Name: 동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 동축 노즐을 사용한 다능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화 방법으로 세포 응집과 전단 응력을 최소화하여 대량 생산 및 줄기 세포 니치 연구에 활용할 수 있습니다.

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본 연구는 일본과학기술개발기구(JST)의 S-Innovation 프로젝트, 도쿄대학 생명혁신대학원프로그램(GPLLI), 일본과학진흥회 청년과학자연구펠로우십의 지원을 받았습니다. 고속 카메라를 사용하여 동영상을 촬영해 주신 nac Image Technology Inc.에 감사드립니다.

1. 준비 재료 <ol><li> 10 mM의 HEPES 버퍼를 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조정하고 0.9 %의 염화나트륨을 추가합니다. </li><li> 1.1 준비 HEPES 완충 식염수를 혼합하여 5 % 알긴산 용액 10 mM의 EDTA 솔루션을 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조절합니다. </li><li> 121 ℃에서 20 분 동안 시약 (1.1, 1.2)를 압력솥. </li><li> DMEM 10 % ES-자격 FBS와 90 마이 토마 이신 C의 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 내 배양 피더 세포로 처리됩니다 2.0 × 10 6 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 세포, - 1.2 계층화 젤라틴 코팅 60mm 요리를 준비합니다 - 120 분. </li><li> (ES-정규화 FBS 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 비 필수 아미노산 및 항생제 50 μM을 함유하는 5 ㎖의 DMEM 고 글루코오스의 존재 하에서 피더 세포와 접시에 세포 (IPS) 마우스 유도 된 다 능성 줄기 유지 페니실린 G 나트륨, 황산 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖의 100 단위 / ㎖ 및 250 ng를 amphoteri / ㎖CIN의 B). </li><li> 시드 4 × 10 5 만능 줄기 젤라틴 코팅 60mm 접시에 세포 및 CO 2를 37 ° C에서 그들을 품어 5 %. 배양시 배양 배지 매일을 변경합니다. 3 후 - 문화의 4 일, 37 ° C에서 0.05 % 트립신은 0.02 %의 EDTA를 포함하는 500 μL와 1 분 5 % CO 2 세포를 Trypsinize. 그 후, 배양 접시에 10 번을 두드려서 세포를 분리. </li><li> 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리기 세포 현탁액 (세 번 1,000 μL 마이크로 피펫과 피펫 팅하여 단일 세포로 분리 마우스 IPS 세포 다음) FBS와 항생제 ES-자격의 10 % DMEM의 2.5 ML을 추가하고 상층 액을 제거하고 세포를 계산 . 셀 카운팅 후, 젤라틴 코팅 접시에 세포를 수집하고 시드 MEF 세포로부터 만능 줄기 세포를 분리하기 위해 30 분 동안 배양한다. 세포를 카운팅 한 후 (일반적으로 1 - × 106 세포 / 접시가 수집 될 수 있음), 4 × 105 IPS 세포를 시드요리. </li></ol> 알긴산 하이드로 겔 캡슐에 2 셀 캡슐화 <ol><li> 1.5 및 1.6에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 세포를 수집. 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리 후, 세 번 HEPES 완충 식염수와 유도 만능 줄기 세포 펠렛을 씻는다. HEPES 완충 식염수에 세포를 다시 현탁 한 후, 별도로 노즐을 막히게 할 수있는 큰 응집체를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터. </li><li> HEPES 완충 식염수 내에서 세포 현탁액 2 ㎖ 및 5 % Δ1g의-나트륨 용액 3 mL를 섞는다. 마지막으로 3 % Δ1g의-나트륨 용액 내 세포 현탁액 5 ml를 얻을 수있다. 셀 밀도는 바람직하게 10 개 이상 6 세포 / ml이다. </li><li> 5 ML의 주사기로 세포 현탁액을 수집 한 후, 주사기에 동축 노즐 (그림 1A, B)를 설치하고 주사기 펌프를 설정합니다. 발광 N 2 가스 유동 (저급 1L / 분 이하) 동축 노즐의 외 바늘 통해내부 노즐을 통해 세포 현탁액을 추방. </li><li> 0.5 % CaCl2를 250 ml의 용액에 방울을 모아서 10 기다려 - 60-90 rpm에서 교반하면서 겔을 20 분. </li></ol> 알긴산 캡슐 3. 치료 (선택 사항) <ol><li> 0.05 %에서 Δ1g의 - 칼슘 캡슐 부화 폴리 -L- 라이신 (PLL) 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 용액 (/ V w) CO 2. </li><li> HEPES 완충 식염수와 캡슐을 세척 한 후, DMEM는 그 표면에 전하를 중화하기 위해 10 % FBS를 함유하는 배양에서 그들을. 코팅 캡슐 (그림 1C)로 활용. </li><li> 5 분 동안 10 mM의 EDTA를 함유하는 HEPES 완충 식염수에서 캡슐 부화. EDTA 처리 된 캡슐 빈 캡슐 (그림 1C)로 사용된다. </li></ol> 알긴산 캡슐 4. 문화 및 수집 세포 <ol><li> 37 ℃ 및 5 % CO 2에서 진탕 75 rpm에서 캡슐화 된 세포를 부화십일합니다. </li><li> 수집하고 10 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 10 mM의 EDTA에 캡슐을 배양하고, 5 %. 3 분 1,000 × g에서 원심 분리하여 PLL을 처리하지 않고 알긴산 캡슐에서 세포를 수집합니다. </li><li> 5 분 동안 5,000 ×의 G - 알지네이트 캡슐이 PLL로 처리하는 경우, 최대 피펫 아래로 열 배 1,000에서 주사기와 원심 분리기를에 부착 된 바늘에 의해 ALG 파일-PLL 막을 휴식. 니들 직경은 캡슐의 크기 및 25 G (260 μm의) 바늘이 실험에서 사용되는보다 낮아야한다 (600 μm의) </li><li> 당신이 세포에서 mRNA의 샘플을 수집 할 경우 원심 분리 후, 깨진 Δ1g의-PLL 막으로부터 엄격하게 세포 펠렛을 수집합니다. 남은 Δ1g의-PLL 막은 가능한 mRNA의 정제를 방지한다. </li></ol>

