Name: 파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 파지 유전자 기능 분석을 위한 MAPs 및 대사체학 방법을 E. coli에서 활용하는 기술입니다. 이 방법은 미생물학 연구에서 바이러스 단백질 특성화에 효과적입니다.

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이 원고에 대한 도움과 건설적인 의견을 제시해 주신 Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas 및 Viral Dark Matter 컨소시엄 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 자금 지원을 받았으며(DEB-1046413)의 지원을 받았으며 Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter 프로젝트의 일부입니다.

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여기서는 추정 파아지 유전자의 기능적 특성화 노믹 방법을 제시한다. 기술 모니터링 호스트 동화 대사 능력 개발 분석을 포함 멀티 표현형 분석 플레이트 (매핑)하여, 이화 대사에 대한 효과를 측정 할 수있는 대사 체학의 확립 된 방법에 추가하여. 우리는 높은 처리량 처리 및 분석 24 있도록 이러한 기술에 의한 대용량 데이터 세트를 관리하기위한 추가 툴을 제공 하였다. 마지막으로, 주석 파지 캡시드 단백질, 파지 티 오레 독신,이 추정 대사 파지 유전자, 평균 실험 응답의 비교를 통해 우리는 표현형 동향 및 아웃 라이어의 식별의 확인에 중점을두고, 데이터 세트 및 유전자 클래스 모두를 해석하는 다양한 전략을 제안한다. 언급 한 바와 같이, 두 접근 정량적 호스트 대사의 절반만을 측정한다. 임의의 상대 기능을 해석 할조사에서 새로운 단백질, 두 방법 모두에서 데이터 기능의 증거를 제공해야합니다. 이것이 우리의 현재 원고의 초점은 아니지만, 각 노믹 방법의 데이터 출력은 랜덤 숲과 주성분 분석과 같은 클러스터링 기술에 초점을 조합 적 분석을 통해 배치됩니다. 또한, 결합 분석에 의한 가설은 이후 기존의 유전 적 방법에 의해 검증되어야합니다. 마지막으로, 방법은 주로 박테리아의 생리학에 영향을 따라서 동일한 표준을 따르고 제시된다. 어느 방법을 착수 할 때, 고려되는 실험 독립 클론 집단을 보장하기 위해 필요; 오염이 방지된다; 하나의 변수는 테스트되고; 적절한 컨트롤을 동시에 실행되고있다. 이러한 점을 고려하지 않으면 어떤 생리 학적 분석과 유사 불분명 결과가 발생합니다. 멀티 표현형 분석 플레이트(MAP에) 맵의 개발은 높은 처리량과 현재 이용 가능한 기술 (도 5a 및 표 1,2)와 비교 분석 적응을 제공한다. 분석은 모든 미생물 실험실에서 사용할 수 공급, 장비, 기본 기술을 사용합니다. 이후의 데이터 처리 및 분석을위한 연산 파이프 라인의 혼입, PMAnalyzer 24 빠른 데이터 해석을 보장한다. 또한, 접근법 모두 실험 및 분석 양태 용이 조정될 수 또는 사용자 정의 목적 동조. 데이터의 많은 부분은 제 4 절에서 설명 된 필터를 통과하지 못하는 경우, 예를 들어, 하나의 수동으로 문제를 식별하기 위해 성장 곡선을 통해 가려 낼 수있다. 문제가 엄격한 필터 파라미터들로 인해 발생하는 경우, 스크립트에 대한 조정이 이루어질 수있다. 또한, 문제가 실험 과정과 관련된 경우 (즉, 연장 응축, 부적절한 세균 CEL의 전송LS는 등) 추가적인 복제 쉽게 반복 될 수있다. 쿠에바스 등. 24에서 설명한 바와 같이, PMAnalyzer 응집력, 자동화 된 파이프 라인과 구문 분석 및 분석 스크립트를 실행하는 래퍼 스크립트로 작성된 하나의 bash는 프로그램입니다. 모든 스크립트 중으로 데이터 사이를 각 시점에 대해 중간 값을 취함으로써 25 자식 저장소로부터 자유롭게 액세스 할 수 있으며 계속해서 지연 시간을 획득하기 위해 로지스틱 곡선, 최대 성장 속도, 점근선과 신규 용어 성장 수준을 매개 변수화. 중앙값은 큰 이상치의 효과를 감소시키는 연구에서는 평균 걸쳐 선택되었다 그러나, 스크립트는 용이하게 복제 된 데이터의 평균을 계산하도록 구성 될 수있다. 감소 변화 복제 데이터 (그림 2A)에 걸쳐 본 (SE)으로 인해 우리는 물류 곡선 피팅에 대한 PMAnalyzer의 중간의 사용을 유지했다. 