Name: 생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 생체 외 및 생체 내 모델을 활용하여 전단 응력 조건에서 혈관 내피 세포에 대한 황색포도상구균 부착 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 심내막염 및 혈관 감염 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 퐁 voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k (FWO) 데런 G0466.10, 11I0113N에 의해​​ 지원되었다; 소아 심장과, UZ 루벤, 벨기에 &quot;에디 멕스 연구비&quot;와 &quot;SPORTA 연구 그랜트&quot;(JC); 분자 및 혈관 생물학 센터는 루벤 대학에서 &quot;Geconcentreerde Onderzoe​​ksacties&quot;(GOA 13분의 2,009)과 베링거 인 겔 하임의 연구 보조금에 의해, Programmafinanciering KU 루벤 (PF / 10 / 014)에 의해 지원됩니다.

동물 실험은 KU 루벤의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 체외 관류 및 생체 실험 1. 준비 박테리아 <ol><li> 우리는 미 사용 구균이 원고에 설명 된 모든 실험 변형 뉴먼을. S. 구균 뉴만는 -80 ° C에서 10 % 글리세롤로 뇌 심장 주입 (BHI)에 저장 하였다. </li><li> 37 ° C (OD&gt; 3 600)에서 / N을 얼어 붙은 박테리아를 긁어 5 ㎖의 트립신 간장 국물 (TSB) O에 접종 멸균 루프를 사용합니다. </li><li> 원심 분리 (2,600g, RT, 5 분)에 의해 박테리아를 세척하고 5 ml의 PBS (인산염 완충 식염수)에있는 박테리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> 에탄올 5 (6) 카르복시 - 형광 N-히드 록시 숙신 에스테르 (카르복시 - 형광)의 1 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다. 실험실 등급 물에 150 μg의 / ㎖로 1 ㎎ / ㎖ 카르복시 플루오 레세 인 용액 (예를 들어, 한 MilliQ 워터) 희석. 빛의 튜브를 보호-20 ° C에서 알루미늄 포일과 함께 가게. </li><li> (2600 XG, RT, 5 분) 박테리아를 원심 분리기. 800 μL PBS에 박테리아 펠렛을 재현 탁하고 200 μL 또는 150 μg의 / ㎖ 카르복시 형광 용액 400 μL (최종 농도 생체 실험 50 ㎍ / ㎖) (관류 실험 30 ㎍ / ml의 최종 농도)를 추가합니다. 알루미늄 호일로 광으로부터 튜브를 보호하고 쉐이커상에서 RT에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 표지 한 후, PBS에서 6 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 블록. </li><li> 광학 농도계를 사용하여 박테리아 (OD), OD 시험관 실험 0.65 600 희석 (과 외경 생체 실험 1.8 600 (약 3 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) 황색 포도상 구균에 대한 / ㎖에 해당) PBS에서 황색 포도상 구균 약 1 × 109 CFU / ㎖)에 해당. 알루미늄 호일로 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 둡니다. </li></ol> 2. 체외 관류 실험 <ol><li> 유리 Coverslips는의 코팅 <ol><li> 실험실 등급 물 폰 빌레 브란트 인자 (VWF) (P Haemate 재고 μg의 농도가 2400 / ml)로 희석를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 (증류 된 탈). </li><li> 160 μg / ML의 최종 농도로 (제조자에 의해 공급되는 SKF 용액의 pH 2.7-2.9) 등장 글루코오스 용액에 콜라겐을 희석. </li><li> 파라 필름에 코팅 200 μL 적하하고 액적 위에 커버 슬립을 배치함으로써 VWF 또는 콜라겐 코트 커버 글라스 (24 × 50mm). 액 커버 슬립의 표면을 따라 확산된다. </li><li> 실온에서 4 시간 동안 가습 용기에 커버 슬립을 품어. 조심스럽게 무딘 바늘로 파라 필름에서 된 커버를 들어 올립니다. 유량 용기의 바닥 부분에 커버 슬립을 탑재합니다. </li></ol></li><li> 플라스틱 코팅 내피 세포로 미끄러 <ol><li> 코트 플라스틱 전표(1 PCA 웰 세포 배양 챔버, Sarstedt의, 독일) PBS에 1 % 젤라틴 용액 1 ㎖와 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 젤라틴 코팅 된 플라스틱 전표에 씨앗 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) 및 70~80%의 포화 상태로 성장한다. 