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</ol>

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<html> 캡슐화 배양 직접 현탁 배양 물과 비교 될 수있다. 현탁 배양은 캡슐화 방법보다 다 능성 줄기 세포를 대량으로 얻을 수있는 간단한 방법이다. 그러나, 현탁 배양 세포의 집계를 제어하는​​ 것은 여전히​​ 어렵습니다. 밀봉 방법에서, 세포 응집은 캡슐에 제한되며, 따라서 잘 제어 할 수있다. 이전 간행물은 큰 세포 덩어리가 자유 현탁 배양 7에 등장하는 반면 캡슐화 된 세포, 균일 한 크기의 집계를 형성 것으로 나타났다. 또한, 이전 보고서는 강한 교반 PS 세포의 직접 서스펜션 문화에 세포 죽음을 일으키는 것을 증명; 따라서 제한된 교반 속도를 필요로. 반대로, 심지어 캡슐화 서스펜션 전단 응력 조건에서 세포를 보호 할 수있다. 부유 세포를 성장하는 경우에 밀봉 방법 따라서 운전 조건에 유연성의 수준을 허용한다. &quot;ove_content는&gt; 캡슐화는 양산 공정의 변형뿐만 아니라 줄기 세포 연구 모두에 유용한 도구이다. 줄기 세포의 캡슐화가 세포 외 기질 및 성장 인자를 포함하는...