또한, 본 연구에서 성장을 차단 (GL ≥ 0.4) DETE했다데이터 성장 레벨과 최대 증가율에 걸쳐 분리 방법과 비교하여 rmined (도 1A, B). 이의 재정을 필요로하는이 용어가 다를 수 있습니다 사용되는 장비 및 모델 시스템에 따라 값을 잘라. 우리의 분석의 가장 큰 장점은 우리가 성장 레벨 (GL)로 정의하는 전체 미생물의 성장을 특징 짓는 하나의 매개 변수를 사용하여 표현형을 비교하는 기능입니다. GL은 조화 평균, 따라서 데이터에 큰 이상 값의 영향을 완화시킨다. 이동 물류-장착 값을 조화 평균의 사용은 성장의 요약은 시행 착오를 통해에 도착했다 제공합니다. 다른 방법은 성장이 포함 차별화를 시도 : 그것은 걸린 시간은 특정 곡선 파라미터 (반 μ 최대, μ 최대 및 운반 능력), 결정 (R 2)의 계수, 특정 곡선의 매개 변수를 곱한 R 2의 조합에 도달 할 수 있습니다. 시프트와 조화 평균을 이용하여GL에 대한 물류 맞는 값은 따라서 선택의 방법이되었다, 성장을 평가하는 가장 큰 범위를 제공했다. 주목해야 할 한가지 고려 사항은 동적 성장 곡선 패턴이 단일 파라미터 또는 피팅 모델을 사용할 때 손실 될 가능성이 있다는 것이다. 예를 들어, 로지스틱 곡선 GL의 개별 곡선 파라미터 이상성 성장을 나타내는 능력이있다. 하나의 탄소 환경에서 성장이 효과는 기판 사용으로 기판 또는 변화 중 하나 변환에 바이러스 성 단백질의 중재를 의미한다. 여러 성장 매개 변수를 고려하지 않을 경우 잠재적 손실 추가 효과는 다음과 같습니다 연장 지연 시간, 바이러스 성 기계 또는 제품의 증가 부담을 제안을; 빠르게 에너지 생산 경로를 호스트하기 위해 결합 된 바이러스 성 단백질을 제안, 지수 상을 가속; 호스트 영양소 흡수 및 동화에 바이러스 지원 암시 매스 형성하거나 더 높은 수준 (데이터는 미도시). 따라서, (초기 성장 곡선을 그리는 <stGL은 클론의 전반적인 성공을 표현하는 하나의 양적 번호를 제공, 계정에 물류 모델의 주요 변수를 취 반면 룽&gt; 그림 2A, B)는 시간이 지남에 동향에 관한 정보를 제공합니다. 지도의 구조적 및 대사 유전자 기부 상이한 반응을 고려할 때, 해당 다른 기판 클래스 단백질 기능에 대한 증거를 제공 큰 것으로 관찰된다. 예를 들어, 대사 단백질은 종종 중앙 대사 16, 32를 호스팅하는 불특정 있습니다 제한 영양소의 획득과 연결되어 있습니다. 예비 실험은 MAP 중앙 대사 탄소원 (도 2a) 상에 성장 될 때, 추정 대사 파아지 유전자 형질 클론 증가 유도기이 있는지 알 수있다. 반대로, 호스트 에너지와의 dNTP 풀의 큰 비율을 필요로 추정 구조 유전자를 운반하는 클론, %의 성장에 거짓 긍정적 인 반응을 초래할RAL 아미노산 대사 탄소 기질. (미도도 2A 및 데이터) 현미경을 통해 관찰이 때문에 호스트 filamentation 및 / 또는 봉입체 결과 불용성 단백질의 축적 가능성이 높다. 추가 분석은 이러한 예비 결과를 검증 할 필요가 있지만, 맵은 특정 파아지 유전자 클래스의 함수를 가정하는 상관 표현형 반응을 입수 할 수있다. 미지의 바이러스 단백질의 해명 외에지도 개별 세균의 대사 작용과 다양성 또는 박테리아의 커뮤니티를 조사하는 신규 한 자원이다. MAP 성분은 세균의 범위의 성장을 지원하기 위해 설계 쉽게 변경되며 해양, 영양 요, 혐기성 미생물을 포함. 다른 속 세균은 맵에서 지원 될 수 있기 전에 사전 정의 된 기저 성장 매체가 추가 또는 조정 된 화학 종을 필요 이러한 노력을 용이.MAP에 이러한 사용 중 하나는 주 트립 톤, 효모 추출물 및 펩톤 등 성분의 사용을 금지하고, 정의 된 미디어를 유지하는 것이다. 대사 체학 대사 체학 분야는 질량 분석에 의해 확인 된 고립 된 대사 산물을 포함 대사 데이터베이스에 따라 달라집니다. 여기에 선택 핵심 시설은 가장 큰 대사 체학 데이터베이스 중 하나가 있습니다. 다른 사람이 전에 우리의 호스트에 기록 된 적이 없었다 동안 흥미롭게도, 우리의 실험과에서 발생하는 대사의 절반 이상이 (~ 65 %)을 식별 할 수없는했다, 대장균은 (예는 다음과 같습니다 인돌 3 아세트산 (33), 살리실산 (34), 및 디 히드로 산 35). 이 사실은 식물 대사 산물, 또는 조사 대상인 특정 단백질 데이터베이스를 향해 강한 바이어스 중 하나에 기인 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 그 결과 데이터 표시 및 분석을 위해 사용 가능한 공지 대사 산물의 한정된 수이다. 