Name: 비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 냉동 버피 코트에서 분리한 말초혈액 단핵세포를 이용해 바이러스 프리 비통합 에피솜 플라스미드로 유도만능줄기세포를 생성하는 비용 효율적인 방법을. 면역형광 및 유전자 발현 분석으로 재프로그래밍 효율을 검증합니다.

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이 연구는 보건부와 교육지원부, 볼차노 자치주 대학 및 연구, 남부 티롤 스파크스 재단의 지원을 받았습니다.

말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs)는 후 동의서와 남부 티롤 지방의 윤리위원회의 승인을 체결 건강한 기증자의 인간의 말초 혈액에서 분리 하였다. 실험은 헬싱키 선언 표현 원리에 따라 수행되었다. 모든 데이터를 수집하고 익명으로 분석 하였다. 말초 혈액 단핵 세포의 분리 1. (PBMNCs) <ol><li> PBMNCs는 밀도 구배 분리하지 않고, 전혈을 원심 분리 한 후 버피 코트로부터 얻은. <ol><li> 시트르산 나트륨으로 정맥 말초 혈액 8ml의 수집은 RT (25 ° C)에서 플라스틱 튜브, 저장 버퍼링. 수집 후 12 시간 이내에 처리 혈액입니다. </li><li> 스위칭 오프 원심 브레이크, 스윙 버킷 회에서 4 ° C에서 15 분 동안 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 흐린 버피 코트 (플라즈마 상부 상과 하부 층 사이에 모아서위상 cryovial 튜브에 PBMNC 농축 분획 (500 μL)를 포함) 적혈구의 대부분을 함유. </li><li> 10 % DMSO의 농도는 1 ml의 총 부피를 얻기 위해 90 % FBS와 20 % DMSO를 함유하는 2 × 동결 배지 500 μL와 버피 코트 500 μl를 재현 탁. </li><li> -80 ° C로 제어 된 레이트 냉동 컨테이너 바이알 동결. 더 긴 기간 동안 액체 질소에 보관 세포. </li></ol></li><li> PBMNCs는 밀도 구배 분리 후에 얻어진 <ol><li> 시트르산 나트륨으로 정맥 말초 혈액 12 ml를 수집 실온에서 플라스틱 관 및 스토어 버퍼. 수집 후 12 시간 이내에 처리 혈액입니다. </li><li> 35 ㎖의 최종 부피로 멸균 PBS와 혈액 희석. </li><li> 조심스럽게 천천히, 층 50 ㎖ 원뿔형 튜브 (밀도 구배 분리에 사용) polysucrose 용액 (p = 1.077)에 15 ml의 희석 된 혈액을 35 ㎖ (비율 3 : 1). </li><li> 실온에서 30 분에 800 XG에 튜브를 원심 분리기스윙 버킷 회 전자, 스위칭 오프 원심 브레이크를. </li><li> 상단 노란색의 위상 포함 플라즈마를 대기음 및 폐기. 조심스럽게 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 PBMNCs 함유 불투명 한 백색 계면 층을 옮긴다. </li><li> 멸균 PBS 30 ml의 총 부피를 가져오고 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 PBS의 30 ml의 세포를 재현 탁. 트리 판 블루 배제 (25)에 기초하여 생존 세포의 수를 카운트. </li><li> 원심 분리기 PBMNCs 실온에서 10 분 동안 300 XG에, 뜨는을 대기음 및 폐기. </li><li> 5 × 106 세포 / ml의 농도를 얻기 위해, 90 % FBS와 10 % DMSO를 함유하는 동결 배지 적당량 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 나누어지는 1 ml의 당 유리 병 (약 5 × 10 6 세포 / ㎖)에 컨테이너를 고정하는 제어 속도의 병을 동결 - 80 ° C. 더 긴 기간 동안 액체 질소에 보관 세포. </li></oL&gt; </li></ol> 2. 해동 및 PBMNCs의 도금 (0 일) <ol><li> PBMNCs는 밀도 구배 분리하지 않고, 전혈을 원심 분리 한 후 버피 코트로부터 얻은. <ol><li> 버피 코트로부터 냉동 PBMNCs를 사용하는 프로토콜을 시작하기 위해 37 ℃에서 수욕에서 셀 1 바이알을 해동하고 2 ml의 최종 부피로 멸균 PBS과 버피 코트를 희석. </li><li> , 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 희석 된 버피 코트를 전송 적혈구 용해 완충액 10 ㎖를 추가하고 RT에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> , 적혈구 용해 완충액 500 mL로 제조 중탄산 칼륨 0.5 g, 염화 암모늄 4.145 g, 초순수 500 ㎖, pH가 7.2-7.4 0.5 M EDTA 용액 100 μL를 추가한다. </li><li> 멸균 PBS와 50ml로 전체 볼륨을 가져와 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 PBS의 50 mL로 펠렛을 씻고, 실온에서 10 분 동안 300 XG에 버피 코트를 원심 분리기. </li><li> 에서 세포를 재현 탁IMDM과 햄 F-12 (비율 1 : 1), 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 - 에탄올 아민 (ITS-X) 화학적 1 % 1 % 정의 지질 농축 PBMNC 배지 1 ㎖로 이전에 이루어지는 22 바와 (CDL), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, L- 아스코르브 산 0.005 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 %, 1- 티오 글리세롤 (최종 농도 200 μM) 세포 인자 SCF (100 NG / ㎖) 줄기, 인터루킨 -3 IL-3 (10 NG / ㎖) 에리트로 포이 에틴 EPO (2 U / ㎖), 인슐린 유사 성장 인자 IGF-1 (40 NG / ㎖), 덱사메타손 (1 μM) 및 홀로 트랜스페린 (100 μg의 / ㎖ ). </li><li> 2 × 106 세포 / ml의 농도로, 도포하지 않고, 표준 조직 배양 처리 된 표면을 갖는 12 웰 플레이트의 한 웰로 이동. 변화하는 중간 단계까지 (섹션 3 참조), 37 ° C, 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2에서 세포를 부화. </li></ol></li><li> PBMNCs는 밀도 구배 분리 후에 얻어진 <ol><li> 후 냉동 PBMNCs를 사용하여 프로토콜을 시작하려면밀도 구배 분리, 해동 37 ℃ 수욕 중에서 세포의 1 바이알, PBMNC 배지 5 ㎖에 세포를 옮긴다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> PBMNC 배지 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 2 × 106 세포 / ml의 농도에서, 12 웰 플레이트의 한 웰에 전송할. 변화하는 중간 단계까지 (섹션 3 참조), 37 ° C, 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2에서 세포를 부화. </li></ol></li></ol> 3. 문화 PBMNCs의 확장 (하루 2-13) <ol><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에, 1 ml의 팁과 피펫을 사용하여, 현탁 배양에 PBMNCs를 수집합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 신선한 PBMNC 매체의 1 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 코팅하지 않고, 표준 조직 배양 표면 처리 12 웰 플레이트의 한 우물에 세포를 전송하고, 가습 배양기에서 37 ℃, 5 % CO 2에서 그들을 품어. </li><li그들은 (80 % 정도) 적절한 합류에 도달하면 2&gt; 이틀이 단계를 반복 한 비율 1의 세포를 분리. </li></ol> 에피 솜 플라스미드와 PBMNCs 4. 