Name: 마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 배우세요 마우스 뇌실 뇌실막 섬모의 생체 외 라이브 영상 기법을 통해 섬모 운동 주파수와 각도를 분석하는 방법을. 이 기술은 뇌척수액 순환과 신경과학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 편집 서비스에 대해 Charisse Montgomery에게 감사의 뜻을 표합니다. A. Alomran의 연구는 약리학 석사 학위 요건을 부분적으로 충족합니다.이 연구는 W.A.A를 위한 University of Toledo의 교내 창업 기금과 S.M.N.을 위한 NIH 보조금(DK080640)의 지원을 받습니다.

동물 사용에 대한 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 관리 및 사용을위한 설명서에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 실험 동물의. 1. 뇌 추출, 단면 및 조직 준비 <ol><li> 깊이 5 분 동안 CO 2 질식으로 안락사에 의해 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 희생. 자궁 전위에 의해 죽음을 확신합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 헤드를 청소합니다. </li><li> 제 두개골을 노출시키기 위해 머리 위쪽부터 떨어져 피부를 당겨 멸균 가위 집게를 사용하여 두개 절제술을 수행한다. </li><li> 그런 다음, 두개골이 노출 될 때, 뼈 조각별로 조각을 벗겨 후방 측에서 시작하여 전방쪽으로 이동하여 두개골을 제거합니다. 뇌 심실을 파괴하지 않도록주의해야합니다. </li><li>전체 뇌를 수집합니다. </li><li> 페니실린 10000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 및 예열 10,000 ㎍ / ml를 함유 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액을 함유 100mm 배양 접시에서 뇌를 놓고 37 ° C까지. </li><li> 날카로운 블레이드와 손으로 정중 시상면에 뇌를 슬라이스하고, vibratome를 사용하여 각 반에서 첫 번째 100-200mm 섹션을 구하십시오. </li><li> 미리 예열 37 ° C, 인산 완충 식염수 (1X PBS) 용액으로 뇌 조직을 헹군다. </li><li> 즉시 DMEM / 높은 포도당 미디어 37 ℃로 미리 예열 뇌 섹션을 배치합니다. </li></ol> 2. 라이브 영상 구성 및 설정 <ol><li> DMEM / 높은 포도당 미디어 1 ㎖를 포함 30mm의 유리 바닥 배양 접시의 뇌 조직 섹션을 배치합니다. 95 % / 5 % O 2 / CO 함량이 37 ° C, (도 1의 현미경 밀폐 챔버 환경을 조정 </str옹&gt;). </li><li> 60X 대물 오일 침지 렌즈를 사용하여, 제 60X 대물 렌즈의 기름 방울을 배치하고 정기적 DIC와 셀에 초점 뇌실막 세포 / 섬모 영상 수집은 광을 투과. </li><li> 섬모 구타 영역에서 기포 운동 종류를 만들 때 다음, 뇌실막 운동성 섬모의 위치 기준으로 DMEM 거품 이동 방향을 따른다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 뇌실의 운동성 섬모와 건강한 세포를 포함하는 영역을 선택합니다. 뇌실막 섬모가 발견되면, 빛을 조정하고 양호한 화상을 얻는 데 초점을 맞춘다. </li><li> MetaMorph로부터 촬상 소프트웨어를 이용하여 특정 용도에 따라 라이브 영상 파라미터를 설정한다. 본 데모에서는 객관적인 60X 5 ~ 10 밀리 초 노출 시간과 함께 1 × 1 카메라 비닝 세트 이십사 비트 이미지를 획득. </li><li> 최소 특급을 위해 최적 수준으로 현미경 조리개를 열어 DIC 이미지 수집osure 시간. 지체없이 신속하고 즉시 이미지 수집을 제공하기 위해 카메라에 라이브 영상 스트림을 관찰한다. 충분한 화상 콘트라스트를 획득하기 위해 최소 노출 시간의 요건에 기초하여 섬모 박동의 속도를 계산한다. </li></ol> 3. 데이터 시각화 및 분석 <ol><li> 1 분에 구타의 수를 계산하여 섬모의 구타의 수를 계산합니다. 비디오의 속도를 감소시키고 셀 카운터 또는 유사한 공구를 사용하여 비트 수를 카운트하여 수행. </li><li> 매질의 주파수를 계산하기 위해, 비디오 초의 수를 얻기 위해 획득 프레임 또는 시간 경과 화상의 수에 의해 기록되는 노광 시간을 곱한다. (예 : 노출 시간 5 밀리 초 200 프레임 = 1000 밀리 초 또는 1 초). </li><li> 초 당 하나의 박동 수로 표현되는 주파수를 획득하기 위해 1 초 매질의 수를 계산한다. 1 초 시간 간 동안 섬모의 구타의 수를 분할하여이 작업을 수행발은 (예 : 섬모는 = 1 초 5 밀리 초, 즉 5 밀리 X 200 프레임의 노출 시간 기록 (200) 프레임 비디오에서 50 회 박동, 지금은 1 초 = 50 Hz에서 50 비트를 분할). </li><li> 모두 전원 및 복구 스트로크하는 동안 뇌실막 섬모에 의해 촬영 경로를 평가하여 섬모 치는 각도를 계산합니다. 