유량 용기의 바닥 부분에 플라스틱 슬립을 탑재합니다. </li></ol></li><li> 관류 실험 참고 : 체외 관류 모델의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. <ol><li> 다른 생리 학적 유동 조건을 시뮬레이션 2.5 다인 / cm 2 및 20 다인 / cm (2) 사이에 층류 전단 응력에서 마이크로 - 평행 판 유량 용기에 시험관 세균성 유착 과정을 수행한다. </li><li> 유량 용기 (자체 설계) 금속 프레임과 유기 유리로 만든 관류 실 (폴리 (메틸) 메타 크릴 레이트 (PMMA))로 구성되어 있습니다. 고정밀 주입 펌프 (2000 PHD 주입 하버드있어서, USA)에 연결하여, 우리는 플로우 (RA)를 생성 할 수있다0.0001 μL / 분, 220.82 ml / 분 사이 TES. </li><li> 유량 용기의 상부에 튜브를 연결하고 튜브에 매체를 삽입. 부드럽게 저부 위에 유동 챔버의 상부를 배치하고 유동 챔버를 조립한다. 공기 방울을 피하기 위해주의해야합니다. 챔버가 누출되지 않았는지 확인하고 여분의 코팅 용액을 제거 챔버를 통해 매체의 1 ml에 주입한다. 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 현미경 트레이에 37 ° C에서 열 제어 가열 패드에서 마우스를 놓습니다. 이 절차는 단말이기 때문에, 엄격한 asceptic 절차가 필요하지 않다. 경정맥 근처 절개를 부드럽게 자궁 근육의 오른쪽 측면을 제거하고 주변 조직으로부터 경정맥을 분리. </li><li> 주입 펌프 및 형광 현미경을 설정합니다. 주입 펌프 설정은 주사기의 직경과 원하는 유량 (2.4 절 참조)에 따라 달라집니다. 지금부터, 어두운 방에서 작동합니다. </li><li> VWF 코팅 : <ol><li> 형광 표지 된 세균을 채우고 주사기 주입 관에 연결. 공기 방울을 피하십시오. 10 분 동안 주입 펌프를 시작합니다. 주입 시간이 사용 전단 속도 및 코팅, 박테리아 배지에 따라 밀착성의 정상 상태를 표현한다. </li><li> 10 분 후, 주입 관을 PBS와 주사기를 연결하고 주입 펌프를 개시하여 결합되지 않은 세균을 씻어. </li><li> 세척 과정 후 다른 위치에서 적어도 15 이미지 나 동영상을 가져 가라. 박테리아에 초점을 작은 잠재적으로 어렵습니다. 시험 관내 유동 실험에 앞서, 적절한 초점면은 커버 슬립에 형광 표지 된 박테리아의 드롭을 배치하고 유동 챔버 커버 슬립을 배치하여 검색 될 수있다. 이어서, 적절한 초점 평면을 검색하고 설정을 저장한다. 주 : 시험 관내 유동 실험 기간 동안, 세정 공정 중에 이미지를 캡처 (± 시작 후 5 분) 만 보장 그런부착 세균에 대한 신호가 포착된다. </li></ol></li><li> 콜라겐 코팅 : <ol><li> 단지 관류를 시작하기 전에 형광 표지 된 박테리아에 60 μg의 / ㎖의 VWF를 추가합니다. 60 μg의 / ㎖로 보충 VWF 형광 표지 또는 형광 표지 된 박테리아 박테리아를 채우고 주사기 주입 관에 연결. 공기 방울을 피하십시오. 반복 2.3.5.2 2.3.5.3에 단계 </li></ol></li><li> 내피 세포 : <ol><li> 칼슘 -ionophore A23187의 0.1 mM의 용액으로 관류에 의해 내피 세포를 활성화하여 관류에 의해 10 분 동안 박테리아 관류 동일한 전단 속도에서 DMEM에서 (원액을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 용해 된 10 mM) 0.1 mm이다. 반복 2.3.5.3에 2.3.5.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 다음과 같이 전단 속도와 전단 응력을 계산합니다. 전단 속도 = 6Q / WH 2 : Q는 : W ml / 분의 속도, 흐름 : CM에서 폭, H : CM 높이 전단 응력 (τ) = 전단 쥐예 점도 (μ) 여기서 μ : 중간 : 0.01 다인 X 초 / ㎠, 전체 혈액 : 0.04 다인 X 초 / ㎠ </li><li> 이미지 분석 <ol><li> 흑백 카메라와 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 라이브 영상을 얻기 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 개발할 수 있습니다. 1.5 초의 노출 시간을 사용합니다. 무작위로 유량 용기의 코팅 된 표면에 걸쳐 여러 스냅 샷 (이상 15)을 가지고 해당 파일 형식으로 저장할 수 있습니다. </li><li> ImageJ에와 이미지 분석을 수행합니다. 