형질 (14 일) 참고 : 네 상업적 intergation없는 에피 솜 플라스미드의 분리를 수행 플라스미드 정제를위한 상업용 키트를 사용하여 다 능성 유전자를 운반하고 아가 로스 겔 분석을 사용하여 정제 된 플라스미드의 품질을 평가, 제조업체의 지시에 따라. <ol><li> 15ml의 원뿔형 튜브 PBMNCs 모아서 25 (트립 판 블루 배제 기준) 생존 세포 수를 계산. </li><li> 원심 RT에서 10 분 동안 300 XG에 2 × 106 세포. </li><li> 재현 탁 버퍼 T 100 ㎕의 각각의 플라스미드 DNA의 1 μg의 함유 형질 믹스 재현 탁 2 × 106 세포 (p53에 대해 OCT3 / 4 shRNA를 운반 한 플라스미드 한 플라스미드와 실시 SOX2 KLF4 번플라스미드는 L-MYC 및 LIN28을 들고, 한 플라스미드) 형질 전환 효율을 확인하기 위해, EGFP를 들고. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, 100 μL의 선단에 세포를 포함하는 형질 믹스 대기음 전기 기계의 피펫 스테이션에 배치 전해 버퍼 E2 3ml를 충전 튜브에 수직으로 샘플과 피펫을 삽입한다. </li><li> 다음과 같은 프로그램을 사용하여 효율적으로 electroporate 세포 : 1,650 V, 10 밀리 초, 3 펄스. </li><li> 0.25 mM의 나트륨 낙산 NAB ()을 첨가하고, 미리 예열 PBMNC 배지 2 ㎖로 일렉트로 세포 (2 × 106 세포)을 재현 탁하고 25 (트립 판 블루 배제 기준) 일렉트로 프로토콜 후 생존 세포의 수를 계산. </li><li> 코팅없이 6- 웰 플레이트의 한 웰에 세포를 부드럽게 이동 판을 흔들고 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. </li><li> 전기, coun에 다음날형질 전환 효율을 평가하기 위해, 8-10 랜덤 필드에서 형광 현미경 하에서 GFP 양성 세포의 개수를 t. </li><li> MEFs에 (제 6 장 참조)을 도금 할 때까지, 3 일간 분할하지 않고 형질 감염된 세포를 유지한다. </li><li> 신선한 PBMNCs 매체 2 ㎖, 플러스 0.25 mM의의 NaB 이틀를 교체합니다. </li></ol> 5. 공동 문화의 피더 세포와 요리를 준비 (DAY 16) <ol><li> 코트 15 분간 기저막 매트릭스의 1 mL를 6- 웰 플레이트의 웰을 37 ° C에서와 FBS가 포함 된 2 ㎖의 10 %로 / 웰로 2 × 105 세포의 밀도로 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에)을 도금 DMEM (MEF 매체) MEF 피더 세포에 전기 천공 PBMNCs를 계대 전에 일일. </li></ol> MEFs에 상 6. 도금 트랜의 PBMNCs (하루 17 ~ 19) <ol><li> 10 분 동안 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 형질 PBMNCs에, 1 ml의 팁과 피펫을 사용하여, 현탁 배양에 PBMNCs를 수집실온에서. </li><li> mM의의 NaB을 뜨는을 취소하고 신선한 PBMNC 매체의 2 ml의 펠렛을 재현 탁 플러스 0.25. </li><li> MEF 피복 6 웰 - 플레이트 상에 세포를 플레이트 및 가습 된 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. </li><li> 이틀, 배지를 흡인하고 DMEM (KO-DMEM), 20 %의 KO-세럼 교체 (KOSR), 1 mM의 NEAAs, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 mM의 녹아웃 이루어지는 IPSC 배지 2 ㎖로 대체 L- 글루타민, 0.1 MM의 β - 머 캅토 에탄올, 10 NG / ㎖ FGF (기본의 bFGF) 및 0.25 mM의의 NaB. </li><li> 신선한 IPSC 매체의 2ml를 매일 교체하고 매일 세포를 확인합니다. 참고 : 약 22 ~ 25 일에, iPSCs의 첫 번째 식민지 볼 수 있어야합니다. </li></ol> 7. 따기와 유도 만능 줄기 세포의 확장 (iPSCs) 클론 (하루 30 ~ 35)를 참고 : 형질 전환 후 30-35 일째, IPSC의 식민지 따기와 replating에 대한 준비를해야합니다. 프로그래밍 효율은 ESTI해야이전 26보고, IPSC 식민지 / electroporation하여 세포의 총 수의 수의 비율로 결합. <ol><li> IPSC 식민지를 계대 전날, 12 웰 플레이트 (1.25 × 10 5 세포 / 웰)에서 MEF 공급 장치를 준비합니다. </li><li> 대기음은 MEF 매체는 10 NG / ㎖의 bFGF와 10 μm의 Y-27632와 IPSC 매체의 1 mL로 변경합니다. 수동, 그리드를 획득하기 위해 피킹 후드에서 해부 현미경 매번 바늘 한 콜로니와 해부 피펫 팅하여 작은 덩어​​리를 수집하고 MEFs에 코팅 12 웰 플레이트의 한 웰에 개별적으로 전송할. </li><li> 더 전파를위한 4 : 1 비율로 다음이 각 6 웰 플레이트를 : 항로는 비율 1 6 웰 플레이트에 각 12 웰 플레이트를 확장. 해부 한 후 효소 분해 과정을 사용하여, (철저 단계 7.2에서 설명)는 제 2-3 구절에 대해 수동으로 iPSCs를 확장 (단계 7.4에서 시작). </li><li> 효소 분해 프로토콜의 깨끗한 IPSC의 coloni따기 후드의 해부 현미경으로, 차별화 된 부분을 흡입하여 말이지. </li><li> 37 ° C에서 10 분 동안 콜라게나 제 IV 중 1 ㎖ (1 ㎎ / ㎖)와 iPSCs 부화. </li><li> 효소 솔루션을 대기음 KO-DMEM의 1 ml의 세포를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 식민지를 수집합니다. 실온에서 2 분 동안 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는 대기음은 MEF 코팅 6 웰 플레이트에 10 NG / ㎖의 bFGF와 10 μm의 Y-27632 그들을 플레이트 IPSC 매체 2 ㎖의 식민지를 재현 탁 (비율 1 : 4). </li></ol> iPSCs 8. 특성 (5-15 구절 사이) <ol><li> 알카라인 포스파타제 염색 <ol><li> 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 3 ~ 5 일 동안 IPSC 식민지. </li><li> 알칼리 포스 파타 아제 염색 프로토콜을 시작, PBS로 한 번 iPSCs를 씻어 후 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 1 ㎖로 고정합니다. </li><li> 잔류 PFA을 제거하기 위해, PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 사용 얼룩 고정 세포제조업체의 지시에 따라 상용 알칼리성 포스파타제 염색 키트. </li></ol></li><li> 면역 형광 <ol><li> 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 3 ~ 5 일 동안 IPSC 식민지. </li><li> 면역 형광 분석을 시작하려면, PBS로 한 번 iPSCs를 세척 한 다음 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 1 ㎖로 고정합니다. </li><li> 잔류 PFA을 제거하기 위해, PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간 동안 4 % 염소 혈청, 0.1 % BSA, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.05 % 아 지드 화 나트륨을 