약간의 수정 (11)와, 이전에 기술 된 방법에 따라이 작업을 수행합니다. 각각의 섬모 운동의 정확한 완전한 비트주기 동안 관찰된다. </li><li> 모니터 위에 배치 아세테이트 시트에서 뇌실막 가장자리와 동력 행정의 개시시 섬모의 중심선 위치를 통해 수직 라인을 따라 수평 라인을 그린다. </li><li> 이 동력 행정 중에 전진으로 프레임에 의해 섬모 프레임의 정확한 위치를 플롯. 유사한 방식으로, 복구 행정 중에 섬모의 운동을 플롯. </li><li> T시의 중간 선에서 섬모의 최대 편차에서 섬모 치는 각도를 계산동력 행정뿐만 아니라 복구 스트로크 그가. </li></ol> 4. 칼슘 신호 기록 <ol><li> 뇌를 슬라이스 한 후, 간단히 1X PBS 또는 둘 베코의 PBS (PH 7.0)와 뇌 조각을 씻어. 형광 소광을 방지하고, 양호한 신호 대 잡음비를 구하는 신선한 FLUO-2를 준비한다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO-2 액 1 mM의 스톡 용액을 준비 혼합 FLUO-2를 균일 DMSO에 용해 될 수 있도록 적어도 5 분 동안 용액을 소용돌이. </li><li> 2 % B27로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 500ml에 FLUO-2 원액 희석하여 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 37 ° C로 미리 예열. 주 : B-27 비타민 A, 항산화 칵테일 및 해마 및 기타 CNS 신경 세포의 단기 또는 장기 생존 능력을 지원하기 위해 사용되는 인슐린을 포함하는 최적화 된 무 혈청 보충. </li><li> 즉시 유리 - 바닥 플레이트에 37 ° C에서 30 분 동안 20 ㎎ / ㎖ FLUO-2 뇌 슬라이스 배양한다. </li><li> 칼슘 형광체 FLUO-2의 최적 로딩 농도를 결정하고, ATP와 칼슘 염료 세포 독성 공격 세포를 방지하고, ATP에 응답하여 시간 경과와 칼슘 신호의 피크 진폭을 측정함으로써 세포 생존을 확인. </li><li> 488 nm의 515 nm의 각각 (영화 2)의 여기 및 방출 파장, 1 초 (초당 200 프레임)의 최소 5 밀리의 캡처 속도로 칼슘 진동에 대한 비디오를 기록합니다. </li><li> 자가 형광 또는 이동 유물에서 FLUO-2 칼슘 신호를 구별하기 위해, 515 nm에서 방출 강도가 개별적으로 모니터링되어 있는지 확인합니다. 참고 : FLUO-2는 세포 내 칼슘을 정량화하기에 적합한 칼슘 fluoremetric 없습니다. 그러나, 칼슘 진동 빨리 칼슘 변화를 감지하는 우수한 동적 칼슘 염료이다. 보다 정확한 칼슘 정량,의 Fura-2를 권장합니다. 그러나의 Fura-2의 동적 변경은 그 비율 적으로 한정염료의 특성. </li><li> 정확한 무료 세포 내 칼슘의 값을 계산하기 위해 제조업체에서 제공하는 공식을 따릅니다. 예 [칼슘 2 +] = K의 D × (R - R 분) / (R 최대 - R). K (D)가 해제 칼슘으로부터 염료의 해리 상수이고, R은 488에서 측정 된 형광이고, R과 R 분의 최대 최소 및 최대 이온 농도 12에서 형광 비율이다. </li></ol> 5. 면역 형광 현미경 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 10 분 동안 2 % 수 크로즈를 함유하는 인산염 완충 식염수와 뇌 부분을 수정. 또한, 저온 유지 장치를 사용하여 50mm의 섹션으로 4 % PFA 다음과 섹션 전체 뇌를 해결. </li><li> 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오. </li><li> soluti와 뇌 조각을 품어5 분 1X PBS에서 0.1 % 트리톤-X의에, 다음 5 분 때마다 1X PBS로 3 회 씻어. </li><li> 밤새 4 ℃에서, 실온 (RT) 또는에서 1 시간 동안 1X PBS에 10 % FBS에서 5000 : 마우스 일차 항체로 뇌 슬라이스 부화 1의 희석에 사용 - 튜 불린을 antiacetylated. </li><li> 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오. </li><li> 이차 항체의 뇌 슬라이스 부화 1의 희석 레세 항 - 마우스 IgG : RT에서 1 시간 동안 1X PBS 용액 500 10 %의 FBS. </li><li> 5 분 핵 (또는 DNA) 13 얼룩 4 &#39;, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)와 섹션 Counterstain과 형광 현미경으로 관찰하기 전에. 가능한 최소 노출 시간 구간 바로 광표백 화상을 최소화. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

