동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화
2015년 7월 2일
우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다. 이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다. 이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 줄기세포를 알긴산, 하이드로겔 캡슐에 안전하고 효과적으로 삽입하고 캡슐 내에서 배양하여 응집 및 미세환경을 제어하기 위해 먼저 여과된 줄기세포 현탁액과 알긴산나트륨 용액을 혼합하여 수행하는 것입니다. 그런 다음 혼합물을 주사기로 옮기고 주사기 펌프에 설정하기 전에 주사기에 동축 노즐을 설치합니다. 다음으로, 액적은 co-flow 질소 가스로 세포 현탁액을 배출한 다음 수집 및 염화칼슘 용액을 사용하여 준비합니다.
그런 다음 캡슐을 폴리 L 라이신으로 처리하여 세포 누출을 방지하고 EDTA로 처리하여 캡슐화된 세포를 회전 진탕 상태로 배양하기 전에 내부 캡슐을 유동화합니다. 마지막으로, 세포는 EDTA와 막의 물리적 파괴에 의해 캡슐에서 수집됩니다. 궁극적으로, 만능 줄기 세포의 알긴산 캡슐화는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 경험하는 순전한 스트레스를 제한합니다.
이 방법은 세포 이식의 대규모 확장 및 줄기 세포 틈새 시장 연구와 같은 생물학 및 생물 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 3분 동안 160배 G로 원심분리 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수집하여 세포 캡슐화를 시작합니다. Resus로 유도 만능 줄기 또는 IPS 세포 펠릿을 세척하고, Resus 후 완충 식염수와 원심분리를 힙에 현탁하고, 세포를 현탁시키고 완충 식염수를 힙화합니다.
40미크론 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하여 노즐을 막을 수 있는 큰 응집체를 제거합니다. 다음으로, 2ml의 여과된 세포 현탁액과 3ml의 5% 알긴산 나트륨 용액을 혼합합니다. 3%나트륨 알긴산염에서 5밀리리터 세포 현탁액을 얻기 위해 세포 밀도는 밀리리터당 100만 개 이상의 세포를 DIR로 만듭니다.
셀 현탁액을 5 밀리리터 주사기에 수집 한 후 주사기에 동축 노즐을 설치하고 주사기 펌프에 놓고 동축 노즐의 외부 바늘을 통해 질소 가스 흐름을 방출하고 내부 노즐을 통해 셀 현탁액을 배출합니다. 250 밀리리터의 0.5 % 염화칼슘 용액에 방울을 모으고 60-90 RPM으로 교반하면서 10-20 분 동안 dation을 기다립니다. 더미 완충된 식염수로 세척한 후, 수집된 캡슐은 벌거벗은 캡슐로 활용하여 부피당 0.05% 중량의 칼슘 알긴산 캡슐을 배양합니다.
Poly L lysine 용액을 섭씨 37도에서 5분 동안 넣고 5% 이산화탄소를 흔들어 줍니다. 캡슐을 튜브에 모으고 완충 식염수를 듬뿍 뿌려 세척한 후 10%FBS가 함유된 DMEM에서 배양합니다. 표면의 전하를 중화하기 위해 생성된 캡슐을 코팅된 캡슐로 사용하여 속이 빈 캡슐을 생성합니다.
10 millimolar EDTA를 함유한 완충 식염수 더미에서 캡슐을 5분 동안 배양합니다. EDTA 처리된 캡슐은 중공 캡슐로 사용됩니다. 캡슐화된 세포를 섭씨 37도에서 진탕하고 배양 후 10일 동안 5%의 이산화탄소를 75RPM으로 배양하고, 캡슐을 37°C에서 10밀리몰 EDTA와 5%이산화탄소로 10분 동안 수집 및 배양합니다.
폴리-l 라이신 처리 없이 1000배 G로 3분 동안 원심분리하여 알기네이트 캡슐에서 세포를 수집합니다. 알긴산 캡슐을 폴리 L 라이신으로 처리한 경우, 주사기에 부착된 바늘로 약 10회 위아래로 피펫팅하여 알기네이트 폴리 L 라이신 멤브레인을 절단합니다. 바늘 직경은 캡슐 크기보다 작아야 하며 이 실험에는 25게이지 바늘이 사용됩니다.
1000에서 5에 원심 분리 후에, 5 분 동안 000 시간 G, mRNA 견본이 세포에서 모이는 경우에, 끊긴 alginate 많은 L lycine 막에서 세포 펠릿을 엄격히 모으십시오, 남아 있는 alginate 많은 L lycine 막은 고속 사진기에 의해 가시되는 것과 같이 mRNA 정화를 방해할지도 모른다. 배출된 알긴산 용액은 배출 직후 구형을 형성합니다. 분당 1리터 미만의 질소 유속으로 현탁액이 배출되면 액적의 크기가 균일합니다.
그러나 질소 흐름이 분당 1리터보다 높으면 액적이 분해되고 액적의 크기가 이질적이 됩니다. 이를 감안할 때 이 방법을 사용하여 500미크론보다 작은 액적을 준비하기가 어렵습니다. 겔화 과정에서 알긴산 나트륨 방울은 염화칼슘 용액에서 구형 알긴산 칼슘 캡슐을 형성합니다.