함유하는 용액을 차단 투과성으로 1 ㎖ / 비수 (NaN 3) 고정 iPSCs 치료. </li><li> 차단 솔루션을 기음과 4 ° C에서 기본 3 % BSA의 항체와 0.05 % NaN의 3 솔루션 O / N로 고정 된 세포를 배양 (차 항체리스트의 재료 테이블을 확인하고 항체 희석 배수 제안). </li><li> 다음 날, 그 다음 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스와 알렉사 플로리다와 세포를 품어, PBS로 iPSCs 세 번 씻어37 ° C에서 1 시간 동안, 3 % BSA 및 0.05 % NaN3가 용액에 1000 : 555 UOR 염소 항 - 토끼 항체, 1 희석. </li><li> PBS로 세 번 세척 한 다음 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 DAPI (1μg / mL)로 핵을 얼룩. </li></ol></li><li> 배아 기관에서 iPSCs의 차별화 (사채) <ol><li> 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 5-6 일 동안 IPSC 식민지. </li><li> 따기 후드의 해부 현미경, 흡입에 의해 IPSC 식민지에서 차별화 된 부분을 제거합니다. </li><li> 37 ° C에서 10 분 동안 콜라게나 제 IV 중 1 ㎖ (1 ㎎ / ㎖)와 iPSCs 부화. </li><li> 효소 솔루션을 대기음 KO-DMEM의 1 ml의 세포를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 식민지를 수집합니다. 실온에서 2 분 동안 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 대기음 상등액과 2 KO-DMEM 이루어지는 EB 배지 ㎖, 20 %는 정의 된 소 태아 혈청 (FBS), 1 mM의 NEAAs, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 mM의 L 글루타민, 0.1 mm 단위 콜로니를 재현 탁46, 메르 캅토 에탄올. </li><li> 구상 입체 배아 체 (사채)의 형성을 허용하기 위해, 매우 낮은 부착 6 웰 플레이트에 육일위한 현탁액 IPSC 식민지를 접시. 신선한 EB 배지 2 ㎖ 이틀을 변경합니다. </li><li> 7 일에, 사채를 수집하고 EB 매체의 2 ㎖에 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 그들을 판 20 일 동안 분화 EBS을 (를) 유지. </li><li> 신선한 EB 배지 2 ㎖ 이틀을 변경합니다. </li></ol></li><li> 유전자 발현 분석을위한 QRT-PCR <ol><li> 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 5-6 일 동안 IPSC 식민지. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 상업 시약 1 ㎖를 사용 PBMNCs, iPSCs 또는 사채로부터 전체 RNA를 추출합니다. </li><li> 이러한 27 (260 / 280, 260 / 230 비율&gt; 1.8 고품질의 RNA) 분광 광도계의 사용과 같은 적절한 방법에 의해 RNA 농도 및 순도를 평가합니다. </li><li> 확인제조자의 프로토콜 (고품질 RNA의 RQI&gt; 9.5) (28)에 따른 상업용 키트를 사용하여 RNA 무결성. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 상용 역전사 키트를 사용하여 전체 RNA 1 μg의에 역전사 반응을 수행한다. </li><li> cDNA를 템플릿의 5 NG, 7.5 μL SYBR 녹색 수퍼 믹스, 5 μm의 프라이머 2 μL 포함 qPCR에 혼합물 준비 (정 : 1 μL 및 역 : 1 μL) 및 각 반응 29의 RNase / DNase의없는 물 6 μl를. </li><li> 45 ~ 60 ° C에서 10 분 동안 95 ° C에서 초기 변성 단계, 15 초 및 프라이머 어닐링 및 신장 단계에 대한 95 ℃에서 변성 단계로 나누어 40주기 다음에 다음 프로그램을 사용 QRT-PCR을 수행 초 29. </li><li> 하우스 키핑 유전자 GAPDH (28)을 사용하는 다른 유전자의 발현을 정규화 (표 1 프라이머 참조). </li></ol></li><li> qPCR에형질 전환 유전자 제외에 대한 <ol><li> 50 mM 트리스, 100 mM의 EDTA, 100 mM의 염화나트륨을 함유하는 용해 완충액 1 ㎖를 사용 PBMNCs 또는 iPSCs로부터 DNA 추출을 1 % 나트륨 도데 실 황산염 (SDS), 20 μg의 / ㎖ 프로 테 K. </li><li> RT에서 5 분 동안 10,000 XG에서 DNA 침전 및 원심 분리를 허용하기 위해 세 번, 100 % 이소프로판올 동량 (1 ml)에 추가 반전 섞는다. </li><li> , 상층 액을 버린다 실온에서 5 분 동안 10,000 XG에 70 % 에탄올과 원심 분리기 1 ml의 DNA 펠렛을 씻는다. 대기음은 상층 액을 버리고의 RNase / DNase를 무료 물에 재현 탁. </li><li> 이러한 27 (260 / 280, 260 / 230 비율&gt; 1.8 고품질의 RNA) 분광 광도계의 사용과 같은 적절한 방법에 의한 DNA 농도 및 순도를 평가합니다. </li><li> (1 μL 및 역 : 1 μL 감기)과 6 DNA 주형의 5 NG, 7.5 μL SYBR 녹색 수퍼 믹스, 5 μm의 프라이머의 2 μl를 포함하는 qPCR에 혼합물을 준비# 181; 각 반응 29의 RNase / DNase의 무료 물 리터. </li><li> (표 1 프라이머 참조) 하우스 키핑 유전자 (29) FBX-15를 사용하여 특정 에피 솜 플라스미드 EBNA-1 유전자의 발현을 정규화한다. </li></ol></li><li> 핵형 분석 <ol><li> 문화 제조업체의 지침에 따라 iPSCs위한 상업 정의, 피더 무료 유지 보수 매체와 공급이없는 기저막 매트릭스 코팅 된 판에 5~6일에 대한 IPSC 식민지. </li><li> 핵형 분석 프로토콜을 시작하기 위해, 단일 셀 분해를 획득 할 때까지 37 ° C에서 5 분 동안 세포 분리 용액 1 ㎖로 IPSC 콜로니를 분리. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 XG에 세포와 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> 배지 2 ㎖로 재현 탁 iPSCs 구체적 산전 진단 기법을위한 세포를 배양하기 위해 개발. 기저막 매트릭스 코팅 유리 접시 상 접시 단세포 iPSCs하고, 37 ° C에서 그들을 부화 5 % CO 2 &lt;/ 서브&gt; 인큐베이터. </li><li> 2-4일 후, 배양 물에 직접적으로 10 μL / mL의 콜히친을 추가하고, 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 시간 동안 배양한다. </li><li> 매체 대기음 RT에서 10 분 동안 저장성 용액 (0.6 % 나트륨 시트 레이트 및 0.13 % 염화칼륨) 1 ㎖에 iPSCs 배양한다. </li><li> 5 % 아세트산 용액 1 ml의 세포를 씻어 메탄올 / 아세트산 용액과 iPSCs를 해결 (비율 3 : 1) 제어 온도 및 습도와 기계 (28 ° C, 42 % RH). </li><li> 담그고 어둠 속에서 실온에서 15 ~ 20 분 퀴나 크린 솔루션으로 얼룩 고정 셀 (30) (Q-밴딩을 얻었다). </li><li> 100X 배율 29, 형광 현미경으로 세포의 중기 획득. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
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<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