실시간 이미징과 뇌 심실 내에 뇌실막 섬모의 신속하고 민감하게 관찰을 제공 형광 현미경 모두 마우스 뇌 조직의 준비를위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 이 기술은 뇌실에 한정되지 않는다; 그것은 다른 뇌 심실에서 섬모를 관찰하는 데에 이용 될 수있다. 이 영상 기술은 생체 외 환경에서 섬모의 박동에 의해 뇌척수액의 움직임과 유사한 라이브 스트림을 제공한다. 또한, 섬모의 운동 방향의 분석을 가능하게한다. 이것은 주로 고해상도 DIC와 형광 이미징 시스템의 사용에 의해 용이하게된다. 이 시스템의 장점은, 현미경이 온도, 습도 및 CO 2 수준의 미세 조절을 허용 환경 챔버로 묶여 있다는 점이다. 이것은 라이브 영상 EXPER을 수행 할 때 조직과 세포의 생존을 위해 고려되어야 매우 중요한 파라미터는iments. 시스템은 또한 섬모 운동 동적 세포 행동의 영상을 용이하게하는 중요한 특징이다 모두 자동 XY 및 Z 모듈뿐만 아니라, 디지털 카메라 및 파장 필터 스위처 장착된다. 현미경은 컴퓨터에 연...

