Name: 정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 정렬된 불멸화된 B세포에서 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체를 생성하는 방법을. EB 바이러스를 이용한 세포 불멸화와 ELISA 검증을 포함한 이 기술은 면역학 연구와 자가면역 질환 치료제 개발에 활용됩니다.

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에 연구 계약 미구엘 세르 베트 (ISCIII CD14 / 00,032) (GN-G.). 에 과학 연구 &quot;번역 상 신경 과학 프로그램의 대학원&quot;에 대한 네덜란드기구 (022,005,019) (CH)에서 원정대. Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) 및 협회 프랑세즈 contre 레 근육 병증에에서 보조금 (PM-M.) 뿐만 아니라 과학 연구에 대한 네덜란드기구의 왔노 원정대 (916.10.148) 네덜란드의 뇌 재단의 교제로 (FS2008 (1) -28)와 ML에 Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) ( ). 우리는 유동 세포 계측법에 의해 정렬 B 세포에있는 그녀의 도움을 Jozien 야스퍼스 감사합니다.

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 논문에서는, 인간 PBMCs를으로부터의 IgG 항체의 생성을위한 모든 단계가 상세하게 제시된다. 이 프로토콜은 이전에 발행 된 기술에 비해 몇 가지 장점을 포함하고 있습니다. 장점 중 하나는 생성 된 항체는 B 세포 클론 원래 쌍에 대응하는 중쇄 및 경쇄를 유지한다는 것이다. IgG의 항체의 확인은 인간 공여자의 어떤 유형으로 수행 될 수 있으며, 백신 접종 5에 의한 면역 반응의 악화가 필요 없다. 피더 세포와 섬유 아세포 세포주 WI38의 사용은, 그들이 이전에 작동을 설명 피더 세포로서 사용 PBMC를 비교하여, 형태 학적으로 상이하고 구별하기가 매우 용이하기 때문에, 성장하는 클론의보다 빠른 검출을 허용 1,6- 8. 또한 피더 세포 WI38 등의 사용이 용이하게 각 실험 전에 해동하여 배양 할 수있는 세포의 분취 큰 양의 동결을 선호. 치명타 중 하나이 프로토콜의 iCal 단계는 출발 물질이다 PBMC를. 혈액은 원심 분리에...