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과거에는 유일한 방법은 특정 유전자 돌연변이를 운반 인간 다 능성 줄기 세포를 수득하는 착상 전 유전자 진단을받은 부모 모집 및 그 폐기 31,32 포배에서 배아 줄기 세포를 생성하는 것이다. 프로그래밍 방식을 사용하여, 연구자들은 지금 거의 모든 유전자형을 들고 환자 iPSCs를 생성 할 수 있습니다. 가능성은 환자 맞춤형 세포 라인에서 시작하고 장애의 병태 생리 및 새로운 치료 방법의 후속 식별의 조사를 할 수 있기 때문에 쉽게 접근 할 수있는 소스는 매우 중요합니다. 본 연구에서, 우리는 이미 냉동 버피 코트 PBMNCs에서 이전에 밀도 구배 분리 22 후 냉동 PBMNCs에서 iPSCs 성공적으로 생성 된 바이러스 무료 iPSCs을 생산에 적용하는 방법으로 플라스미드 접근 (15) 결합. 대신에 밀도 구배 분리 PBMNCs 모든 버피 코트의 이용우리는 샘플을 처리하는 동안 운영 비용, 작업 시간 및 수동 단계를...

2006 년 신야 야마나카 하나의 그룹은 성인 쥐와 인간에서 체세포 네 프로그래밍 요소 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, 이소성 발현하여 능성 상태로 전환 될 수 있음을 최초로 입증 C-Myc와), 소위 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 2를 생성하는 단계를 포함한다. 특정 환자 iPSCs 밀접 형태, 증식 및 세 생식 세포 유형 (중배엽, 내배엽 및 외배엽)로 분화 할 수있는 능력의 관점에서 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 닮은 인간 배아 줄기 세포 및 바이 패싱의 용도에 관련된 윤리적 문제 부족한 반면 가능한 면역 거부 3. 따라서, iPSCs는 기초 연구, 약물 검사, 질병 모델링, 독성 평가, 재생 의학 목적으로 4 환자 맞춤형 세포의 가장 중요한 소스 중 하나로 나타납니다. 몇 가지 접근 방법은 IPSC 생성을 위해 사용되어왔다 : 바이러스 통합 벡터를(5 레트로 바이러스, 렌티 바이러스 6), 바이러스의 비 - 통합 벡터 (아데노 7), 센다이 바이러스 8 BAC 트랜스포존 9, 에피 솜 벡터 (10), (11) 단백질 또는 RNA 전달 12. 바이러스 - 매개 방법의 사용은 고효율 프로그래밍을 초래할 수 있지만, 바이러스 성 벡터는 숙주 세포에 따라서 전위 랜덤 삽입 성 돌연변이 유발의 게놈 내로 통합 분화 동안 유전자 발현, 및 침묵 유전자의 활성화의 영구 변형 (13)을 배제 할 수 없다. 재생 의학을위한 iPSCs 안전하게하려면 노력은 세포 게놈에 외래 DNA의 통합없이 iPSCs를 유도하기 위해 이루어졌다. excisable 트랜스포존 및 바이러스 벡터가 개발되었지만, 필연적 절제술 후 형질 도입 된 세포를 유지하고, 발현 벡터를 트랜스 짧은 시퀀스, 셀 변경을 유도 할 수 있는지에 여전히 불분명울라 (13)를 작동합니다. 높은 프로그래밍 효율에도 불구하고, 센다이 바이러스는 병진 연구에서 그 적용을 제한 할 가능성이있는 시스템을 개발 한 회사와 고가의 접근 및 도달 스루 라이센싱 문제를 나타낸다. 또한, 단백질 및 RNA의 직접적인 도입에 대한 필요성이 도입 본질적인 기술적 제한 분자를 재 프로그래밍의 다수의 전달을 필요로하고, 전체 프로그래밍 효율이 매우 낮다 (14). 참고로, 에피 솜 플라스미드의 사용을 기반으로 비용 효율적인 프리 - 바이러스 및 비 통합하는 방법이 성공적으로 피부 섬유 아세포 (15)의 재 프로그래밍을 위해보고 된 바있다. 이전에 10, 15를보고 구체적으로, 본 연구에서 우리는, 상용 가능한 통합없는 에피 솜 플라스미드를 사용하기로 결정했다. 지금까지의 피부 섬유 아세포는 가장 인기있는 도너 셀 타입 5를 나타낸다. 그러나, 다른 세포 소스 succes에왔다sfully 각질 (16), 골수 중간 엽 줄기 세포 (17), 지방 기질 세포 (18)를 포함 iPSCs로 재 프로그래밍, 머리는 19 여포, 치과 펄프 셀 (20). 이러한 세포의 분리는 수술 절차를 필요로하고, 여러 주들은 일차 세포 배양을 설정하기 위해 시험 관내 세포 확장을 위해 필요하다. 이러한 관점에서, 셀형의 개시 선택은 중요하며, 이는 혈액과 같은 쉽게 접근 덜 침습적 조직으로부터 iPSCs를 생성 할 수있는 것이 역시 중요하다. 두 제대혈 단핵구 (CBMNCs) (21, 22) 및 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs는) 14,22-24는 iPSCs의 유도를위한 세포의 적당한 공급원을 나타낸다. 성인 PBMNC 리 프로그래밍의 효율이 22 CBMNCs보다 20-50 배 낮지 만, 이들은 샘플링 목적을 위해 가장 편리한 셀형 남아있다. 에사실, PBMNC 샘플링은 최소 침습되는 장점을 가지며, 또한, 이들 세포는 재 프로그래밍 이전에 시험 관내 실험에서의 광범위한 확장을 필요로하지 않는다. 현재까지, 다른 프로토콜은 밀도 구배 분리 후 PBMNCs 냉동과 해동 일 몇 개월에 동결 후 iPSCs 22, 23로 재 프로그래밍하기 전에 며칠 동안 확장 될 수 있다고보고있다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 우리는보고는 냉동 버피 코트에서 PBMNCs의 재 프로그래밍을 설명하지 않은 알고있다. 중요한 것은 밀도 구배 분리없이 수집 냉동 버피 코트 따라서 상기 샘플 수집을 피할 IPSC 생산을위한 재료의 쉽게 액세스 풀을 나타내는 모집단 연구 대규모 바이오 뱅크에 저장된 가장 일반적인 혈액 샘플을 나타낸다. 여기서 우리는 이전에 설명 된 프로토콜 (22)에 기초하여, 인간 냉동 버피 코트로부터 처음 바이러스 프리 iPSCs의 발생을보고한다. 에또한, iPSCs이 아닌 밀도 구배 정제 PBMNC 결과를위한 제어 프로토콜로서, 밀도 구배 분리 후의 냉동 PBMNCs로부터 생성 하였다.