푸에진짜야는 다양한 데이터베이스를 사용하여 여러 대사 체학 방법은 더 큰 대사 범위를 허용한다. 현재, 모두 알려진 비교하고 우리의 새로운 바이러스 성 단백질을 대조 할 때 알 수없는 대사가 사용된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 기능적으로 유사한 단백질을 형질 클론들이 완전한 대사 체 프로파일 증가 유사성을 공유한다는 가설. 예비 대사 체학 분석은 구조 및 신진 대사에 영향을 미치는 유전자를 명확하게 서로 분리되지 않는 동안 (그림 6)의 상관 관계 않는 과발현 때, 그 유전자가 호스트에 비슷한 효과를 보이는 것으로 나타났다. 예를 들어, 밀접하게 추정 대사 유전자 주석 캡시드 유전자 클러스터는이 연구, EDT2440 및 EDT2441 강조. 공개 트랜스 토폴로지 및 신호 펩티드 예측 프로그램을 이용하여 조사 모두 추정 대사 유전자가 단일 막 횡단 도메인 항구 증거를 보였다. 흥미롭게도 5 일 중(대부분 Dendrogram이 부분을 좌) 첫 번째 클러스터 그룹 E 9 클론 같은 토폴로지 프로그램을 사용하여 경막 도메인을 예측 하였다. 또한, 조사가 필요하다, 그러나, 이들 클론의 과발현시 본 대사 물질 또는 막 구조의 부담으로 인한 세포 스트레스 반응과 관련된 것으로 보인다. 이러한 증거는 대사 체학 데이터 잡음 증가량을 보유하면서,이 방법은 유전자 내 및 클래스 걸쳐 두 유전자의 일반적인 효과를 구별 신호를 강조 할 수있는 것을 지원한다. 이 방법은 유전자 기능의 특정 정보를 추출 할 수 있는지 여부를 확인하려면, 대사 산물 특정 대사 경로로 분류되었다. 클론은 단일 통로 특정 대사에 영향을 미치는 경우 가설 존재는, 그 후에 과잉 발현 유전자는 그 경로에서 활성화된다. 우리 대사 체학 품질 보증 파이프 라인의 설립 이전에, 예비 데이터는 위에 밝혀소수 D 대사 산물들은와 연관된 경로에 적은 정보를 제공하는, 일반적으로 &quot;알&quot;이었다 (데이터는 보이지 않음). 대사 체학 전처리 된 데이터는, 그러나, 대사 산물 프로파일의 대부분이 유사하고 단지 알려지지 공지 대사 존재비의 선택 수가 인스턴스 퓨 트레 및 우라실 (도 6)의 경우, 클론 걸쳐 달라질 것으로 나타났다. 단백질 기능 노력의 높은 해상도를 제공하기 위해 실험적으로 기능적 특성을 기초 대사의 &quot;구멍&quot;을 작성하는 데 사용될 수 공지 파지 유전자에 대해 신규 파아지 유전자를 비교하도록 이루어지고있다. 이 기술을 사용하여, 공지의 바이러스 유전자의 할당 기능 미지 유전자의 기능에 대한 기준을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 대사 체의 분석 제한 요인은 데이터베이스의 크기와 관련이있다. 이 연구에 논리적 인 사람이어야 메타 볼로 데이터베이스가 개발 될 필요가 이러한 제한, 수정하기 위해; 이러한E.의 아스카의 컬렉션에 특정 대사 산물의 데이터베이스와 자신의 존재비 등 콜라이 클론 된 단일 ORF 36 과발현된다. Lawerence 버클리 국립 연구소의 연구원이 모델 박테리아 (37)의 전체 돌연변이 라이브러리에 특정 대사 산물의 최초의 종합 데이터베이스를 컴파일 할 때 이러한 데이터베이스의 필요성에 대한 증거는 2013 년에 제공되었다. 이 연구는 표현형과 유전자형 사이의 명확한 연결을 공개, 특정 대사 산물의 이용에 필요한 유전자에 새로운 통찰력을 제공했다. 공구로 대사 체학을 고려하면, 처리 정권 코어 시설에서 뒤에 정의하는 것이 중요하다. 대부분의 실험 절차의 유물은 사용의 악기와 관련된 일상의 변화이다. 지금까지 모든 GC-MS 분석은 각각의 실행을 분석에 포함되는 내부 표준을 사용하는 구현; 그러나, 프로젝트 별 내부 샘플 또한 &lt;/ EM은&gt; 실험 매일 추가 분산을 제거 달렸다. 이러한 고려 사항은 정상화 문제와 편견을 피하기 위해 조기 해결해야합니다. 또 다른 해결책은 동일한 시스템의 핵심 시설에서 단일 배치, 어떤 핵심 시설에서 사용할 수있는 옵션으로 모든 샘플을 처리하는 것입니다. 다양한 도구를 모두 도입 소설은 화면과 기능적으로 미지의 파지 유전자의 특성을 의미한다 제공이 원고에 다시는-탐구. 연산 파이프 라인의 유선형 사용하여 실험 기술의 단순성과 적응성이 방법은 연구 노력과 필드의 넓은 범위에 적용 할 수있는 보장합니다. 우리의 목표는 여기에 제시된 노믹 방법이 동일하게 기능적으로 정의하는 시스템뿐만 아니라 새로운 파지 단백질의 추가 조사를 도울 것입니다.

