마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

본 실험 절차의 전반적인 목적은 마우스 뇌실 내에 위치한 Motr append CLIA의 박동을 ex vivo로 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌 전체를 적출한 후, 외측 뇌실을 포함하는 얇은 절편을 제작합니다. 다음으로, 실험 도중 조직의 생존력을 유지하기 위해 고농도 포도당 배지가 담긴 맞춤형 글라스 바텀 플레이트에서 체온으로 절편을 배양합니다.

마지막으로, 고해상도 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 섬모의 박동을 기록합니다. 최종적으로, 면역형광 이미징을 통해 섬모의 구조와 단백질 국소화를 시각화할 수 있습니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 독특한 섬모 반복 빈도와 각도를 기반으로 표피 세포를 분류하고 세 가지 뚜렷한 그룹으로 나눌 수 있게 하는 최초의 기술이라는 점입니다.

좋습니다. 이 기술의 시사점은 뇌수종 치료로 확장됩니다. 비정상적인 표피 CLIA 기능은 뇌 내 뇌척수액의 축적으로 이어지기 때문입니다.

실험 절차를 시연할 학생은 저희 실험실의 매우 재능 있는 학생인 Zaha Alam 씨와 Hannah sat 씨입니다. 성체 마우스의 머리를 70% ethanol로 닦아내는 것으로 시작하십시오. 그다음 머리 윗부분부터 시작하여, 멸균 가위와 포셉을 사용하여 피부를 벗겨내고 두개골을 노출시킵니다.

다음으로, 후측에서 시작하여 전측 방향으로 뼈를 부분적으로 치유합니다. 두개골을 제거하려면 뇌 전체를 선택하여 37 °C의 고농도 포도당 배지가 담긴 100 millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 날카로운 칼날을 사용하여 뇌를 정중 시상면으로 절개함으로써 각 반구에서 첫 번째 100 to 200 micron 섹션을 얻습니다.

그런 다음 절편을 37 °C PBS로 헹구고, 즉시 조직을 37 °C의 고당분 배지에 넣습니다. 절편을 이미지화하기 위해 뇌 슬라이스를 1 mL의 고당분 배지가 들어 있는 30 mm 유리 바닥 배양 접시에 넣고, 60x 오일 침수 대물렌즈를 사용하여 밀폐된 현미경 챔버 환경을 37 °C 및 5% CO₂로 조정합니다. 다음으로, 일반적인 DIC 투과광을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 DMEM 기포의 이동 방향을 따라 운동성 append clia의 위치를 찾습니다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 외측 뇌실에서 운동성 CLIA를 가진 건강한 세포가 포함된 영역을 선택하십시오. append clia를 확인하면, 빛과 초점을 조절하여 만족스러운 이미지를 얻습니다.

다음으로, 이미징 소프트웨어에서 라이브 이미징 파라미터를 설정합니다. 예를 들어 여기서는 60 x 대물렌즈와 1 × 1의 카메라 빈닝(binning) 설정을 결합하여 24 bit 이미지를 획득하고 있으며, 노출 시간은 5~10 ms로 설정되었습니다. 노출 시간을 최소화할 수 있도록 현미경 조리개를 최적 수준으로 개방하고 DIC 이미지를 수집하십시오.

지연 없이 빠르고 즉각적인 이미지 획득을 위해 카메라로 스트리밍되는 실시간 영상을 관찰하십시오. 이후 칼슘 신호를 기록하기 위해 충분한 이미지 대비를 얻는 데 필요한 최소 노출 시간을 기준으로 cilia의 박동 속도를 계산할 수 있습니다. 뇌를 절편화한 후, 조직을 PBS로 짧게 헹구고 즉시 유리 바닥 플레이트에 담아 갓 조제한 20 µg/mL의 lu O2에서 절편들을 배양하십시오.

37 °C에서 30분 후에, 5 ms의 캡처 속도로 최소 1초 동안 칼슘 진동을 기록합니다. 먼저 488 nm의 여기 파장에서, 그다음 515 nm의 방출 파장에서 측정합니다. 면역형광 현미경으로 관심 세포 마커를 시각화하려면, PBS 내 4% 파라포름알데히드와 2% 수크로스 용액으로 샘플을 10분 동안 고정합니다.

조직을 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 그다음 뇌 절편을 0.1% Triton X에서 5분 동안 배양합니다. 방금 시연한 것과 같이 샘플을 헹군 후, mouse anti acetylated alpha tubulin과 함께 배양합니다.

PBS로 다시 한번 세척한 후, 샘플을 실온에서 fluorescein anti-US IgG와 함께 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로 절편을 DPI로 5분 동안 대조 염색하고, 가능한 최소 노출 시간으로 즉시 세포 이미지를 캡처합니다. penal CLIA의 존재는 DPI 대조 염색과 섬모 마커인 acetylated alpha tubulin을 통해 확인합니다. 핵을 식별하고 penal CLIA 운동성의 흐름을 분석하기 위해, 이동하는 세포의 박동 빈도와 각도 패턴을 측정합니다.

그 후 이러한 데이터를 바탕으로 CLIA를 세 그룹 중 하나로 나눌 수 있습니다. 중요한 점은, CLIA를 0.25% Ethanol에 노출시키면 유형에 관계없이 CLIA의 박동 빈도가 유의하게 억제된다는 것입니다. CLIA를 더 굴곡시키면 섬모 의존적 세포 내 칼슘 신호 전달이 유발되며, 이를 통해 뇌실 내의 세포 내 칼슘 신호를 측정할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 뇌실이 형성된 후 이를 파괴하지 않도록 뇌 조직을 부드럽고 효율적으로 다루는 것이 중요합니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 append CLIA와 살아있는 생쥐 뇌 조직의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.