<table><tbody><tr><td>시트르산 나트륨 완충 Venosafe 플라스틱 튜브</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>암모듐 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0.5 M 용액</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>밀도 구배 원심분리를 위한 폴리수크로오스 용액</td></tr><tr><td>Iscove의 변형된 Dulbecco's medium(IMDM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>페놀이 없음</td></tr><tr><td>레드 햄의 F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민 (ITS -X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (재고 : 100X)</td></tr><tr><td>화학적으로 정의 된 지질 농축액</td><td>Gibco</td><td></td><td>11905031 1X (재고 : 100X)</td></tr> <tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L- 아스코르브 산 2- 인산 세스키 마그네슘 염 수화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1- 티오 글리세롤</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M6145</td><td>200 &micro에서의 최종 농도; M</td></tr><tr><td>재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF)</td> <td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml (재고 : 100 &micro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>재조합 인간 인터루킨-3 (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (재고: 10 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml (재고: 40 &마이크로; g/ml)</td></tr><tr><td>재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO)</td><td>R& D 시스템&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (재고: 50 U/ml)</td></tr><tr><td>덱사메타손&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2915</td><td>1 &mu; M (재고 : 1mM)</td></tr> <tr><td>인간 홀로 트랜스 페린</td><td>R & D 시스템&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &뮤; g/ml (재고: 20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>세포유전학 분석을 위한</td></tr><tr><td>배지 mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>배지 iPSC 피더 프리 배양을 위한</td></tr> 배지 <tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0.1 mM (재고: 50 mM)</td></tr><tr><td>나트륨 부티레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0.25 mM (재고: 0.5 M)</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF 기본, 145 aa&nbsp;</td><td>R& D 시스템&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (재고: 10 &마이크로; g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 & 마이크로; M (재고 : 10 mM)</td></tr> <tr><td>태아 정의 소 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1 % 젤라틴 용액</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 기저 막 매트릭스 성장 인자 감소</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg / ml (재고 : 10 mg / ml)</td></tr> <tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>세포 분리 솔루션</td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포(CF1)</td><td>글로벌 스템</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 cells/6 웰 플레이트</td></tr><tr><td>플라스미드 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 &마이크로; g (재고 : 1 &micro; g/&마이크로; l)</td></tr><tr><td>플라스미드 pCXLE-hSK</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &마이크로; g (재고 : 1 &micro; g/&마이크로; l)</td></tr> <tr><td>플라스미드 pCXLE-hUL</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 &마이크로; g (재고 : 1 &micro; g/&마이크로; l)</td></tr> <tr><td>플라스미드 pCXLE-EGFP</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &마이크로; g (재고 : 1 &micro; g/&마이크로; l)</td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 염색 키트</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) 항체</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 항체</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>MAB4360 1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 항체</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4381</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-Oct-3/4 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Nanog 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Troponin I 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Actinin (Sarcomeric) 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Neuronal Class III &szlig;-Tubulin (TUJ1) 항체</td><td>Covance 리서치 프로덕츠 Inc&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>안티-티로신 하이드록실라제 (TH) 항체</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 안티-토끼</td><td>분자 프로브</td><td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>초저 부착 세포 배양 6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Ambion</td><td>15596-018&nbsp;</td><td>RNA 추출용 시약</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 합성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>11754050</td><td>역전사 효소 키트</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Experion 자동 전기영동 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>RNA 무결성 검사를 위한 기기</td></tr><tr><td>Experion RNA Highsense 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>RNA 무결성을 확인하기 위한 시약 키트</td></tr><tr><td>해부 현미경(SteREO Discovery V12)</td> <td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>NeonTransfection System 100 &micro; l 키트</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>electroporation 용 시약 키트</td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Instrument for electroporation</td></tr><tr><td>NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Instrument for DNA/RNA quantification</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plasmid purification kit</td></tr></tbody></table>