(박테리오파지 또는 파지 일명) 박테리아를 감염시키는 바이러스는 환경 1,2 세계적 입자와 같은 10 개 이상의 31 바이러스 (VLP를)에 존재하는 다른 모든 생물을 능가 할 것으로 추정된다. 해양 환경과 관련된 바이러스 성 지역 사회를 조사하는 첫 번째 metagenomic 연구는 바이러스 성 분수 3에서 볼 수있는 다양성을 정량화에 초점을 맞추었다. 또한, Breitbart 연구진은 바이러스 성 사회 서열의 65 % 이상이 공공 데이터베이스에서 사용할 수있는 시퀀스에 더 동성을 공유 없다는 것을 발견했다. 이후 metagenomic 연구는 유사한 증거를 발견 : 샌디에고 해양 퇴적물에서 metagenomes, 캘리포니아 75 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 (4)를 포함; Salton의 바다의 hypersaline 호수에서 metagenomes 98 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 (5)를 포함; 98 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 6 - 산호 관련 metagenomes 95이 포함되어 있습니다. 주석이 달려 있지 않은 정보의이 축적 가져왔다7 &quot;생물학적 우주의 암흑 물질&quot;인 파지의 유전 물질. 파지의 게놈 특성은 기존의 핵산 및 단백질 데이터베이스에 대해 비교를 통해 서열의 유사성을 식별에 의존하고있다. 파지 인코딩 된 유전 정보는 주로 알 수 없기 때문에, 상 동성 기반의 방법은 효과가 있습니다. 전사 및 복제 유전자, 대사 유전자 및 구조 유전자 그들의 게놈 내에서, 일반적으로는 파지를 세 가지 종류의 유전자를 인코딩한다. 전사 및 복제 유전자 (클래스 I / II 유전자 8) 중합 효소, primases, 엔도 / 엑소 뉴 클레아 제, 및 키나아제를 포함한다. 이 유전자는 매우 전사와 파지의 유전 물질을 복제, 파지 감염의 중요성으로 인해 보존된다. 파아지 중합 효소 용이 인해 전역 보존 9에 서열 상 동성 전통적인 방법을 이용하여 식별되고 효과적인 계통 마커 (10)를 제공하는 것으로 나타났다.반면, 파지 대사 및 구조 유전자 (클래스 II / III 유전자를 8) 점점 발산 종종 가상의 유전자로 주석이 있습니다. 파지 대사 유전자는 숙주의 대사 능력에 영향을 미칠 필요는 바이러스 복제를 위해 요구되지 않는다. 종종 보조 대사 유전자 11 (AMGs) 함이 유전자는, 호스트 신진 대사를 조절하고 감염과 비리 성숙의 성공의 최적의 진행을 할 수 있도록 나타납니다. AMGs은 제한 영양소 나 에너지 생산 경로의 활용 및 흡수와 관련이있다. 몇 가지 예는 광계의 다양한 cyanophage 12-16의 게놈에있는 유전자, 유전자에 연결 인산 대사 17, 18, ​​및 파지의 dNTP 생합성 (18, 19)에 대한 탄당 인산 경로의 활용에 의해 규제를 포함한다. 비교, 구조 유전자는 감염 동안 생산 늦게 유전자 중반 사이에있는 다른 파지 호에 걸쳐 다양세인트 시스템. 구조 단백질의 생산은 전사, 번역, 조립 8 바이러스의 dNTP의 가용성 및 에너지 저장고에 의존한다. 캡시드 테일 섬유 구조 단백질은 모든 바이러스 성 단백질을 코딩하는 유전자의 대부분의 발산으로 간주되며 성공적인 비리 온 생산을 위해 필요하다. 이들의 차이는 일반적으로 그들은 바이러스 호스트 공진화 (20)을 형성에서 재생 적극적인 역할에 기인한다. 전통적인 상동 서열 정렬 기술을 이용하여 단백질을 발산 할 때, 상관없이 유전자 클래스의 용이 간과된다. 엄격한 서열 비교하여 볼 한계를 보정하기위한 노력은 인공 신경망 (21) 등의 관계를 결정하기 위해 시퀀스의 특성을 이용할 수있는 바이오 인포 매틱스 도구를 가져왔다. 인공 신경망 (앤스) 구조적 및 대사 유전자의 예측이 가능하지만, 직접 특성화 하류 실험 검증을 필요유전자 기능. 이 원고의 목적은 신규 한 파아지 유전자의 발현시에 숙주 세균의 양 이화 및 동화 대사를 모니터링 할 노믹 프로토콜을 제공하는 기능적 앤스 통해 예측. phenomics의 필드, 세포 표현형과 관련된 생물학은 잘 알 수 없거나다면 발현 성 기능을 가진 단백질의 조사에 도움을 시스템 생물학에 설립된다. 노믹 도구는 유전자형 정보 표현형 정보를 연결하는 데 사용됩니다. 우리는 자신의 기능 (들)가 파아지 유전자 발현시 관찰 호스트 생리적 효과를 통해 결정될 수있다 추정 파아지 유전자 가설. 이 가설을 조사하기 위해, 두 정량적 방법이 선택되었다. 대사 체학은 특정 싸다 성장하는 동안 호스트 대사 산물의 다양성과 상대적 풍요를 측정하는 동안 멀티 표현형 분석 플레이트 (지도) 호스트 기판 활용 및 후속 바이오 매스 형성을 모니터링하는 데 사용되었다정신 상태. 추정 구조 및 신진 대사에 영향을 미치는 단백질을 대장균에서 과발현 된 두 실험에서 대표적인 결과를 비교. 수많은 영상 기술과 높은 처리량 처리 파이프 라인은 실험 복제를 용이하게하기 위해 제공됩니다. 마지막으로, 제시된 방법의 재현성 및 정확성 주석 캡시드 단백질 및 파지 단백질 대사, 티 오레 독신, 플러스 두 추정 AMGs 예상 생리 효과의 맥락에서 논의되었다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m Sterivex 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m Millex 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m SteriCap 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Omnipore 멤브레인 필터</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>96웰 마이크로 타이터 플레이트</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>표준 F-Bottom 96웰 마이크로플레이트</td></tr><tr><td>2ml 96웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접착 밀봉 플레이트 필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2L Nalgene 사각 병</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125ml Nalgene 사각 병</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 in. 패널 마운트 잠금 너트, 블랙 나일론</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>200 시리즈 미늘에 암 Luer 스레드 스타일 패널 마운트, 1/16 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>여성 루어 스레드 스타일 패널 마운트는 200 시리즈 미늘, 1/8 인치입니다.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>남성 Luer 일체형 잠금 링 500 시리즈 미늘, 1/16 인치. ID 튜빙</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>잠금 링이 있는 남성 Luer x 여성 Luer 커플러</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>가시 격벽 피팅, 1/4 in. OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure 튜빙, 1/16 in. ID x 1/8 인치 OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure 튜빙, 1/4 in. OD x 1/8 인치 ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>가변 유량 미니 펌프(연동 펌프)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반기</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>겸</td>자 <td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* 필터 집게</td></tr><tr><td>다중 플레이트 분광 광도계 플레이트 리더</td><td>분자 장치 분석가 GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 매니폴드</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python 버전 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a></td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td></tr><tr><td>R 버전 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 라이브러리</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a></td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a></td></tr><tr><td colspan="4">서비스:</td></tr><tr><td>West Coast Metabolomics Center</td><td>UC Davis</td><td></td><td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