관심의 기능에 그레이 스케일 이미지를 분할, 하부 및 상부 임계 값을 설정하는 임계 값을 정의 - 이미지 (빼기 배경 프로세스)에서 부드러운 연속 배경을 제거하는 배경을 뺍니다. 임계 값에 한정되는 영역을 측정한다. </li><li> 박테리아 부착을 비교 통계 분석 소프트웨어를 사용하여, 예를 들면 형광 영역으로 표현. 일방향 ANOVA 또는 t를 사용하여 그룹을 비교WO 꼬리 학생의 T- 테스트를. 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차로 모든 값을보고합니다. 중요한 &lt;0.05의 P- 값을 고려 (* P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 생체 장간막 관류 모델 3. <ol><li> 마우스의 제조 / 수술 <ol><li> 대변​​을 제한하기 위하여 실험 전날 밤 마우스를 빠르게. </li><li> 부 프레 노르 핀의 피하 주사 수술 전에 (0.1 ㎎ / ㎏ 체중 (BW)) 20 ~ 30 분으로 6-8 주 이전 마우스 (C57BL / 6) 수술 전 진통제를주십시오. </li><li> 복강 내 케타민 주사 (125 ㎎ / ㎏ BW)과 자일 라진 (12.5 ㎎ / ㎏ BW)에 의해 마우스를 마취. 페달 반사에 의해 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 적용합니다. </li><li> 현미경 트레이에 37 ° C에서 열 제어 가열 패드에서 마우스를 놓습니다. 이 절차는 단말이기 때문에, 엄격한 ascepti 필요 없다C 절차. 경정맥 근처 절개를 부드럽게 자궁 근육의 오른쪽 측면을 제거하고 주변 조직으로부터 경정맥을 분리. </li><li> 형광 표지 된 세균이나 다른 솔루션의 주입에 적합한 경정맥에 2 프랑​​스어 정맥 카테터를 삽입합니다. 중간 선 복부 절개를 통해 복강을 열고 mesenterium를 확산하기 위해 면봉을 사용하여 장간막 동맥과 세정맥 순환을 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 투명 플레이트에 오른쪽 마우스를 놓고 테이프로 캐 뉼러를 고정. 저체온증을 방지하기 위해 뜨거운 팩을 사용합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해, 창자에 500 μL 0.9 % NaCl을 놓습니다. </li></ol></li><li> 장간막 순환 세균의 유착 형광 현미경 <ol><li> 어두운 방에서 작업 할 수 있습니다. 혈관을 고정하고 거꾸로 현미경을 시각화하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 국소 10 mM의 솔루션 O 5 μl를 적용F 칼슘 -ionophore A23187 DMSO에 용해. 10 초 후, 경정맥 카테터를 통해 박테리아를 분류 100 μL (단계 1 참조)에 주입. 시간 경과 이미지를 가져 가라. 실험이 종료 된 후, 승인 기관 가이드 라인에 따라 마우스를 안락사. </li></ol></li><li> 이미지 분석 <ol><li> 흑백 카메라를 이용하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 개발 캡처 반전 형광 현미경을 이용하여 실시간 화상을 얻기. 자동 노출 시간과 사용되는 장비에 특정 대비 최적화를 적용합니다. </li><li> 1,000 이미지 / 초 40주기를 사용하여 - 도구 모음의 &#39;취득&#39;도구 (시간 다차원 취득)를 사용하여 시간 경과 이미지를 획득. 해당 이미지 파일 포맷으로 이미지를 저장한다. </li><li> 이미지 당 형광 신호의 영역을 측정하는 ImageJ에 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​. F에 그레이 스케일 이미지를 분할하는, 상부 및 하부 임계 값을 설정하는 임계 값을 정의관심 eatures. 이자 (혈관)의 영역을 식별하고 상기 임계 관심 영역에 한정되는 영역을 측정한다. 세균 부착을 비교, 어떤 통계 나 그래프 소프트웨어를 사용하여 형광 영역으로 표현했다. </li></ol></li></ol>

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전단 응력은 혈관 벽에 초기 세균 접착 및 혈관 내 또는 심 내막 식생 및 전이성 감염 4,5의 다음 세대를위한 중요한 요소이다. 우리는 생리적 전단 응력에 따라 혈관 내 감염의 발병 기전을 연구하기 위해 생체 외 및 생체 내 모델에서 보완 설명했다. 이 모델은 우리가 주요 S.으로 폰 빌레 브란트 인자 결합 단백질 (vWbp)를 식별 할 수있다 구균 단백질은 VWF 4 노출 부상 혈관 벽 흐름에서 상호 작용할 수 있습니다. 혈관 내 감염, 특히 감염성 심내막염뿐만 아니라, 때문에 로컬 및 원격 ( &#39;전이&#39;) 합병증뿐만 아니라, 때문에 패혈증에 의한 장기 부전 및 사망의 우려이다. 심내막염과 전이성 감염을 일으키는 세균이 혈관 벽에 부착함으로써 흐르는 혈액의 전단 응력에 저항해야한다. 