섬모 세포 외 환경으로 세포 표면으로부터 연장 감각 미세 소관 기반 소기관이다. &quot;9 + 0&quot;또는 &quot;9 + 2&quot;- 미세 소관들은 조직에 따라 섬모는 두 가지 유형으로 분류 될 수있다. 기능적으로, 그들의 운동에 기초하여, 이러한 운동성 또는 비 - 운동성 섬모 1로 분류 될 수있다. 차 섬모는 일반적으로 &quot;9 + 0&quot;비 운동성 섬모를 나타 내기 위해 사용되는 용어입니다. 이들은 ( &#39;9&#39;로 표시) 아홉 평행 겹 미세 소관 있고 미세 소관의 중앙 쌍 ( &#39;0&#39;로 표시) 내에서 중앙 피복 부재. 그러나, 배아 편측성 규제 등 절점 섬모 일부 &quot;9 + 0&quot;섬모는 2 운동성이다. 한편, 운동성 섬모는 미세 소관 이중선의 추가적인 중앙 쌍, 아홉 병렬 미세 소관 이중선에 더하여, 특징 및 운동성을 촉진하기 네인 모터 단백질과 연관된. 또한, 일부 &quot;9이러한 후각 섬모 등이 &quot;섬모 3 비 운동성이 있습니다. 뇌 심실 및 척수의 중심 관을 긋고 뇌실막 세포는 뇌 심실 4 따라 뇌척수액 (CSF)를 추진 운동성 섬모 특징으로한다. 이 방법의 전반적인 목표는 섬모 역학과 구조적 이상 운동성 연구를 촉진하는 것입니다. 뇌의 건강과 발전은 크게 뇌의 뇌실 내 뇌척수액의 효율적인 순환에 따라 달라집니다. 예를 들어, 정상 뇌척수액의 흐름과 유체 균형은 정상 박동 차례로 신경 세포의 방향 움직임을 조절하는 중요한 역할을하고 세포 이동 (7) 줄기 기능 뇌실막 섬모 5,6 필요합니다. 이러한 비정상적인 뇌실막 섬모 기능 또는 뇌수종과 연관된 비정상적인 CSF 흐름을 초래할 수 구조체로서, 용태가있는 (B)의 심실에서 CSF의 비정상 축적이 존재비. 이것은 결과적으로 두개 내 압력과 머리, 경련, 터널 비전의 점진적 확대, 정신 장애 (8) 증가의 원인이 될 수 있습니다. 기존의 방법에 비해이 기술의 장점은 세 가지 뇌실막 세포 유형을보고 처음 허용한다는 것이다 : I, 고유 모양체 비팅 주파수 및 각도 박동에 근거 II 및 III. 이 뇌실막 세포는 뇌의 뇌실에 특정 지역 내에서 지역화됩니다. 또한, 나이 등과 같은 알코올 및 뇌실막 세포 유형 또는 지역화 변경에 실로 스타 졸과 같은 약리학 적 제제의 효과는 뇌실막 세포의 분류 이전에는 불가능이었다 증명 될 수있다. 실로 스타 졸은 포스-3 저해제, AMP에 캠프 대사 효소이며 세포 내 칼슘도 9를 조절한다. 고속 형광 영상 분석을 이용하여 세포 내 고유의 이미징 및 정량을 허용뇌실막 세포의 칼슘 진동 특성. 예를 들면, 실로 스타 졸 및 알콜 모두 크게 차례로, 뇌실막 섬모 10 의해 뇌척수액 볼륨 여분의 변화로 이어질 수 뇌실막 모양체 비팅 주파수뿐만 아니라, 세포 내 칼슘의 진동 특성을 변경. 요약하면,이 기술은 다른 칼슘 발진 특성 뇌실막 세포의 세 가지 유형 중 첫번째 증거를 제공하는 핵심이다. 다음 섹션에서, 절차의 상세한 단계별 개요는 티슈 제조 및 취급에 세심한주의를 기울이고, 제공된다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/고혈당</td><td>Cellgro Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710-SP</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-2395</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>플루오-2&nbsp;</td><td>TEF Labs</td><td>#0200</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 하드셋 마운팅 매체 with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451&nbsp;</td><td>클론 6-11B1</td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 항체</td><td>Vector Labs</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트</td><td>VWR Vista Vision</td><td>30-2041</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip (18 x 18)</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004.326</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>니콘&nbsp;</td><td>니콘 TE2000</td><td>60X 오일&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 24 x 60 mm2</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 필터 큐브</td><td>크로마 기술이</td><td></td><td></td></tr> 있는 마운팅 매체</tbody></table>

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated 뇌실막 세포는 성인의 뇌에 심실 라인. 이상 기능이나 뇌실막 섬모의 구조는 다양한 신경 학적 결손과 관련이있다. 운동성 섬모 뇌실막 기술의 생체 라이브 영상 전류는 여러 단계를 다음과 섬모의 역학에 대한 자세한 연구를 위해 수 있습니다. 이 단계는 다음과 같습니다 마우스 이산화탄소와 안락사를 톨레도의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 프로토콜에 따라; vibratome 또는 날카로운 블레이드와 뇌 제거 및 시상 뇌 해부 다음에 두개 절제술은 뇌실막 섬모가 가시화 될 수있는 뇌 측면 심실을 통해 매우 얇은 섹션을 얻었다. 95 % / 5 % O의 존재하에 2 / CO 2 혼합물을 37 ℃에서 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) / 하이 글루코스를 함유하는 맞춤형 유리 - 바닥 접시 뇌 슬라이스 포란 살아있는 조직을 유지하는 것이 필수적이다 시실험. 섬모 고해 비디오이어서 고해상도 미분 간섭 현미경을 이용하여 기록된다. 비디오는 섬모 비팅 주파수를 계산하는 프레임 단위로 분석한다. 이것은 그들의 섬모 박동 주파수와 각도에 따라 세 종류 또는 유형에 뇌실막 세포의 뚜​​렷한 구분을 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 뇌실막 세포 특유의 세포 내 칼슘 발진 특성뿐만 아니라, 칼슘 진동에 약리학 적 제제의 효과 및 모양체 비팅 주파수의 특성을 고속 형광 영상 분석의 사용을 허용한다. 또한,이 기술은 섬모 구조 및 섬모 단백질 지역화 연구 면역 촬상에 적합하다. 이는 질병 진단 및 표현형 연구에서 특히 중요하다. 뇌 조직이 죽는 시작으로 기술의 주요 제한은 라이브 운동성 섬모 운동의 감소에 기인한다.