유도만능줄기세포(iPS cell)는 재생 의학에서의 역할로 인해 현재 집중적인 연구의 원천입니다. 그러나 조직 재생에는 엄청난 양의 세포가 필요합니다. 예를 들어, 1형 당뇨병 환자1에게는 약 10억 개의 췌장 세포가 필요합니다. 그러나 기존의 접시 배양은 1 × 105 cells/cm2만 얻을 수 있으므로 1형 당뇨병 환자를 치료하기에 충분한 줄기세포 유래 췌장 세포를 얻기 위해1m2의 배양 면적이 필요합니다. 따라서 재생의학에는 마이크로캐리어2 및 현탁 배양과 같은 만능 줄기세포의 대량 배양을 위한 시스템의 개발이 필요합니다. 현탁 배양은 유망한 대량 배양 방법이지만 인간 iPS 세포의 직접 현탁 배양에서는 세포 응집을 제어하는 것이 어렵습니다3. 실제로, 부유 세포는 전단 응력에 노출되어 세포 손상3 또는 분화4를 유발합니다.
현탁액 배양과 관련된 문제를 해결하기 위해 하이드로겔 기반 캡슐화에 대한 연구가 수행되었습니다. 하이드로겔 캡슐에서 세포는 배지의 흐름으로부터 보호됩니다. 이전 보고서에서는 세포 캡슐화를 위해 아가로스5, PEG6 및 알긴산염(Alg)을 포함한 다양한 유형의 하이드로겔을 사용하는 방법을 문서화했습니다. Alg-Ca 하이드로겔은 Alg-Ca 하이드로겔이 알긴산 용액을 CaCl2 용액에 떨어뜨린 직후 형성되고 효소 또는 킬레이트 시약에 의해 쉽게 분해되기 때문에 세포 캡슐화에 가장 유용한 하이드로겔 중 하나입니다. 
여기에서는 동축 노즐을 사용하여 iPS 셀에 대한 안정적인 알긴산 캡슐화 공정을 확립했습니다. 액적을 형성하기 위해N2 가스 흐름을 사용하면 오일과 같은 다른 시약이 필요 없이 세포를 균일한 캡슐로 캡슐화할 수 있습니다. 이 방법에서 N2 의 유속과 CaCl2 및 알긴산의 농도는 캡슐의 크기, 모양 및 균일성에 영향을 미치는 주요 작동 조건입니다. 이 보고서는 고속 카메라와 현미경을 사용하여 이러한 작동 조건을 최적화한 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>마우스 배아 섬유아세포</td><td>Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>마우스 유도 만능 줄기세포</td><td>RIKEN Bio resorce 센터</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES 인증&nbsp; FBS</td><td>GIBCO</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>항균 항생제</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO 백혈병 억제 인자</td><td>Merck Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>26 g/16 G 바늘</td><td>Hoshiseido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>나트륨&nbsp; 염화물</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>알긴산 나트륨</td><td>Wako</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Wako</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>폴리 L- 라이신 (MW = 15,000 - 30,000)</td> <td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>DOJINDO</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>실링 펌프</td><td>AS ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>nac 이미지 기술</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

만능줄기세포(PS cell)는 재생 의학 및 약물 스크리닝에서의 역할로 인해 집중적인 연구의 초점입니다. 그러나 이러한 응용 분야에서 PS 셀을 사용하기 위해서는 대량 배양 시스템의 개발이 필요합니다. 현탁 배양은 PS 세포의 대량 생산을 위한 유망한 배양 방법 중 하나이지만, 응집 제어 및 배양 배지의 전단 응력 제한과 같은 몇 가지 문제는 아직 해결되지 않았습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 동축 노즐을 사용하여 알긴산 칼슘(Alg-Ca) 캡슐화 방법을 개발했습니다. 이 방법은N2 가스를 함께 유동시켜 캡슐의 크기를 쉽게 제어할 수 있습니다. 제어 가능한 캡슐 직경은 500μm보다 커야 하는데,N2 가스의 유속이 너무 높으면 액적이 분해되어 이종 크기의 캡슐이 생성되기 때문입니다. 또한, Alg-Na 및 CaCl2 의 농도가 낮으면 구형 캡슐이 생성되지 않습니다. Alg-PLL 코팅이 없는 Alg-Ca 캡슐은 쉽게 용해되어 세포를 수집할 수 있지만 Alg-PLL 코팅이 없는 캡슐에서 잠재적으로 누출될 수도 있습니다. 실제로, 알긴산-PLL 코팅은 세포 누출을 방지할 수 있지만 파손되기 어렵습니다. 이 기술은 캡슐화를 통해 세포외 기질과 분비 인자의 농도 등 세포를 둘러싼 미세환경을 변형시킬 수 있기 때문에 줄기세포 틈새 연구와 PS 세포의 대량 생산에 활용할 수 있습니다.

프로토콜 2.5에서 추방 알지네이트 솔루션은 추방 후 즉시 구형 (- H 그림 2A)를 형성한다. 현탁액을 1L / 분 이하 N 2 유량으로 배출되는 경우, 액 적의 크기가 균일 한 (도 2I)이다. N 2 흐름은 1L / 분보다 큰 경우, 액체 방울 (도 2G, 흰색 화살표로)을 분해 및 액 적의 크기가 불균일 (도 2J)를하게된다. 이 주어지면,이 방법을 사용하여 500 ㎛의보다 작은 액 적을 제조하는 것은 곤란하다. Δ1g의-나트륨 (3 % 이하)의 농도가 충분 (도 3E-H, K, I) 인 경우, 겔화 과정 (프로토콜 2.4)에서, Δ1g의 - 나이 CaCl2를 용액에 구형 Δ1g의 - 칼슘 캡슐을 형성 방울입니다. Δ1g의-나트륨 (3 % 이하)의 농도는 낮은...