가장세균에 대한 연구는 요인 정적 조건에서 수행 된 독성. 그러나 이러한 설립 상호 작용은 세균 호스트 상호 작용의 새로운, 이전에 인식 할 수없는 요인을 밝힐 수 유량 조건에서 전단력과 연구를 견딜 수 있습니다. 마이크로 병류 챔버를 사용하여, 그리고 다른 혈관 접착 VWF의 중요성을 보여준다. 전단 응력에서 점진적가 전개 될 그 휴식 구형 구조에서 VWF하고는 GPIB 수용체 (6)를 통해 혈소판과 상호 작용 A1 도메인을 제공합니다. 흐름 챔버 광범위 혈소판 기능 (7)을 연구하기 위해 사용되었다. 놀랍게도, 또한 S. 유동하 구균 밀착성 전단에 노출 A1 도메인 VWF 필요하며, 특히. 우리는 vWbp는 VWF 바인딩 중재 확인했다. vWbp은 S.에 기여하는 응고 효소이다 호스트의 프로트롬빈을 활성화하여 구균의 병태 생리. Staphylothrombin, 입술세균 응고 효소와 프로트롬빈의 복잡한을 ulting, 불용성 섬유소 8,9에 피브리노겐을 변환합니다. 우리의 연구 vWbp 만 프로트롬빈을 활성화시키지 않는 것을 도시하지만, 유동 4,10,11 하에서 혈관 밀착성을 향상 박테리아 피브린 혈소판 집합체의 형성을 유발 하였다. 체외 유량 용기 모델은 세포 또는 매트릭스 구성 요소에 세균 부착에 다른 선수를 연구 할 수 있습니다. 박테리아 병원성 인자는 특정 표면 단백질을 발현하는 돌연변이 또는 무해한 균을 이용하여 연구 될 수있다. 대안으로, 약물 억제제 또는 차단 항체는 유동 챔버 내의 매질에 첨가 될 수있다. 그러한 세포 외 기질의 다른 구성 성분으로서 숙주 인자의 역할은 서로 다른 코팅으로 커버 슬립을 이용하여 연구 될 수있다. 커버 슬립은 활성화 상태가 특정한 자극을 추가하여 변조 될 수있는 내피 세포로 피복 될 수있다. 아파혈관벽에서 RT는, 숙주 세포 및 혈액 혈장 단백질의 기여는 유동 매체에 이들 인자를 첨가하여 연구 될 수있다. 따라서, 증가하는 복잡성의 다른 조건은 세균이 생체 내에서 혈관 벽에 부착 할 수 있도록 상호 작용을 해명 층류의 표준화 된 조건에서 연구 될 수있다. 체외 모델에서 확인 된 상호 작용은 이후 복잡한 유기체의 관련성을 테스트하기 위해 동물 모델에서 공부하고 있습니다. 흐름에 따라 동적 상호 작용을 연구하는 생체 내 모델에서 다른 하나는 같은 햄스터의 지느러미 피부 집계 챔버 (12)와 cremaster 모델 (13)로, 기술되었다. 이에 비해, 여기에서 설명 장간막 관류 모델 가능성 마우스의 유전 적 배경을 호스트 다양하고 약리 개입을 평가하기 때문에 사용의 용이성의 여러 가지 이점을 제공한다. 결론적으로, 모델 바와S의뿐만 아니라 표면 단백질을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다 구균,하지만 다른 호스트 배경에 다른 많은 미생물의 더 나은 혈관 감염의 발병 기전을 이해합니다.

혈관 내 감염을 일으키기 위해 병원체는 혈관 벽과 심장 내부 표면을 둘러싸고 있는 내피에 달라붙어 빠르게 흐르는 혈액의 전단 응력에 노출되었음에도 불구하고 감염을 지속하고 확립하는 메커니즘이 필요합니다. 생명을 위협하는 혈관내 감염 및 감염성 심내막염을 일으키는 가장 빈번한 병원체는 황색포도상구균(S. aureus)입니다1. 
다양한 박테리아 표면 결합 접착 분자는 세포 외 기질 구성 요소와 상호 작용하여 숙주 조직에 대한 접착을 매개합니다. 이러한 MSCRAMM(접착 매트릭스 분자를 인식하는 미생물 표면 성분)은 피브로넥틴, 피브리노겐, 콜라겐 및 폰 빌레브란트 인자(VWF)와 같은 분자를 인식합니다. MSCRAMM은 S. aureus의 중요한 독성 인자이며 숙주의 식민지화와 침입에 관여합니다2. 이러한 독성 인자에 대한 대부분의 연구는 정적인 조건에서 수행되었기 때문에 흐르는 혈액에서 박테리아의 초기 부착이 발생하는 인간 감염을 대표하지 않을 수 있습니다. 
혈류 감염의 경우 박테리아는 혈관 벽에 부착하기 위해 흐르는 혈액의 전단력을 극복해야 합니다. 따라서 유동 조건에서 박테리아와 내피 또는 내피 하 사이의 상호 작용을 조사하는 모델이 특히 중요합니다. 
최근 연구에 따르면 전단 응력 하에서 S. aureus가 혈관에 부착되는 것은 VWF3에 의해 매개됩니다. 전단 응력 작용 단백질인 VWF는 활성화 시 내피 세포에서 방출됩니다. 순환 VWF는 노출된 내피하 기질의 콜라겐 섬유에 결합합니다. 우리 그룹은 S. aureus의 von Willebrand 인자 결합 단백질(vWbp)이 VWF4에 대한 전단 매개 접착에 중요하다고 보고했습니다. 
이 기사에서는 세포외 기질의 다른 구성 요소 또는 내피 세포에 대한 박테리아 접착을 평가할 수 있는 체외 유동 챔버 모델을 제시합니다. 체외 데이터에서 결과를 검증하기 위해 실시간 생체 내 혈관 현미경을 사용하여 박테리아와 혈관 벽의 직접적인 상호 작용 및 생쥐의 장간막 순환에서 박테리아-혈소판 혈전 형성을 시각화하고 정량화하는 생체 내 모델을 개발했습니다.