그러나 알긴산 나트륨의 농도가 충분히 높으면 알긴산 나트륨의 농도가 낮으면 캡슐의 nons, spherical 및 nonoo 모양이 발생하여 코딩 과정에서 문제가 발생합니다. 알긴산 나트륨 농도가 충분하지 않더라도 칼슘 농도를 증가시켜 구형 캡슐을 형성할 수 있습니다. 그러나 약 50 밀리몰의 염화칼슘은 캡슐화에 적합한데, 그 이유는 염화칼슘의 농도가 너무 높으면 세포 성장과 생존력이 감소하기 때문입니다.
캡슐화된 세포는 캡슐에서 자랄 수 있지만 알긴산 폴리 L 라이신 코팅이 없는 캡슐에서는 세포 누출이 발생할 수 있습니다. 생쥐 IPS 세포의 경우, 세포는 각 알긴산 칼슘 캡슐에 디스크 모양의 응집체를 형성하는 반면, 세포는 서로 뭉쳐서 각 중공 캡슐에 단일 구형 응집체를 형성합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포를 캡슐화하고 배양하여 크기를 제어하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 동축 노즐을 사용하여 알지네이트 하이드로겔 캡슐에 만능 줄기 세포를 캡슐화하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 현탁 배양 중 세포 응집과 전단 응력을 최소화하여 줄기 세포 틈새 연구와 대량 생산에 적합합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기 세포 생물학
- 하이드로겔 기술
- 세포 배양 기술
배경
- 만능 줄기 세포는 재생 의학에 중요한 잠재력이 있습니다.
- 캡슐화 기술은 세포 생존율과 기능성을 향상시킬 수 있습니다.
- 알지네이트 하이드로겔은 세포 배양을 위한 지지적인 미세환경을 제공합니다.
- 세포 응집 제어는 효과적인 줄기 세포 응용을 위해 중요합니다.
연구 목적
- 줄기 세포 캡슐화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 전단 응력을 줄이고 세포의 과도한 응집을 방지합니다.
- 줄기 세포 틈새 및 대량 생산에 대한 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 줄기 세포 현탁액을 나트륨 알지네이트 용액과 혼합합니다.
- 방울 형성을 위해 동축 노즐을 사용합니다.
- 젤화를 위해 칼슘 염화물 용액에 방울을 수집합니다.
- 안정성을 위해 캡슐을 폴리 L 리신과 EDTA로 처리합니다.
주요 결과
- 알지네이트 캡슐에 만능 줄기 세포의 성공적인 캡슐화.
- 배양 중 세포 응집 및 전단 응력 감소.
- 배양된 세포의 미세환경에 대한 향상된 제어.
- 줄기 세포의 대량 생산 가능성 입증.
결론
- 캡슐화 방법은 줄기 세포 생존율 유지에 효과적입니다.
- 이 기술은 다양한 줄기 세포 연구 맥락에서 적용될 수 있습니다.
- 향후 연구는 재생 의학에서의 추가 응용을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Controlled encapsulation of pluripotent stem cells using a co-axial nozzle addresses key challenges in scalable suspension culture, including aggregation control and microenvironment modulation. This method enables reliable mass production of stem cells for early-stage drug screening and regenerative research. Its tunable capsule properties support predictive confidence and workflow integration across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stem cell behavior in defined microenvironments for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of pluripotency and cell viability under scalable conditions.
- Facilitates hypothesis-driven studies on stem cell niche factors and extracellular matrix effects.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, size-controlled cell encapsulation for reproducible assay development.
- Reduces variability in cell aggregation, supporting quantitative screening outputs.
- Enables preparation of uniform biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Allows investigation of disease-relevant stem cell responses in controlled 3D environments.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by maintaining cell phenotype and viability.
- Offers a platform for testing microenvironmental modulation and biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation method fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling scalable cell production and standardized assay inputs.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on cell-matrix interactions and aggregation control.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound testing.
- Analytics: Provides measurable parameters such as capsule size, cell viability, and aggregation state.
- Translational Research: Maintains cell integrity for downstream disease modeling and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable encapsulation workflow adaptable to various stem cell types and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in stem cell assays.
- Operational Value: Standardizes encapsulation and culture conditions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell handling and encapsulation techniques.
- Needs access to co-axial nozzle systems, syringe pumps, and controlled gas flow instrumentation.
- Demands cross-team standardization of capsule size, alginate concentration, and coating protocols.
- Adaptation may be needed for different stem cell lines or target applications.
- Capsule stability and cell retrieval protocols must be optimized to balance containment and downstream analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Cell Encapsulation into Alginate Hydrogel Capsules and Treatment of Alginate Capsules
3:44
Culture and Collect Cells in Alginate Capsules
4:56
Results: Visualizations of Alginate Capsule Formation and Morphologies of Mouse iPS Cells in Capsules
6:43
Conclusion
