 웰에 분주하고, 동일한 방식으로 ELISA 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 항체 친화도를 테스트하기 위해 상층액의 추가 희석액을 분석하는 추가적인 ELISA를 설정할 수 있습니다. 배양이 끝나면 플레이트를 세척하십시오.

그 후 각 웰에 peroxidase가 접합된 fab two가 포함된 배양 버퍼 50 µL를 분주합니다. 1시간 더 배양하고 다시 세척한 다음, 각 웰에 TMB가 포함된 기질 용액 100 µL를 추가합니다. 그 후 청색이 나타나 안정화될 때까지 플레이트를 최대 10분 동안 배양합니다.

그 후 반응을 중단시키고 흡광도를 측정합니다. 측정된 흡광도가 공시료(blank)보다 3 표준편차 이상 높은 클론 상층액은 양성으로 판정합니다.

인간 IgG 항체의 경우, 추가 분석을 통해 항원 특이성을 검출할 수 있습니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 따라 양성 클론으로부터 copy DNA를 합성하십시오. 그런 다음 IgG 중쇄, kappa 및 lambda 사슬에 대한 PCR을 설정하십시오.

결과에서 400~550 base pairs 크기의 중쇄(heavy chain)를 확인하십시오. 300~400 base pairs 크기의 경쇄(light chain)를 확인하십시오. 만약 밴드가 나타나지 않는다면, 생성물 1 µL를 템플릿으로 사용하여 PCR을 다시 수행하십시오.

새로운 생성물들은 적절한 범위 내에 있어야 합니다. 그런 다음 최적의 생성물을 클로닝하십시오. 우선, 생성물들의 서열을 분석합니다. 전기영동도(electropherograms)는 깨끗해야 하며 단일 immunoglobin 서열과 일치해야 합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 정제된 PCR 산물을 1 µg의 플라스미드 DNA에 클로닝하십시오. 반드시 16 °C에서 하룻밤 동안 라이게이션을 수행하십시오.

T4 DNA Ligase를 사용하여 보충제가 포함된 DMEM에서 HX 세포를 준비하고, 75 square centimeter 배양 플라스크에서 75% confluence까지 배양합니다. 각 중쇄-경쇄 형질전환을 위해, 4.5 micrograms의 중쇄 벡터, 3 micrograms의 경쇄 벡터 및 50 microliters의 polyethaline 용액을 포함한 serum이 없는 DMEM 1.75 Milliliters 혼합물을 준비합니다. 이 혼합물을 HX 세포가 담긴 플레이트에 조심스럽게 첨가하고 플레이트 위에서 용액을 원형으로 흔들어 섞어줍니다.

플레이트를 하룻밤 동안 배양한 다음, 매일 배양액을 수집하기 시작합니다. 수집한 배양액은 무혈청 배지로 교체합니다. 배양액에는 항체가 포함되어 있으며, FACS를 통해 CD 22 및 IgG 양성 p BMC를 분리한 후 4일 동안 매일 수집할 수 있습니다.

IgG 항체를 생성하는 B 세포인 이중 양성 세포 영역을 증식을 위해 별도로 수집하였습니다. PBMC의 약 1%가 이 이중 양성 집단에 해당하였습니다. EBV 불멸화 및 CpG 2006 자극을 5주간 처리한 후, 불멸화된 클론을 분리하였습니다.

WI 30 피더 세포는 더 길쭉한 섬유아세포 형태를 띠며, B 세포 클론은 라운드 바텀 멀티웰 플레이트 중앙에 군집을 이루어 성장하는 매우 작은 원형 세포로 나타납니다. 성장하는 클론의 상층액을 사용하여 IgG에 대한 ELISA 테스트를 수행하였습니다. 양성 클론은 공시료 값보다 3 표준편차 높은 값을 가진 클론으로 평가되었습니다.

양성 클론에서 얻은 적어도 3개의 상층액이 eli에서 양성 반응을 보였습니다. 양성 클론의 항체는 면역글로불린 중쇄 및 람다 경쇄의 가변 및 불변 영역을 클로닝한 후 서열 분석을 수행하여 중쇄와 경쇄의 특성을 규명할 수 있었습니다. 이 절차를 따랐습니다.

항체, 유전자 사용, 유전적 다양성 등의 추가적인 질문에 답하기 위해 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 자가면역 분야의 연구자들이 중증 근무력증과 같은 자가면역 질환의 질병, 병리와 관련 치료 전략을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 병원성 항체의 발견이 염증 활성이 없는 경쟁 항체와 같은 새로운 치료법의 개발로 이어질 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 중증 근무력증과 같은 질환의 진단 및 치료로까지 확장됩니다.