<table><tbody><tr><td>뇌 심장 주입 (BHI)</td> <td>BD Plastipak&nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>형광 라벨링&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V (BSA)</td> <td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm 콜라겐</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>콜라겐</td></tr><tr><td>1-well PCA 세포 배양 챔버</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>플라스틱 슬립</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>브루프레노르핀</td></tr><tr><td>아네스케틴(케타민 염산염 115mg/ml(100mg/ml 케타미늄))Eurovet</td><td></td> <td>BE-V136516</td><td>케타민</td></tr><tr><td>XYL-M 2%(자일라진 염산염 23.32mg/ml(20mg/ml 자일라진))VMD</td> <td>Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>자일라진</td></tr><tr><td>2 프렌치 정맥 카테터 녹색</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% 염화나트륨(NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>면 스왑</td>스 <td>인터내셔널 메디컬 제품</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionophore 용액 A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 게이지 1 ml 주사기&nbsp; &nbsp;</td><td>BD 플라스티팩&nbsp;</td><td></td><td></td>300013</tr><tr><td>26 게이지 1 ml 주사기&nbsp; 바늘 BD</td><td>Plastipak&nbsp;</td><td>300015</td><td>복강내 주입</td></tr><tr><td>원심분리기 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>두께 No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 주입</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>고정밀 하버드 주입 펌프</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>도립 형광 현미경</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Analysis 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad 소프트웨어</td><td>분석 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp;</td><td>흑백 카메라</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

혈관 감염 심내막염 발생할하기 위해, 박테리아는 흐르는 혈액의 전단 응력에 노출 된 상태로 혈관 벽에 부착 할 수 있어야한다. 미생물의 부착에 기여하는 혈관 박테리아 및 숙주 요인을 파악하기 위해, 전단 생리적 조건 하에서 이러한 상호 작용을 연구 적절한 모델이 필요하다. 여기서, 우리는 세포 외 기질의 서로 다른 컴포넌트에 세균 밀착성을 조사하기 위해 또는 내피 세포 받을수 관내 유동 챔버 모델을 설명하고 개발 된 생체 내에 현미경 모델이 직접 생체 내에 내장의 순환에 박테리아의 초기 밀착성을 시각화 . 이러한 방법은 기류 하에서 박테리아의 부착에 필요한 박테리아 및 숙주 요인을 파악하기 위해 사용될 수있다. 우리는 전단 응력의 ​​관련성과 Staphy의 접착 폰 빌레 브란트 인자의 역할을 도시lococcus 구균 모두 시험 관내 및 생체 내 모델에서 사용.

VWF에 황색 포도상 구균의 접착, 피하 매트릭스와 내피 세포는 전단 응력 의존 현상이다 S. 사이의 상호 작용에 전단 응력의 ​​역할을 강조 구균과 VWF, 우리는 다른 전단 속도로 코팅 된 커버 (체외 관류 모델의 개략적 인 개요 황색 포도상 구균의 1. 접착이 250 초에서 증가 전단 율 증가 VWF하는 그림에 제시되어있다 -1 2,000에 VWF을 통해 관류를 수행 초 -1 (도 2), 높은 전단력이 억제되지만 VWF에 박테리아의 부착을 강화하지 않는 것을 나타낸다. 콜라겐 세균성 유착 VWF의 기여도를 조사하기 위해, 피하 행렬의 주성분은, 우리는 형광 표지 된 관류 S. VWF의 존재 또는 부재하에 콜라겐 위에 구균. VWF, S.의 부착이없는콜라겐 ureus는 전단 속도가 증가함에 따라 감소 하였다. 그러나 VWF는 배지에 존재하는 경우이며, S.의 밀착성 아우 레 우스는 전단 율을 (도 3)가 증가함에 따라 증가 하였다. 체외 흐름 모델은 또한 흐름 하에서 내피 세포 박테리아의 부착을 조사있게 해준다. 우리는 HUVECs를가와 형광 S.을 표시 관류 전단 속도 500에서 2,000 초 구균 -1. 표시된 경우, HUVECs를가 VWF의 방출을 유발하는, 칼슘 -ionophore으로 활성화되었다. 내피 세포의 활성화 및 후속 VWF 자료, S의 증가 접착 전형적인 &quot;문자열 형&quot;패턴을 형성 구균 (도 4a)의 형광 선형 연신 VWF 분자 따라 박테리아의 결합을 제안하는 전단력 (도 4b)의 방향으로 정렬 된 박테리아 클러스터를, 표지. 초기 생체내장의 혈관에 세균 부착이 VWF에 의해 매개된다 S. 이후 생체 내에서 활성화 된 혈관 벽에 세균 부착을 조사하기 위해 (- - / VWF) 구균은 VWF을 준수 할 수 있습니다, 우리는 (VWF + / +)와 VWF 결핍 생쥐 야생형 마우스를 사용했다. 내장의 혈관의 실시간 videomicroscopy은 형광 S. 표시 순환 생체 시각화를 허용 구균 (생체 관류 모델의 개략도 개요는 그림 5에 표시됩니다). 