파지 phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

파지 - 호스트 상호 작용에 현재 조사 (메타) 게놈에서 지식을 외삽에 따라 달라집니다. 흥미롭게도, 60 - 모든 파지 시퀀스의 95 %는 현재 주석 단백질에는 동성을 공유하지 않습니다. 결과적으로, 파아지 유전자의 많은 부분은 가정으로 주석된다. 이 현실은 크게 두 구조 및 보조 대사 유전자의 주석에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 이러한 알 수없는 파지 유전자 중 하나의 표현 동안 선택된 호스트의 생리적 반응 (들)을 캡처하도록 설계 노믹 방법을 제시한다. 대사 체학은 대사 풍부한 다양성을 모니터링함으로써 양방향 생성물 분석을 제공하면서 멀티 표현형 분석 플레이트 (맵), 숙주 기질 활용 및 후속 매스 형성의 다양성을 모니터링하는 데 사용된다. 두 도구 단일 파아지 추정되는 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 발현과 연관된 표현형 프로파일을 제공하기 위해 동시에 사용된다. 두 가지 방법에 대한 대표적인 결과는 highl 비교추정 구조 또는 대사 파아지 유전자를 운반하는 호스트의 표현형 프로파일 차이 ighting입니다. 또한, 실험 분석을 용이하게 시각화 기술과 높은 처리량 계산 파이프 라인이되게됩니다.

여기에서는 추정되는 파지 유전자의 기능적 특성화를 위한 표현형 접근법을 제시합니다. 기술에는 숙주 동화 대사를 모니터링할 수 있는 개발된 분석법, 다중 표현형 분석 플레이트(MAP), 이화 대사에 대한 효과를 측정할 수 있는 확립된 대사체학 방법 등이 포함됩니다.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