이 문서의 목적은 구체적으로 생성하여 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 얻은 인간 IgG 단일 클론 항체를 특성화하는 방법을 설명하기위한 것이다. 인간 항체를 연구 관심은 연구의 다양한 분야에서 성장했다. 특히, 많은 연구 그룹들은 자동 항체 1-3로 인한 병리학에 관심을 갖고있다. 우리는 복제 및 병원성 자동 항체 1을 특징으로했다. 자동 항체의 연구는 경쟁 항체 (4)를 사용하여, 예를 들어, 자신의 목표를 ​​확인하고 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 인간 항체의 연구는 또한, 백신 접종 5 이후에 면역 반응을 평가하기 위해 노출 및 특정 병원균 6 공부 내성되었다 된 개인의 항체 프로파일을 특성화하기 위해, 즉, 다른 연구 분야에서 관심을 가질 수있는 항체에자연 레퍼토리 7,12. 몇 가지 기술은 재조합 인간 단일 클론 항체 8-12를 생성하기 위해 개발되어왔다; 이들의 대부분은 파지 디스플레이와 B 세포의 불멸화를 사용한다. 파지 디스플레이의 사용은 광범위하게 새로운 항체 (13)의 발견에 적용되어왔다. 그러나 그것은가 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 쌍 프로세스 해리 즉 있다는 큰 단점을 갖는다. 인간 B 세포 또는 EBV 변환과 하이 브리 도마의 생산은 이러한 단점을 극복한다. 우리는 수신자 같은 수용체 9 (TLR-9)를 통해 6,12 폴리 클로 날 B 세포 자극과 조합 EBV B와 흉선 세포의 감염을 사용한다. 본 논문에서는 구체적으로 우리가 시험 관내 항체 생성에 PBMC 분리의 모든 단계의 전체 개요, IgG의 인간 항체의 개발을 위해 사용하는 기술에 대해 설명합니다. 이프로토콜은 인간 IgG 프로파일의 임의의 유형의 분석에 이용 될 수있다. 실험실에서의 IgG 항체를 생산하는 B 세포는 PBMC를 성공적으로 분류 한 후 나머지로부터 분리되었다. 쉰 정렬 B 세포 8은 멀티 웰 플레이트에 도금 단일 B 세포의 클로 날 팽창을 위해, EBV 및 TLR-9를 활성화하여 불멸화 될 수있다. 피더 세포로서 인간 배아 폐 조직으로부터 섬유 아세포, 불멸화 B 세포의 가시화를 용이 세포주 WI38을 사용되었다. 이러한 B 세포에서의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 PCR에 의해 수득 될 수 있고, 항체 &#39;유전자는 면역 글로불린 G 발현 벡터에 클로닝하고 시험 관내에서 생산. 이 기술을 사용하여, 도너 검색된 정확히 같은 단일 항체 서열과 항체를 연구 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>히스토파크-1077&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>용액은 폴리수크로오스와 디아트리조산나트륨을 함유하고</td></tr> 있습니다. <tr><td>FACSAria II 세포 분류기&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 U-바닥 마이크로 웰 플레이트&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 매체&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>B95-8 세포주의 30% v/v EBV 함유 상등액&nbsp; &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3.4 x 108 복사/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38 셀&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>인터루킨-2</td><td>로슈&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10799068001 ELISA 플레이트</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 단편 염소 Anti-Human IgG, Fc & gamma; Fragment Specific (unconjugated)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% 무지방 분유 (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>인간 IgG&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>HUMAN IgG 정제 면역글로불린, 5.6 mg/ml</td></tr><tr><td>염소 F(ab)2 항인간 IgG Fc&gamma; (과산화효소(PO)와 결합)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 리더 (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>퍼킨 엘머&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>과산화효소 접합 AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5&micro; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 세포 직접 cDNA 합성 시스템&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR 시스템 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고순도 RNA 분리 키트&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>역전사 시스템 키트&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>재조합 Taq DNA 중합효소</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 (2 &mu; l)</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>울트라퓨어 아가로스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 주기 시퀀싱 키트&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0.1 ml 반응 플레이트 (MicroAMP Optical 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>유전자 분석기 ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; 유능한 세포 (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>SOC 매체</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB 기반 아가르 배지에 Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)이 보충된</td> <td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) 기반 액체 배지 (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep 키트&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (ND1000 분광 광도계)</td><td>Blasticidin</td>이 보충된 Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB 기반 한천 배지(Fast-Media Blast Agar)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) 기반 액체 배지 Blasticidin(Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20,000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10,000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1,000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10,000 U/ml, 10x CutSmart 버퍼&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10,000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5,000 U/ml, 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP 감열성 알칼리 인산가수분해효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro; l, 10x FastAP 버퍼</td></tr><tr><td>DH5&alpha; 유능한 세포&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 안티-휴먼 IgG</td><td>BD Pharmingen 555787</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-CD22, PerCP-Cy5.5, 클론: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye 터미네이터 v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

정렬 된 불멸화 된 b 세포로부터 재조합 인간 igg 단일 클론 항체의 생성

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

인간 단클론 항체를 생성하는 새로운 방법을 찾는 것은 면역 치료제 개발을 포함하여 기초 과학 및 응용 과학 모두에 중요한 활발한 연구 분야입니다. 그러나, 이러한 항체를 확인하고 생산하는 기술은 어려운 경향이 있으며, 때로는 항체의 중쇄 및 경쇄 쌍이 해리됩니다. 여기에서는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및 Toll-like 수용체 9 활성화를 통한 불멸화를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 재조합 단클론 항체를 생산하는 비교적 간단하고 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다. 적절한 염색을 통해 항체를 생산하는 B 세포를 분리하여 후속 불멸화 및 클론 증식을 수행할 수 있습니다. 불멸화된 B 세포 클론에 의해 생성된 항체 전사체는 PCR에 의해 증폭될 수 있으며, 해당 중쇄 및 경쇄 쌍으로 염기서열분석되고 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝될 수 있습니다. 이 기술로 얻은 항체는 자가면역을 포함한 관련 인간 면역 반응을 연구하고 새로운 치료법의 기초를 만드는 강력한 도구가 될 수 있습니다.

CD22과의 IgG 양성 세포를 염색 한 후 선별 게이팅은도 1에 도시되는 본 이미지에서 이중 양성 세포의 면적 -.의 IgG 항체를 생산하는 B 세포 - 분리 튜브 내의 모든 셀을 정렬하도록 선택된다. 분석에서, 전체 PBMC를 약 1 %의 양이 두 집단에 해당한다. 얻어진 분류 세포의 수는 제 1 항에서 얻은 셀의 개수에 의존 할 것이다. EBV 불멸화 된 CpG 및 (ODN2006) 자극 5 주 후에 다른 결과는도 2에 도시되어 성장하는 클론의 검출이 용이하다.; WI38 피더 세포는 섬유 아세포보다 긴 형상을 가지며, B 세포 클론 환저 멀티 웰 플레이트의 중앙 클러스터로서 성장하는 매우 작고 둥근 세포를 보인다. 이 단계에서, 일부 클론이 성장을 시작하는 것이 분명하다. 그러나 성장 속도는 웰스 contai 일부 변수가 될 물론 수닝은 세포가 모두 증가하는 어떤 세포가 없을 수 있습니다 불후. <p ...