칼슘 -ionophore 의한 내피 세포의 약리 활성 후, 우리는 WT 마우스의 혈관 벽에 개별 박테리아와 세균의 집합체의 신속한 로컬 축적을 관찰 (보조 비디오 1, 2). 박테리아 부착은 거의 VWF의 -deficie의 활성화 혈관벽에서 관찰되지 않았다NT 마우스 (보충 비디오 3) WT 마우스에 접착과 비교 (그림 6). VWF의 부재는 S.의 능력을 저하 구균이 활성화 된 혈관 벽에 부착합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> 그림 1. 체외 흐름 모델의 개략도. 관내 유량 모델은 피하 행렬 세균 밀착성 상이한 전단 의존성 기전 연구를 허용 다기능 모델이지만 또한 혈전 형성. 마이크로 병렬 흐름 챔버는 단백질과 내피 세포의 다른 코팅과 커버 슬립 (플라스틱 또는 유리)에 배치됩니다. 다른 박테리아 (오렌지색 및 회색 도트)의 밀착성을 분석 할 수 있고, 혈장 단백질, 혈소판 및 전혈의 존재의 영향을 평가할 수있다. 혈소판 (파란색 타원) 또는 fibrinog에 대한 형광 마커EN (블루 문자열) 세균성 및 호스트 요소를 구별하기 위해 다른 억제제 (블랙 타원)과 조합하여 사용될 수있다. S의 세균 유착의 대표 이미지 VWF의 존재 (아래)에서 콜라겐 코팅 유무 (상) 구균은 (스케일 바는 100 μm의 경우) 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> S의 그림 2. 접착 전단 속도를 증가 VWF 증가에 구균. 코팅 VWF를 통해 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류 (/ ㎖ 50 μg의가)와 형광 S. 표시 매체에서 250 초 -1 (초 -1) 2,000의 전단 속도 (n은&gt; 5)에서 구균 뉴먼. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S의 그림 3. 접착 내피 밑층에 구균은 전단 및 VWF 따라 달라집니다.와 형광 S. 표지 코팅 된 콜라겐 (160 μg의 / ㎖)를 통해 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류 매체에서 250 초 2,000 -1의 전단 속도 (n은&gt; 5)에서 구균 뉴먼. 여기서 나타낸 VWF (60 μg의 / ml)을 매질 중에 존재 하였다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. ** P &lt;0.01. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> S의 그림 4. 접착 활성화 된 내피 세포에 구균은 내피 세포를 통해 전단에 의존. 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류입니다. (가) 인간 제대 정맥 내피 세포는 칼슘 -ionophore로 활성화되었다의 형광 미 표시 10 분 관류 다음에 23,187 (0.1 mM)을 매체에서 500 초 2,000 -1의 전단 속도 (n은&gt; 5)에서 구균 뉴먼. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. * P &lt;0.05. S.와 활성화 HUVECs를 통해 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류의 (B) 이미지 1000 sec의 전단 속도 -2. S.에서 구균 구균이 VWF의 다량에 접착 (스케일 바는 100 ㎛이다) 제안, ± 200 마이크론 길이의 문자열을 형성한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> 그림 5. 생체 장간막 관류 모델의 개략도. 우측 경정맥 카테터 (노란 선) 불소의 관리에 삽입escently 표시 박테리아 (오렌지 도트), 추가 마취제 또는 제약 억제제 및 항체 등의 다른 구성 요소. 복강 열리고 mesenterium는 형광 현미경으로 혈관 (정맥과 동맥)을 시각적으로 확산된다. VWF의 방출을 유도하는 칼슘 -ionophore에 의한 내피 세포의 약리 활성화 한 후, 박테리아는 경정맥 카테터를 통해 주입 할 수있다. 실시간 혈관 비디오 현미경 형광 표지 된 박테리아를 순환의 생체 내 시각화 및 박테리아 혈소판 혈전의 결과로 형성. 수 있습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> 도 6 S.의 초기 접착력 구균- / - 마우스. 생체 내에서 활성화 된 내피 세포는 C57BL / 6 VWF + / +와 C57BL가 / 6 VWF와 VWF 생체 ​​정맥 장간막 관류 모델에 의해 매개되는. 접착이의 형광 S. 표시 - / - 마우스 로컬 활성화 혈관 벽에 구균은 VWF 크게 낮다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. *** P &lt;0.001, N&gt; 7. <img alt="비디오 그림 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> 비디오 1 : S의 실시간 접착 구균 VWF + / + 마우스의 활성화 혈관 벽에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 2 : 실시간 집계 형성과 S의 색전술 구균은 VWF + / + 마우스에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="비디오 그림 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> 비디오 3 : S의 실시간 접착 - / - 마우스 - / -. VWF + / +와 VWF와 쥐 생체 내 장간막 관류 모델 구균 VWF 활성 혈관 벽에. 칼슘 -ionophore (10 mM)을 다섯 μL는 어플리했다시각 혈관 침대의 지역 에디션. 카르복시 플루오 레세 인 - 표지 S.의 현탁액 구균 경정맥 카테터를 통하여 주입 하였다. 장간막 순환이 거꾸로 현미경으로 시각화했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

전단 응력을 받는 혈관과 박테리아의 상호 작용을 연구하기 위해 혈관 접착에 기여하는 박테리아 및 숙주 요인을 해부할 수 있는 유동 챔버 및 생체 내 장간막 생체 내 현미경 모델이 설명됩니다.