다음 실험의 전반적인 목적은 기능이 알려지지 않은 파지 유전자를 스크리닝하고 특성화하는 것입니다. 먼저, ORF라고 불리는 추정 파지 바이러스의 오픈 리딩 프레임을 e coli에서 발현시킵니다.Phage Orff를 발현하는 E. coli 클론을 성장 배지와 다양한 기질이 포함된 다중 표현형 분석 플레이트 또는 맵에 접종합니다. 그 다음, 분석의 두 번째 방법으로 분광법을 통해 시간에 따른 박테리아의 성장을 모니터링하며, phage 유전자를 발현하는 E. coli를 연속 배양 또는 연속 배치 배양 방식으로 배양합니다.이렇게 생성된 성장 대사산물을 수집하여 가스 크로마토그래피-비행 시간형 질량 분석법(gas chromatography, time of flight mass spectrometry)을 통해 대사체 분석을 수행합니다. 결과 데이터는 단일 추정 파지 오픈 리딩 프레임(phage open reading frame)의 발현과 관련된 표현형 프로파일을 제공합니다. 이 방법은 원래 미지의 바이러스 단백질 기능을 규명하기 위해 개발되었습니다.또한 이는 유전자형과 표현형 사이의 연관성을 분석하는 연구나, 다양한 바이옴 전반에서 박테리아 파지와 숙주 간의 상호작용을 조사하는 연구에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 멸균된 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 e coli 클론 식별 번호와 분석에서 테스트 중인 기질을 나타내는 맵 도식 유형을 라벨링하십시오. 멸균수를 액체 저장조에 무균적으로 옮기십시오.그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 60 µL의 물을 분주합니다. 다음으로 3X 기초 배지를 액체 저장소(liquid reservoir)에 무균적으로 옮깁니다. 그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 50 µL씩 분주합니다.동일한 기법을 사용하여 맵 도식에 사용된 각 기초 배지 50 µL를 피펫팅합니다. 다음으로, 각 기질 30 µL를 해당 웰에 옮깁니다. 그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 박테리아 세포 10 µL를 옮깁니다.배양 스톡에 피펫을 다시 넣기 전에 반드시 팁을 교체하십시오. 각 플레이트를 접착식 플레이트 필름으로 덮습니다. 플레이트 웰의 상단과 가장자리를 따라 필름을 단단히 눌러 균일하고 빈틈없이 밀봉하십시오.멸균된 면도날을 사용하여 마이크로타이터 플레이트 가장자리의 과도한 필름을 제거합니다. 준비된 맵을 멀티모드 분광광도계의 입력 슬롯에 넣습니다. 플레이트 리더 소프트웨어를 열고 32시간 동안 총 30분마다 흡광도를 측정하는 프로토콜을 생성합니다.판독 간 60초의 흔들기(shaking) 설정을 하고, 장비의 온도를 37 °C로 설정하십시오. 맵이 설정 온도에 도달하여 평형을 이루면, 32시간 후에 프로토콜을 시작하고 플레이트 리더의 출력 슬리브에서 맵을 꺼내십시오. 각 데이터 파일에 e coone 식별 번호, 날짜 및 맵 도식 유형을 표시하십시오.성장 및 생물학적으로 유의미한 성장을 평가하기 위해 동봉된 문서에 기술된 대로 데이터를 분석하십시오. 대사물질 분석 파라미터에 따라 세포는 연속 배양 또는 계대 배양 배치 방식으로 배양될 수 있습니다. 정상 상태를 유지하기 위함입니다.여기에서는 연속 배양 방법을 시연하겠습니다. 동봉된 문서에 설명된 대로 75 mL 연속 배양 반응기 구성 요소와 2 L 공급 병을 멸균하십시오. 멸균 후, 오토클레이브 처리된 모든 재료를 생물학적 안전 작업대(BSC)에 넣고 배지가 식는 동안 자외선 등을 켜 두십시오. 배지가 식으면 0.1% L-arabinose와 100 µg/mL를 첨가하십시오.0.5 XLB 배지 75 milliliters에 Ampicillin을 첨가하고 이를 연속 반응기로 옮깁니다. 연속 배양 반응기 캡의 포장을 벗겨 반응기에 돌려 끼웁니다. 샘플링 튜브에 손이 닿지 않도록 주의하며, 피딩 병 캡의 포장을 벗겨 피딩 병에 돌려 끼웁니다.샘플링 튜브를 만지지 말고, 포트 epsilon에 연결된 18 inch 튜브를 멸균 상태로 유지하십시오. 18 inch 튜브와 연동 펌프 튜브의 포장을 풉니다. 18 inch 튜브의 한쪽 끝을 연동 펌프 튜브 어댑터의 한쪽 끝에 끼우고, 연동 펌프 튜브 어댑터의 다른 쪽 끝을 18 inch 튜브에 끼웁니다.공급 병 캡의 epsilon 포트를 연결하고, 연속 배양 반응기의 beta 및 delta 포트에 0.22 micron 필터 유닛을 부착하십시오. alpha 포트의 어댑터에 0.22 micron 필터 유닛을 부착하십시오. 