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

체세포 네 개의 전사 인자 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, C-Myc와)의 발현을 강제력에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)으로 재 프로그램 될 수 있고, 전형적으로 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 표명 . 때문에 인간 배아 줄기 세포와의 유사성, iPSCs는 인간 배아 줄기 세포와 관련된 윤리적 문제를 방지, 잠재적 인 환자 맞춤형 재생 의학을위한 중요한 도구가되고있다. 임상 적용에 적합한 세포를 얻기 위해서, 트랜스 프리 iPSCs은 트랜스 활성화, 변화된 유전자 발현 및 분화 잘못을 피하기 위해 생성 될 필요가있다. 또한, 고효율 및 저가의 리 프로그래밍 방법은 치료 목적을 위해 충분한 iPSCs를 유도 할 필요가있다. 이러한 요구를 감안할 때, 효율적인 비 통합 에피 솜 플라스미드 방법은 IPSC 유도를위한 바람직한 선택이 될 것입니다. 현재 프로그래밍을 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포 유형이 섬유 아세포는, 분리가있는 난 조직 생검을 요구환자에 대한 nvasive 수술. 따라서, 인간 말초 혈액 IPSC 생성에 가장 접근하고 최소 침습 조직을 나타낸다. 이 연구에서, 비 통합 에피 솜 플라스미드를 이용하여 비용 효율적이고 바이러스가없는 프로토콜은 전혈을 원심 분리 한 후 밀도 구배 분리없이 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)로부터 iPSCs의 생성을 위해보고된다.