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

본 절차의 전반적인 목표는 B 세포에서 생성된 항체를 클로닝하고 발현시키는 것입니다. 이는 먼저 혈액이나 흉선과 같은 관련 소스 조직에서 B 세포를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 FACS를 수행하여 IgG 생성 양성인 B 세포 집단을 선택하는 것입니다.다음으로, Epstein-Barr virus 감염과 C-P-G-O-D-N 2006에 의한 toll-like receptor nine 활성화를 통해 세포를 불멸화하여 배양합니다. 마지막 단계로 ELISA를 통해 IgG 생성 양성 반응을 보인 클론에서 RNA를 분리하고, IgG 경쇄와 중쇄 모두에서 copy DNA를 생성합니다. 최종적으로, IgG 서열을 포유류 발현 벡터에 클로닝하여 다량의 단클론 인간 IgG를 생산할 수 있습니다.파지 디스플레이 기술과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 원래의 IgG 중쇄 및 경쇄 쌍이 유지된다는 점입니다. 이 방법은 병원성 자가항체의 발견 및 기능적 특성 분석과 같이 자가면역 분야의 핵심 질문에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 환자 유래 시료 및 EBV 바이러스를 다루는 작업은 위험할 수 있음을 유의하십시오.EB 바이러스는 인간 병원체이므로, 이러한 단계를 수행하는 동안 항상 VSL 2 수준의 예방 조치를 취하고 적절한 보호구를 착용해야 합니다. PBMC를 염색하기 전, 6 mL의 완전 RPMI 1640 배지가 담긴 25 cm 플라스크에 세포를 분주하고 하룻밤 동안 회복시킵니다. 세포를 블로킹하고 세척한 후, 0.5 mL의 배지가 들어 있는 튜브에 PBMC를 수집하여 원심 분리합니다. 그런 다음 세포를 라벨링 버퍼에 재부유시키고 세포 수를 측정합니다.다음으로, 200 µL의 버퍼에 500만 개의 세포가 포함된 FACS 튜브 2개를 준비합니다. anti CD 22 P-E-R-C-P 10 µL 또는 anti IgG pe 40 µL를 첨가하고, 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 세척, 여과 및 분리합니다. 목적은 이중 양성 세포의 수를 측정하는 것입니다.먼저 분류된 P BMC를 C PG 2006 및 EBV가 첨가된 완전 배지인 RPMI 1640에서 마이크로리터당 세포 1개 농도로 희석하는 것으로 시작합니다. 그 다음, 후드 내에서 EBV와 CPG 2006이 포함된 세포 희석액 110 µL를 WI 38 조사 세포가 미리 도말된 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 두 웰에 분주합니다. 웰당 50개의

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

이 동영상은 중쇄 및 경쇄 유전자를 가진 플라스미드 벡터를 도입하여 포유류 세포에서 항체를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 벡터는 폴리에틸렌과 상호 작용하고 폴리플렉스를 형성하여 세포에 들어갑니다. 나중에, 그들은 개별 단백질로 번역되어 완전한 항체로 조립되어 세포 외 배지로 분비됩니다.

포유류 세포 배양에서 재조합 단클론 항체 생성

이 비디오는 항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술을 보여줍니다. 분리된 항원 특이적 B 세포에서 복제된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 진핵생물 발현 벡터는 폴리플렉스를 사용하여 포유류 세포에 도입됩니다. 일단 세포 내부로 들어가면 이러한 벡터는 번역을 거치고, 그 결과로 생성된 중쇄 및 경쇄 펩타이드는 항체로 조립되어 세포에서 분비됩니다.

항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인...

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

C57BL / 6 마​​우스는 HC의 pathogenesis을 연구하고 최상의 모델을 제공하는 데 사용되었습니다. 우리는이 곰팡이에 대한 체액성 면역의 가능성 혜택을 탐구하고 [히스톤 H2B와 열 충격 단백질 60kDa로] 여러 mAbs를 생성 우리가 intraperitoneal 행정부 이후에 그들의 보호 효능에 대한 테스트 것을.

반대 단클론 항체의 수동적 관리 H. capsulatum 및 기타 곰팡이 병원균을

배우세요 정렬된 불멸화된 B세포에서 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체를 생성하는 방법을. EB 바이러스를 이용한 세포 불멸화와 ELISA 검증을 포함한 이 기술은 면역학 연구와 자가면역 질환 치료제 개발에 활용됩니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

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