그 후, 생물안전 작업대 내에서 18 inch 튜빙을 연결하십시오.첨부 문서에 설명된 대로 준비한 e coli overnight 배양액 100 µL를 연속 배양 반응기에 접종합니다. 반응기와 공급 병의 뚜껑을 단단히 조인 후, 시스템을 37 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 마그네틱 교반기와 미니 연동 펌프가 갖춰진 상태에서, 연동 펌프 튜브 어댑터를 연동 펌프에 장착합니다.피딩 병의 튜브를 펌프에 연결하고 리액터로 이어지게 합니다. 펌프 설정을 'fast'로 맞춘 다음 시작하십시오. 'forward'로 전환하여 배지가 튜브를 통해 흐르기 시작하는지 확인하십시오.반응기를 마그네틱 교반판 위에 놓고 혼합을 시작합니다. 다음 날 샘플을 채취하기 전까지 연속 배양 반응기가 24시간 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 연속 배양물을 채취하려면, 5 mL 루어락 시린지를 포트 gamma에 결합하고 배양액 4.5 mL를 추출합니다.배양액 500 µL를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도를 측정하십시오. 그 후, 남은 분주액을 사용하여 OD 600이 0.35가 되도록 1 mL 배양액 4개를 만들고, 가스크로마토그래피-비행시간 질량분석법(GC-TOFMS) 분석용 샘플을 준비하기 위해 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주하십시오. 세포를 16,900 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성시키십시오.원심분리 후 상층액을 제거하고, 500 µL의 PBS로 세척합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하여 상층액을 마지막으로 제거한 다음, 세포 펠렛이 포함된 마이크로 튜브를 액체 질소에 담급니다.기포 발생이 멈출 때까지 샘플을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 모든 샘플의 수집이 완료된 후, 4일 동안 12시간마다 샘플링을 반복하십시오. 클론당 3개의 샘플을 드라이아이스에 넣어 대사체학 코어 시설로 운송하여 샘플 처리 분석 및 GC-MS 정규화를 수행함으로써 바이러스 오픈 리딩 프레임을 확보하십시오.남태평양 라인 제도(Southern Line Islands)의 스타벅 섬(Starbuck Island)과 캐롤라인 AOL의 산호 경계층 아래에서 해수를 채취하였습니다. 47개 클론을 대상으로 72가지 탄소 특이적 조건 하에서의 세균 성장을 맵을 통해 평가하였습니다. 도출된 데이터를 사용하여 해당 클론들을 예상 성장, 기능 획득, 기능 상실 및 성장 없음 표현형으로 분류하였습니다.기능적으로 유사한 단백질을 보유한 클론들이 대사체 프로파일을 갖는다는 가설을 검증하기 위해, 연속 배양으로 증식시킨 84개 클론의 중앙값 대사체 풍부도를 GC TOF ms로 측정하였다. 생성된 데이터는 상대적 대사체 풍부도를 기준으로 클론들을 계층적으로 군집화하는 데 사용되었으며, 이는 색상으로 표시되었다.가장 풍부한 대사체는 빨간색으로, 가장 적은 풍부도를 보이는 대사체는 진한 파란색으로 표시되었습니다. 예비 대사체 분석 결과, 구조 유전자와 대사 유전자는 서로 명확하게 구분되지 않았으나, 호스트에 유사한 영향을 미치는 유전자들은 서로 상관관계가 있음이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 주석 처리된 캡시드 유전자는 본 연구에서 강조된 추정 대사 유전자 EDT 24 40 및 EDT 24 41과 밀접하게 군집화되었습니다. 공개적으로 이용 가능한 transmembrane topology 및 signal peptide 예측 프로그램을 이용한 조사 결과, 두 추정 대사 유전자 모두 단일 transmembrane domain을 보유하고 있다는 증거가 나타났습니다.흥미롭게도, 첫 번째 클러스터 그룹에 속한 9개의 클론 중 5개는 동일한 토폴로지를 사용하는 예측 막관통 도메인을 가지고 있습니다. 종합하면, 이러한 데이터는 이 방법이 클론 대사체 프로필, 관련 기능을 가진 잠재적 클론 및 클론 대사체 이상치에 대한 정보를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 이 절차를 시도할 때는 제시된 방법들이 박테리아 생리학의 영향을 크게 받는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.오염을 방지하고 적절한 대조군을 사용하여 단일 변수를 테스트하며, 클론 독립 그룹이 실험에 사용되도록 보장하기 위한 고려 사항이 필요합니다.