이 연구에서 전혈을 원심 분리 및 밀도 구배 분리가보고 후의 PBMNCs의 프로그래밍과 비교 후에 냉동 버피 코트로부터 분리 PBMNCs의 리 프로그래밍에 의해 바이러스가없는 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜.도 1a는의 개략도를 도시 자세한 프로토콜입니다. 해동 후, 통상 둥근 형상을 도시 절연 PBMNCs은, 14 일 동안 특정 혈액 배양 배지 (도 1b)에서 팽창 된 후 에피 솜 플라스미드로 형질. 10-15일 후 형질 전환, 정의 마진과 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 가진 작은 둥근 밝은 식민지 후 (그림 1C)을 표시하기 시작. 약 20~30일 형질 전환 후, IPSC 식민지는, 날카로운 가장자리, 매우 컴팩트하게 자신의 크기를 늘리고 따기 및 확장 (그림 1D)에 대한 준비가되어 있습니다. 첫 번째 계대 단계 (2-3 유로) 한 후,IPSC 콜로니는 미분화 상태를 유지하고, 전형...

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

이 절차의 전반적인 목표는 비용 효율적이고 바이러스가 없는 프로토콜을 사용하여 냉동 버피코트(buffy coats)에서 얻은 인간 말초혈액 단핵구(PB MNCs)로부터 유도만능줄기세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 없이 전혈 원심분리를 통해 버피코트에서 PB MNCs를 분리한 후, 특정 혈액 배양 배지에서 증식시켜 수행합니다. 두 번째 단계는 전기천공법을 통해 버피코트 유래 PB MNCs에 에피솜 플라스미드(episomal plasmids)를 형질전환시키는 것입니다.형질전환된 PB MNC를 신선한 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포 위에 플레이팅합니다. 마지막 단계는 배양물에서 유도만능줄기세포를 수동으로 피킹하여 확장을 위해 새로운 피더 세포 플레이트로 옮기는 것입니다. 최종적으로, PB MNC가 전형적인 인간 형태를 가진 유도만능줄기세포로 효율적으로 재프로그래밍되었음은 면역형광법과 유전자 발현 측정을 통해 확인할 수 있습니다.기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 냉동된 OT로부터 바이러스가 없는 IPC를 분화시킴으로써 시료 처리 과정 중 운영자의 비용, 작업 시간 및 수동 단계를 줄일 수 있다는 점입니다. 이 기술의 또 다른 장점은 인구 집단 연구를 통해 수집되어 대규모 바이오뱅크에 저장된 냉동 OT를 IPS 생산을 위한 원료로 사용할 수 있다는 것입니다. 먼저 소듐 시트레이트 완충액이 들어있는 플라스틱 튜브에 정맥 말초혈액 8 mL를 채취하는 것으로 시작합니다.혈액을 25 °C에서 보관하고 12시간 이내에 처리하십시오. 첫 번째 처리 단계는 혈액을 4 °C에서 2000 Gs로 15분 동안 원심분리하는 것입니다. 스윙 버킷 로터를 사용하고, 분리 과정에서 원심분리 브레이크를 적용하지 마십시오.혼탁한 버피 코트(buffy coat) 층을 수집합니다. 이는 상층의 혈장 층과 하층 사이의 층입니다. 버피 코트는 P-B-M-N-C가 농축된 분획으로, 8 mL 샘플 각각에서 약 500 µL를 취해 크라이오 바이알 튜브로 옮깁니다.이제 2x 동결 배지를 동일한 부피로 첨가하여 버피 코트(buffy coat)를 재현탁한 후, 제어 냉각 동결 용기를 사용하여 -80 °C에서 최대 1주일 동안 바이알을 동결합니다. 더 장기간 보관해야 하는 경우, 세포를 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 해동을 시작하려면, 동결된 버피 코트에서 얻은 1 mL의 PB MNCs 현탁액을 37 °C 항온수조에서 해동합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 2 mL로 희석합니다.다음으로, 희석액을 50 milliliter 튜브로 옮기고 red cell lysis buffer 10 milliliters를 추가합니다. 이 혼합물을 실온에서 약 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 멸균된 PBS를 사용하여 전체 부피를 50 milliliters로 맞춥니다.그런 다음 세포를 실온에서 300 Gs로 10분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 펠릿을 50 milliliters의 PBS로 세척합니다. 이제 세포를 다시 원심 분리하고 1 milliliter의 PBM and C medium에 재현탁합니다.재현탁된 세포의 일부를 취해 카운팅 챔버를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 그 후 밀도를 mL당 2 million cells로 조정합니다. 이제 부유 배양을 시작합니다.표준 12-웰 플레이트의 웰에 세포를 분주하고 48시간 동안 배양합니다. 이틀마다 배지를 교체하고, 피펫을 사용하여 세포를 흡입한 후 15 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 분주된 튜브를 상온에서 300 GS로 10분 동안 원심분리합니다.그 후 상층액을 버리고 1 mL의 신선한 P-B-M-N-C 배지에 세포를 재현탁합니다. PB MNC 배양 초기 며칠 동안은 적혈구 오염이 흔히 발생합니다. 세포를 새로운 배양 용기로 옮기기 전에 도립 현미경으로 세포 상태를 잘 확인하십시오. 세포 밀도가 약 80%에 도달하면 전배양 과정 중에 배양물을 분할하십시오.PB MNC 배양을 시작한 지 2주가 지나면 세포를 형질전환할 준비가 됩니다. T3, T4 및 P53에 대한 S-H-R-N-A를 포함하는 플라스미드 하나, SOX2와 KLF4를 포함하는 플라스미드 하나, LIN28과 lmic를 포함하는 플라스미드 하나, 그리고 EGFP를 포함하는 플라스미드 하나까지 총 4개의 플라스미드를 준비하십시오. 먼저 15 mL 원심분리관에 PB MNC를 수집하고, trypan blue를 사용하여 생존 세포 수를 측정하십시오.그런 다음 2 million 개의 생존 세포를 준비하여 원심 분리하고, 100 µL의 재현탁 완충액 T와 4종의 플라스미드를 각각 1 µg씩 포함하는 transfection mix에 세포를 재현탁합니다. 