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 전단 응력 하에서 박테리아와 내피 및 내피 하층 사이의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이를 위해 두 번째 단계로 박테리아를 형광 표지하여 비디오 현미경을 통해 실시간으로 시각화합니다. 흐르는 박테리아가 세포 또는 매트릭스 구성 성분에 부착될 때 관여하는 다양한 인자들을 연구하기 위해 인 비트로(in vitro) 유동 챔버를 사용합니다.다음으로, in vitro 모델에서 확인된 상호작용을 in vivo 장간막 관류 모델에서 연구하여 복잡한 생체 내에서의 관련성을 테스트하며, 그 결과 Staphylococcus reus가 전단 응력 하에서 활성화된 혈관 내피세포 및 내피하 조직에 부착될 수 있음을 보여줍니다. 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 in vitro와 in vivo 모델을 모두 포함한다는 점이며, 이는 전단 응력 하에서의 혈관 내 감염 병태생리를 연구하는 데 있어 상호 보완적입니다. 이러한 방법들은 감염성 심내막염 및 전이성 감염이 생리적 전단 응력 하에서 어떻게 형성되는지와 같이 감염성 질환 및 혈관 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 실험 절차는 우리 실험실의 동물 실험 전문 기술자인 Be Malin이 시연합니다. 먼저 박테리아 추적에 사용될 형광 염료를 준비하십시오.스톡 carboxy 형광 용액 150 µL를 실험실 등급의 물 850 µL에 첨가하고 혼합합니다. 해당 용액을 빛이 차단된 -20 °C에서 필요할 때까지 보관하십시오. 그다음, 5 mL의 S. reus 배양액을 펠릿화합니다.tryptic soy broth에서 하룻밤 동안 배양한 박테리아를 PBS로 한 번 세척한 후 재현탁합니다. 800 µL의 PBS에 생성된 새로운 펠렛에, in vitro 관류 실험의 경우 재현탁된 세포에 염료 용액 200 µL를 추가하거나, in vivo 실험의 경우 염료 용액 400 µL를 추가합니다. in vivo 실험 시에는 염료의 광퇴색을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고, 실온의 쉐이커에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 비특이적 결합을 차단하기 위해 PBS에 용해된 6% bovine serum albumin 용액을 혼합물에 첨가합니다. 광학 세포 계수기(optical cytometry)를 사용하여 세포 농도를 확인하고, 용도에 따라 박테리아를 다양한 농도로 PBS에 희석합니다. 희석 후에는 튜브를 빛으로부터 차단하고 얼음에 보관합니다.von Vand 인자를 실험실 등급의수로 희석하여 최종 농도를 50 µg/mL로 만듭니다. 또한, 콜라겐을 등장성 포도당 용액에 희석하여 최종 농도를 160 µg/mL로 만듭니다. 그런 다음, 각 코팅 용액 200 µL를 파라폼 스트립 위에 떨어뜨립니다.커버슬립을 액적 위에 올려 단백질로 코팅합니다. 습윤 용기 내에서 실온으로 4시간 동안 커버슬립을 배양합니다. 그다음 뭉툭한 바늘을 사용하여 파라폼에서 커버슬립을 조심스럽게 들어 올리고, 혈관 내피 세포 실험을 위해 흐름 챔버의 바닥 부분에 커버슬립을 장착합니다. 플라스틱 슬립은 PBS 내의 1% 젤라틴 용액 1 mL로 코팅하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 다음, 젤라틴이 코팅된 플라스틱 슬립에 인간 제대정맥 내피세포를 파종하고 70~80% 합류도(confluency)까지 배양합니다. 단백질이 코팅된 커버슬립 또는 내피세포가 코팅된 플라스틱 슬립을 유동 챔버(flow chamber)의 하단부에 장착합니다. 이어서 유동 챔버의 상단부에 입구 및 출구 튜브를 연결하고, 출구 튜브를 폐기물 용기에 연결합니다.플로우 챔버의 상단부를 하단부 위에 조심스럽게 올려놓고 플로우 챔버를 조립합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 챔버에 누수가 없는지 확인하고 과잉 코팅 용액을 제거하기 위해 1 mL의 배지를 챔버를 통해 주입합니다.다음으로, 1mL 주사기를 사용하여 분당 75µL의 속도로 흐르도록 인퓨전 펌프를 설정합니다. 암실에서 1mL 주사기에 형광 표지된 박테리아 1mL를 채운 후 인퓨전 펌프에 장착합니다. 주사기의 배출구를 유동 챔버(flow chamber)의 유입구에 연결합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며, 주입 펌프를 75 µL/min의 속도로 10분 동안 작동시킵니다. 10분 후, 첫 번째 시린지를 제거하고 PBS 또는 DMEM이 들어 있는 1 mL 시린지를 유입 튜브에 연결합니다. 주입 펌프를 작동시켜 10분 동안 린스하여 결합되지 않은 박테리아를 모두 씻어냅니다.세척 후, 인퓨전 펌프를 켠 상태에서 코팅된 플로우 챔버 표면 전체에 걸쳐 무작위 위치에서 1.5초의 노출 시간으로 흑백 이미지를 최소 15장 촬영합니다. Image J와 같은 이미지 분석 프로그램을 사용하여, 배경 제거(subtract background)를 통해 이미지의 매끄럽고 연속적인 배경을 제거하고, 임계값(threshold)을 정의하여 회색조 이미지를 관심 영역으로 분할할 하한 및 상한 임계값을 설정합니다. 