라이브 마우스의 뇌에 뇌실막 섬모 기능을 측정 이 프로토콜에 기재된 방법은 마우스 뇌뿐만 아니라 모니터링 섬모 비팅 주파수 공부 해부 신선한 조직 뇌실막 섬모 기능과 구조를 모니터링하는 데 사용된다. 전체 실험을 수행하기 위해 그 다음 단계는 개략 플로우 차트 (도 1)에 도시된다. 이것은 고도로 실험 가능한 활성 운동성 섬모를 유지하기 위해 짧은 시간 내에 수행하는 것이 좋다. 대표 시간 경과 영화와 뇌실막 세포와 그들의 운동성 섬모의 이미지도 표시됩니다 (동영상 1 와 그림 2a). 얻어진 스트림 데이터 분석 이동 섬모의 박동 패턴과 각도를 계산함으로써 달성된다. 세 가지 유형으로 섬모를 나누는 기준은 뇌실막 섬모의 존재는 눌러 확인은 표 1에 나타내었다핵 보여 섬모 마커, 아세틸 - - 튜 불린과 rmed하고, 뇌실막 세포 DAPI...

고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 마우스 뇌실 내에 위치한 Motr append CLIA의 박동을 ex vivo로 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌 전체를 적출한 후, 외측 뇌실을 포함하는 얇은 절편을 제작합니다. 다음으로, 실험 도중 조직의 생존력을 유지하기 위해 고농도 포도당 배지가 담긴 맞춤형 글라스 바텀 플레이트에서 체온으로 절편을 배양합니다.마지막으로, 고해상도 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 섬모의 박동을 기록합니다. 최종적으로, 면역형광 이미징을 통해 섬모의 구조와 단백질 국소화를 시각화할 수 있습니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 독특한 섬모 반복 빈도와 각도를 기반으로 표피 세포를 분류하고 세 가지 뚜렷한 그룹으로 나눌 수 있게 하는 최초의 기술이라는 점입니다.좋습니다. 이 기술의 시사점은 뇌수종 치료로 확장됩니다. 비정상적인 표피 CLIA 기능은 뇌 내 뇌척수액의 축적으로 이어지기 때문입니다.실험 절차를 시연할 학생은 저희 실험실의 매우 재능 있는 학생인 Zaha Alam 씨와 Hannah sat 씨입니다. 성체 마우스의 머리를 70% ethanol로 닦아내는 것으로 시작하십시오. 그다음 머리 윗부분부터 시작하여, 멸균 가위와 포셉을 사용하여 피부를 벗겨내고 두개골을 노출시킵니다.다음으로, 후측에서 시작하여 전측 방향으로 뼈를 부분적으로 치유합니다. 두개골을 제거하려면 뇌 전체를 선택하여 37 °C의 고농도 포도당 배지가 담긴 100 millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 날카로운 칼날을 사용하여 뇌를 정중 시상면으로 절개함으로써 각 반구에서 첫 번째 100 to 200 micron 섹션을 얻습니다.그런 다음 절편을 37 °C PBS로 헹구고, 즉시 조직을 37 °C의 고당분 배지에 넣습니다. 절편을 이미지화하기 위해 뇌 슬라이스를 1 mL의 고당분 배지가 들어 있는 30 mm 유리 바닥 배양 접시에 넣고, 60x 오일 침수 대물렌즈를 사용하여 밀폐된 현미경 챔버 환경을 37 °C 및 5% CO₂로 조정합니다. 다음으로, 일반적인 DIC 투과광을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.그런 다음 DMEM 기포의 이동 방향을 따라 운동성 append clia의 위치를 찾습니다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 외측 뇌실에서 운동성 CLIA를 가진 건강한 세포가 포함된 영역을 선택하십시오. append clia를 확인하면, 빛과 초점을 조절하여 만족스러운 이미지를 얻습니다.다음으로, 이미징 소프트웨어에서 라이브 이미징 파라미터를 설정합니다. 예를 들어 여기서는 60 x 대물렌즈와 1 × 1의 카메라 빈닝(binning) 설정을 결합하여 24 bit 이미지를 획득하고 있으며, 노출 시간은 5~10 ms로 설정되었습니다. 노출 시간을 최소화할 수 있도록 현미경 조리개를 최적 수준으로 개방하고 DIC 이미지를 수집하십시오.지연 없이 빠르고 즉각적인 이미지 획득을 위해 카메라로 스트리밍되는 실시간 영상을 관찰하십시오. 