이제 transfection 용기에 3 mL의 전해질 완충액 E two를 채웁니다. transfection mix를 100 µL 팁으로 흡입하여 준비된 electroporation 튜브에 수직으로 분사합니다.그런 다음 3회 펄스를 가하여 세포를 전기천공합니다. 전기천공 후, 0.25 mM sodium butyrate가 포함된 2 mL의 예열된 PBM 및 C 배지에 세포를 다시 현탁합니다. 이전과 동일하게 생존 세포 수를 측정하고, 현탁액을 코팅되지 않은 6-well 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 플레이트를 완만한 교반 상태로 24시간 동안 배양합니다.형질전환된 세포를 형질전환 당일부터 3일 동안 분할 없이 유지합니다. 공배양을 구축하기 하루 전에 배지를 0.25 millimolar sodium butyrate가 포함된 신선하게 조제된 P-B-M-N-C 배지 2 milliliters로 교체하고, MES 1차 코팅을 준비합니다. 6-well plate의 각 웰에 basement membrane matrix 1 milliliter를 넣고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그 후 basement membrane matrix를 흡입하여 제거하고, 10% FBS가 포함된 DMEM 2 milliliters와 함께 MEF 200,000개를 각 웰에 분주합니다. 다음 날, 1 milliliter 팁으로 PB MNC를 수집합니다.세포를 15 milliliter 원심분리관으로 옮긴 후 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 2 milliliter의 신선한 배지에 다시 현탁합니다. 그런 다음 meth 코팅된 웰에 세포를 플레이팅하고 2일 동안 플레이트를 배양합니다.배지를 0.25 mM sodium butyrate가 포함된 iPSC 배지 2 mL로 교체하고, 이틀마다 iPSC 배지 교체를 계속합니다. 약 22~25일 후면 첫 iPSC 콜로니가 보이기 시작하며, 30~35일경에는 뚜렷하게 관찰될 것입니다. 콜로니는 iPSC 콜로니 플레이스를 12-웰 플레이트의 feeder cells 위로 패키징하기 전날에 피킹하여 재배양할 수 있는 상태가 되어야 합니다.웰 플레이트의 웰당 125,000개의 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, meth 세포의 배지를 1 mL의 보충된 IPSC 배지로 교체합니다. 그런 다음 해부 현미경 하에서 바늘을 사용하여 작은 덩어리를 형성하며 자란 큰 콜로니를 하나씩 채취합니다.피펫을 사용하여 개별적으로 옮기며, meth 코팅 플레이트의 각 웰에 콜로니를 하나씩 옮긴 후 플레이트를 배양하여 계대 배양합니다. iPSC 콜로니는 초기에는 동일한 피킹 기술을 사용하지만, 2~3회 계대 배양 후에는 효소 기반 절차를 사용합니다. 전형적인 둥근 모양을 보이는 분리된 PB MNCs를 특정 혈액 배양 배지에서 14일 동안 확장 배양한 후, 에피소말 플라스미드를 형질전환합니다. 형질전환 후 10~15일이 지나면, 명확한 경계와 배아줄기세포 유사 형태를 가진 작고 둥글며 밝은 콜로니가 형질전환 약 20~30일 후에 나타나기 시작합니다.뚜렷한 경계를 가진 매우 조밀한 iPSC 콜로니가 나타났으며, 초기 패키징 단계에서 피킹(pick)할 수 있을 만큼 충분한 크기가 될 때까지 성장했습니다. iPSC 콜로니는 미분화 상태를 유지했으며 전형적인 인간 배아 줄기세포의 형태를 보였습니다. 배율을 높이면 콜로니 내의 개별 세포들과 높은 핵 대 세포질 비율을 확인할 수 있습니다.선택된 IPSE 클론을 약 10~15회 더 계대 배양하였습니다. 여러 독립적인 배양액에서 약 20개의 중기(meta phase)를 수집하여 유전적 안정성을 분석하였습니다. 모든 샘플은 5~10회의 체외 확장을 거친 후에도 정상적인 핵형을 나타냈습니다.이 클론들의 줄기세포능(stemness)과 다능성(pluripotency)을 특성 분석하였습니다. 클론들은 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 염색에서 양성 반응을 보였습니다. 정량적 R-T-P-C-R을 통해 이 클론들이 초기 PB MNCs보다 훨씬 높은 수준으로 내인성 다능성 유전자들을 발현하고 있음을 확인하였습니다.내인성 cmic 및 KLA four의 수준은 거의 동일하게 유지되었으나, 외인성 에피솜 전이유전자의 발현은 IPCs에서 검출되지 않았으며, 이는 내인성 다능성 유전자가 성공적으로 활성화되었음을 나타냅니다. 마지막으로, 면역형광 분석 결과 IPCs가 OC three four, SSEA four, TRA 180 1, SOX two 및 TRA one 60과 같은 다능성 마커를 발현하는 것이 확인되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 비통합 에피솜 플라스미드를 사용하여 인간 말초혈액에서 분리한 ko로부터 비용 효율적인 방식으로 IPCs를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

현재 프로토콜은 제조사 지침에 따라 재프로그래밍이 어려운 환자 샘플의 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 유도 문제를 해결하는 절차를 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 버피 코트 샘플에 특이적이지만 정제된 PBMC 재프로그래밍에도 적용될 수 있습니다.

냉동 버피 코트 샘플에서 유도된 다능성 줄기세포주 재프로그래밍

여기에서는 피더 세포없이 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 환자 유래의 섬유 아세포와 같은 활막에서 인간 - 유도 된 다 능성 줄기 세포를 생성하기위한 프로토콜을 기술한다.

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

배우세요 냉동 버피 코트에서 분리한 말초혈액 단핵세포를 이용해 바이러스 프리 비통합 에피솜 플라스미드로 유도만능줄기세포를 생성하는 비용 효율적인 방법을. 면역형광 및 유전자 발현 분석으로 재프로그래밍 효율을 검증합니다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

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