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

셀 무료 녹음 방송 번역 플랫폼의 새로운 세대 생화학 시스템에 생체 외에서 유전자 회로 실행을 통해 구성 설계 되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 모든 대장균 세포 무료 TXTL 시스템을 사용 하 여 그들의 게놈에서 살 균 소 MS2, ΦΧ174, T7, 등는 합성 하는 방법을 설명 합니다.

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

이 프로토콜을 통해 숙주에 대한 프로파지의 영향을 밝힐 수 있습니다. 박테리아 배양은 용원 상태를 가장 잘 지원하는 조건을 사용하여 동기화되어 자발적 유도를 제한합니다. RT-qPCR은 프로파지 제한 유전자 및 파지 제어에서 결합되지 않은 유전자를 용해 복제 주기 동안 발현되는 유전자와 명확하게 구별합니다.

전사체학(transcriptomics)을 통한 온대 박테리오파지가 라이소겐에 미치는 영향 이해

광학 밀도 기반 마이크로플레이트 방법은 방선균 및 기타 느리게 성장하는 박테리아에 적합한 박테리오파지가 있는 상태에서 장기간 박테리아 성장을 정량화하는 데 설명됩니다. 이 방법에는 증발 및 뚜껑 응축을 줄이기 위한 수정과 곡선 아래 면적, 성장 최대 및 상대적 독성을 포함한 바이러스 감염 메트릭을 계산하기 위한 R 코드가 포함됩니다.

방선균테리오파지 감염을 특성화하기 위한 적응형 광학 밀도 기반 마이크로플레이트 분석

박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(파지)는 장내 마이크로바이옴의 필수 구성 요소입니다. 이러한 공생 생물이 박테리아 적합성과 개체군 역학을 주도하지만 장내 항상성과 질병에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델 내에서 분리된 T4 파지를 연구하며, 다른 파지-박테리아 쌍에 적응할 수 있습니다.

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

여기에서는 시아노파지(및 그 숙주)를 분리하기 위해 해양 및 담수 생태계의 유쾌한 영역에서 샘플링하는 방법과 단일 유전자형을 풍부하게 하고 바이러스-숙주 상호 작용 역학을 특성화하는 사후 샘플링 프로세스에 대해 설명합니다.

광합성 미생물 및 바이러스의 환경 샘플링: 현장에서 실험실까지

Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

학습하세요 파지 유전자 기능 분석을 위한 MAPs 및 대사체학 방법을 E. coli에서 활용하는 기술입니다. 이 방법은 미생물학 연구에서 바이러스 단백질 특성화에 효과적입니다.

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