이후 칼슘 신호를 기록하기 위해 충분한 이미지 대비를 얻는 데 필요한 최소 노출 시간을 기준으로 cilia의 박동 속도를 계산할 수 있습니다. 뇌를 절편화한 후, 조직을 PBS로 짧게 헹구고 즉시 유리 바닥 플레이트에 담아 갓 조제한 20 µg/mL의 lu O2에서 절편들을 배양하십시오.37 °C에서 30분 후에, 5 ms의 캡처 속도로 최소 1초 동안 칼슘 진동을 기록합니다. 먼저 488 nm의 여기 파장에서, 그다음 515 nm의 방출 파장에서 측정합니다. 면역형광 현미경으로 관심 세포 마커를 시각화하려면, PBS 내 4% 파라포름알데히드와 2% 수크로스 용액으로 샘플을 10분 동안 고정합니다.조직을 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 그다음 뇌 절편을 0.1% Triton X에서 5분 동안 배양합니다. 방금 시연한 것과 같이 샘플을 헹군 후, mouse anti acetylated alpha tubulin과 함께 배양합니다.PBS로 다시 한번 세척한 후, 샘플을 실온에서 fluorescein anti-US IgG와 함께 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로 절편을 DPI로 5분 동안 대조 염색하고, 가능한 최소 노출 시간으로 즉시 세포 이미지를 캡처합니다. penal CLIA의 존재는 DPI 대조 염색과 섬모 마커인 acetylated alpha tubulin을 통해 확인합니다. 핵을 식별하고 penal CLIA 운동성의 흐름을 분석하기 위해, 이동하는 세포의 박동 빈도와 각도 패턴을 측정합니다.그 후 이러한 데이터를 바탕으로 CLIA를 세 그룹 중 하나로 나눌 수 있습니다. 중요한 점은, CLIA를 0.25% Ethanol에 노출시키면 유형에 관계없이 CLIA의 박동 빈도가 유의하게 억제된다는 것입니다. CLIA를 더 굴곡시키면 섬모 의존적 세포 내 칼슘 신호 전달이 유발되며, 이를 통해 뇌실 내의 세포 내 칼슘 신호를 측정할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 뇌실이 형성된 후 이를 파괴하지 않도록 뇌 조직을 부드럽고 효율적으로 다루는 것이 중요합니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 append CLIA와 살아있는 생쥐 뇌 조직의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기에서 우리는 필요한 도구를...

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

출처: Al Omran, A. J., et al. 마우스 뇌의 외측 심실에 있는 뇌실막의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015).  이 비디오는 미분 간섭 대비(DIC) 현미경을 사용하여 시상 쥐 뇌 절편에서 뇌실막의 박동을 관찰하는 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 뇌실막(epiendymal cilia)은 뇌척수액(CSF)을 추진하며, 이들의 활동은 영양이 풍부한 배지로 유지되고 기후 조절실에서 영상화되는 뇌 절편에 기록됩니다. 고대비 비디오를 통해 기능적 섬모를 식별하고 박동 빈도를 정량화할 수 있습니다.

Mouse Brain Section에서 Ependymal cell ciliary activity의 라이브 이미징

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.

평면 바닥의 공기 해제 플랫폼 : 새로운 방법이 깨어에 현미경 또는 전기 생리학과 행동을 결합하여 자유롭게 설치류 이동

다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 마우스 뇌실 뇌실막 섬모의 생체 외 라이브 영상 기법을 통해 섬모 운동 주파수와 각도를 분석하는 방법을. 이 기술은 뇌척수액 순환과 신경과학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

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