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다. 이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다. 이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

본 실험 과정의 전반적인 목적은 줄기세포를 알긴산 하이드로겔 캡슐 내에 안전하고 효과적으로 내포시키고, 세포의 응집과 미세환경을 제어하기 위해 캡슐 내에서 배양하는 것입니다. 이는 먼저 여과된 줄기세포 현탁액과 알긴산 나트륨 용액을 혼합함으로써 이루어집니다. 그 후 혼합액을 주사기에 옮기고, 주사기 펌프에 거치하기 전 주사기에 동축 노즐을 장착합니다. 다음으로, 질소 가스를 함께 흘려보내며 세포 현탁액을 배출하여 액적을 형성한 후, 염화칼슘 용액에서 이를 수집합니다.그 다음, 세포 누출을 방지하기 위해 캡슐을 poly L lysine으로 처리하고, 캡슐 내부에 포집된 세포를 회전 진탕 조건에서 배양하기 전 캡슐 내부를 유동화하기 위해 EDTA로 처리합니다. 마지막으로, EDTA 처리와 막의 물리적 파쇄를 통해 캡슐에서 세포를 수집합니다. 결과적으로, 다능성 줄기세포의 alginate 캡슐화는 세포의 과도한 응집을 방지하고 현탁 배양 시 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다.이 방법은 세포 이식의 대량 확장 및 줄기세포 니치(niche) 연구와 같이 생물학 및 생의학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 160 ×g에서 3분간 원심분리한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수집하여 세포 캡슐화를 시작하십시오. 유도만능줄기세포(IPS cell) 펠릿을 HEPES 완충 식염수(HEPES buffered saline)에 현탁하여 세척하고 원심분리하는 과정을 3회 반복하십시오.노즐을 막을 수 있는 커다란 응집물을 제거하기 위해, 40 micron 셀 스트레이너(cell strainer)로 세포 현탁액을 여과합니다. 다음으로, 여과된 세포 현탁액 2 mL와 5% sodium alginate 용액 3 mL를 혼합합니다. 3% sodium alginate 내에서 5 mL의 세포 현탁액을 얻기 위해 세포 밀도는 1 million cells per milliliter 이상이어야 합니다.세포 현탁액을 5 mL 주사기에 수집한 후, 주사기에 동축 노즐을 장착하고 주사기 펌프에 설치합니다. 동축 노즐의 외측 바늘을 통해 질소 가스를 흘려보내고 내측 노즐을 통해 세포 현탁액을 배출합니다. 액적을 250 mL의 0.5% 염화칼슘 용액에 수집하고, 60~90 RPM으로 교반하며 10~20분 동안 가교되도록 기다립니다. HEPES 완충 식염수로 세척한 후, 수집된 캡슐을 네이키드 캡슐로 사용하며, 캡슐을 처리하기 위

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

세포 및 입자의 관성 주문과 monodisperse 드롭 생성을 결합하여, 우리는 kHz에서 속도에서 한 방울의 세포 또는 입자의 원하는 숫자를 캡슐하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 번 단일 및 이중 입자 술을 정렬되지 않은 캡슐 분들을 초과 효율성을 보여줍니다.

높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

여기에서는 복강 내 지방 조직에서 열 생산을 위해 지질을 소비하고 비만 마우스의 에너지 소산을 증가시키는 이화 세포의 캡슐화 프로토콜을 제시합니다.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

이 동영상과 원고는 단순 교반 용기를 사용하여 큰 배치로 생산할 수있는 0.5 % ~ 10 % 알긴산 염 비즈로 포유류 세포를 캡슐화하는 유제 기반 방법을 설명합니다. 캡슐화 된 세포는 시험 관내에서 배양 되거나 세포 치료 응용을 위해 이식 될 수 있습니다.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

여기에 제시된 것은 혈관 및 기타 관 구조의 조직 공학에 적합한 중공 비계의 한 단계 제작을 위한 사용이 간편한 코어/쉘, 3차원 생체 인쇄 설정입니다.

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.

인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

학습하세요 동축 노즐을 사용한 다능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화 방법으로 세포 응집과 전단 응력을 최소화하여 대량 생산 및 줄기 세포 니치 연구에 활용할 수 있습니다.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

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