그런 다음 새롭게 생성된 임계값 범위로 제한된 영역을 측정하고, 각 샘플에 대해 형광 영역으로 알려진 이 값을 저장합니다.배변 횟수를 줄이기 위해 실험 전날 4~8주령의 마우스를 굶겼습니다. 실험 당일, 진통제로 체중 kg당 0.1 mg의 buprenorphine을 투여하며 시작합니다. 그다음 마우스를 마취하고 눈에 안연고를 도포합니다.마우스를 해부 현미경 아래의 온도 조절 가열 패드 위에 놓은 후, 마우스의 발 반사가 없는지 확인합니다. 경정맥과 평행하게 1cm 절개를 가합니다. 경부 근육의 오른쪽 부분을 제거한 다음, 주변 조직으로부터 경정맥을 분리합니다.2 French 정맥 카테터를 우측 경정맥에 삽입하고 봉합사를 사용하여 고정합니다. 그 다음, 복부 중앙 절개를 통해 복강을 엽니다. 마우스를 투명한 플레이트 위에 우측으로 눕히고 테이프로 캐뉼라를 고정합니다.면봉을 사용하여 장을 조심스럽게 꺼내고 장간막을 펼칩니다. 이는 장간막 세동맥과 혈관 순환을 시각화하기 위함입니다. 저체온증을 방지하기 위해 마우스 위에 핫팩을 올려두고, 조직의 탈수를 막기 위해 30분마다 0.9% NACL 500 microliters를 장 위에 떨어뜨려 줍니다.면봉을 사용하여 혈관을 고정하고 도립 현미경 하에서 관찰합니다. 그다음 DMSO에 용해된 10 mM calcium ionophore 용액 5 µL를 국소적으로 도포합니다. 이렇게 하면 혈관 내 내피세포로부터 Von Willebrand 인자의 방출이 활성화됩니다.10초 후에 형광 표지된 박테리아 100 µL를 경정맥 카테터를 통해 주입합니다. 이때부터 타임랩스 이미지를 촬영하기 시작하며, 툴바의 획득 도구를 사용하여 초당 1000장의 이미지를 40사이클 동안 획득합니다. 이미지 획득이 완료되면 기관 지침에 따라 마우스를 안락사시킵니다.이미지를 적절한 이미지 파일 형식으로 저장한 후, 앞서 설명한 대로 Image J 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리함으로써 박테리아 부착에 있어 전단 응력의 역할을 강조합니다. Von Vbr 인자가 코팅된 커버슬립 상에서 서로 다른 전단 속도로 Staphylococcus aureus 관류를 수행하였습니다. 전단 속도가 증가함에 따라 박테리아 부착 또한 증가하며, 이는 높은 전단력이 박테리아의 단백질 부착을 억제하는 것이 아니라 오히려 강화시킨다는 것을 나타냅니다. Von Vbr 인자가 없는 경우, 전단 속도가 증가함에 따라 콜라겐에 대한 Staphylococcus aureus의 부착은 감소하였습니다.그러나 배지에 Von Willebrand 인자가 존재할 때, 전단 속도가 증가함에 따라 박테리아의 부착력이 증가하였으며, 칼슘 이온ophores를 통해 Von Willebrand 인자를 방출하도록 활성화된 혈관 내피세포는 활성화되지 않은 세포보다 박테리아 부착이 현저히 더 많이 나타났습니다. 또한, 박테리아는 전단력의 방향으로 정렬된 형광 표지 박테리아 군집의 전형적인 실 모양 패턴을 형성하였으며, 이는 박테리아가 선형으로 신장된 VWF 분자를 따라 결합함을 시사합니다. Von Willebrand 인자의 효과를 in vivo에서 테스트하기 위해 장간막 순환의 내피세포를 활성화하여 Von Willebrand 인자를 방출하게 한 다음, 형광 표지된 박테리아 세포를 혈류에 도입하였습니다. 그 결과, 박테리아가 활성화된 혈관 벽에 국소적으로 부착되어 응집체를 형성하였습니다.이 영상을 시청하고 나면, 박테리아를 형광 표지하고 인비트로(in vitro) 유동 챔버와 인비보(in vivo) 생체 내 장간막 관류 모델에서 시각화함으로써 전단 응력에 따른 박테리아와 혈관벽 간의 상호작용을 조사하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 심혈관 감염 분야의 연구자들이 감염성 심내막염 및 전이성 감염에서 병원균과 혈관벽 사이의 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

출처: Ditkowski, B. 외 박테리아가 이식 조직에 부착하는 현상을 연구하기 위한 평행판 관류 시스템의 in vitro 모델. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 평행판 유동 챔버를 이용해 형광 표지된 박테리아를 혈관 이식 조직 위에 관류하는 방법을 시연하여, 전단 흐름 조건에서 박테리아 부착과 초기 병태 기전을 통제하여 분석할 수 있게 합니다.

조직 생검에서 박테리아 부착을 연구하기 위한 in vitro 평행판 유동 모델

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

우리는 사내 디자인 된 생체 외에서 흐름 챔버 모델, 조직 이식에 세균성 부착의 조사 수 있는 설명 합니다.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

학습하세요 생체 외 및 생체 내 모델을 활용하여 전단 응력 조건에서 혈관 내피 세포에 대한 황색포도상구균 부착 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 심내막염 및 혈관 감염 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

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