Name: 만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정 생체 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 비장 세포에서 저선량 방사선에 의한 DNA 손상 및 복구를 측정하는 방법을. 흐름 세포 분석법을 활용하여 방사선 생물학 연구에 필수적인 정량적 분석 기술을 익히실 수 있습니다.

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저자는 프랑스 파리의 방사선 보호 및 원자력 안전 연구소(Institute of Radioprotection and Nuclear Safety)의 동료 Sandrine Roch-Lefevre와 Eric Gregoire의 기여에 감사를 표합니다. 이 작업은 캐나다 원자력 연구소(캐나다 온타리오주 초크 리버)의 캐나다 정부 과학 기술 프로그램, CANDU 소유자 그룹(캐나다 온타리오주 토론토), 캐나다 원자력 안전 위원회 및 방사선 보호 및 원자력 안전 연구소(프랑스 파리)의 지원을 받았습니다.

모든 마우스 처리 및 처리 절차는 로컬 동물 관리위원회에 의해 의회 및 / 또는 동물 보호 프로그램에 의해 규정 승인 규칙을 준수해야합니다. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 로컬 동물 관리위원회의 승인을 동물 관리에 캐나다위원회의 지침에 따라 수행되었다. 주의 : 방사능 모든 작업은 (포함하지만 방사성 동물 조직, 침구 폐기물 처리, 삼중 수소 처리, 외부 γ-조사에 국한되지 않음) 입법부 및 / 또는 방사선 방호 당국이 정한 규칙을 준수해야하며, 권한을 수행 할 공인 된 실험실 및 / 또는 시설에서 직원. 1. 동물 일 <ol><li> 동물 그룹화 <ol><li> 마우스 조직 외부로부터 도착하는 경우, 동물 시설에서 적어도 10 일 동안 동물들을 순응. 연구는 여러 치료 그룹을 포함하는 경우, 동물 공급자가 알을 보낼 수 있도록하나의 배치로 L 동물. </li><li> 무작위 그룹 당 10 쥐의 치료 그룹에 마우스를 할당합니다. C57BL / 6 변형의 수컷 마우스를 사용하는 경우, 침략 문제를 완화하기 위해 자신의 시설에 매우 젊은 C57BL / 6 남성의 무작위를 미리 준비 동물 공급 업체가 있습니다. </li></ol></li><li> 내부 β-방사선에 쥐의 만성 노출 <ol><li> HTO와 OBT 솔루션 (삼중 프롤린, 알라닌과 글리신 아미노산의 혼합물)의 원래 주식을 희석하여 마우스 마시는 물에서 작업 삼중 수소의 농도 (10 kBq / L과 1 MBq의 / L)를 준비합니다. </li><li> 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하여 마시는 물에 삼중 수소의 최종 농도를 확인합니다. 필요한 경우, 농도를 조정합니다. </li><li> 삼중 수소 물에 액세스 임의로를 제공하여 1 개월 동물을 취급합니다. 처리 물이 2 주 기간 동안 낮은 들어갔을 경우, 더 많은 물을 추가 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 2 주에서 병을 변경합니다. </li><li> 취급 가짜 조사 제어쥐 동일. 별도의 &quot;깨끗한&quot;방에서 또는 공중에서 삼중 수소 교차 오염을 방지하기 긍정적 인 공기 압력 아래에 별도의 &quot;깨끗한&quot;선반에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 외부 γ - 방사선에 쥐의 만성 노출 참고 : γ-조사 시설 / 장비 위치에 따라 달라집니다. </li><li> 선량의 가능한 방법을 사용하여 원하는 선량률 제조 방사선 필드가 γ-방사원으로부터의 거리를 결정한다. 동물 케이지를 덮고있는 지역 내 방사선 분야의 동질성을 확인합니다. 참고 : 1.7 μGy / h는 1 MBq의 / 몸에 L 삼중 수소에 의해 생성 된 선량률에 해당합니다. </li><li> 1 개월 단계 1.3.1에서 결정된 거리에서 마우스 케이지를 배치하여 쥐를 노출. 30 분에 γ-조사의 일상 중단을 최소화합니다. 총 흡수 선량을 측정하는 thermoluminescence의 선량계를 사용합니다. </li></ol> 2. 희생과 샘플링 <oL&gt; <li> 삽입 70 마이크론 셀 스트레이너, 15 ml의 1.5 ㎖의 튜브 멸균 수술 도구, 60mm 페트리 접시를 준비 모든 생물학적 안전 캐비넷 내에 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 장소 보충 RPMI 매체. 작품의 불임을 보장하는 것은 매우 중요하다. </li><li> 각 60mm 페트리 접시에 RPMI 배지 5 ㎖를 분배. </li><li> 지역 동물 보호위원회의 승인 방법을 사용하여 마우스를 희생. 경추 탈구는이 프로토콜에 설명 된 비장의 작업을위한 좋은 선택이 될 것입니다. (mFISH, 사이토 블록 소핵 또는 다른 일반적인 genetoxicity 분석에 대한 예를 들어,) 다른 분석을위한 혈액 샘플이 필요한 경우, 이소 플루 란으로 마취 후 내 심장 천자를 사용합니다. </li><li> 머리는 멀리 가리키는, 지느러미 드러 누움에서 동물을 놓습니다. 70 % 에탄올로 마우스를 분무. 집게를 사용하여 요도 개구부에 전방으로 피부를 잡아 회음부에 가위로 작은 절개를합니다. <oL&gt; <li> 이 절개에서, 단지 아래의 근육 벽을 피부를 잘라하지에주의하면서 흉강으로 복부 정중선을 따라 절단. 거리 중앙선으로부터 피부를 해부. </li><li> 집게로 복부 벽을 잡고 복강을 열어 근육 벽의 중앙 축을 따라 잘라. </li></ol></li><li> 가볍게 동시에 가위로 결합 조직을 잘라내는 동안 당겨 부드럽게 멸균 집게와 함께 파지하여 비장을 절제. </li><li> 1.5 ML 튜브에 비장 (비장의 약 1/10)과 장소의 작은 조각을 잘라. 스냅 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 다음 저장을 위해 액체 질소에 동결. </li><li> 사전 분배 RPMI 미디어의 5 mL를 60mm 페트리 접시 안에 셀 스트레이너에 비장의 나머지를 놓습니다. </li><li> 다음 마우스로 진행합니다. 참고 : 추출 된 비장은 매체와 60mm 요리에 보관 될 수있는 마우스의 나머지 sacrific 동안 (최대 2 시간 동안)에디션. 도 5 및 15 생쥐 간, 참가 인원수에 따라 하루에 처리 될 수있다. </li></ol> 비장 세포 배양 3. 준비 <ol><li> 곡선 끝 멸균 집게로 셀 스트레이너 내부 닦지하여 비장 균질화. </li><li> 셀 스트레이너를 제거하고 15 ML 튜브에 60mm 접시에서 필터링 된 세포 현탁액을 수집합니다. </li><li> 셀들의 나머지를 수집하기 위해 미디어의 5 ml의 셀 스트레이너 린스. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. </li><li> 가만히 따르다 뜨는 및 RPMI 10ml에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. </li><li> 가만히 따르다 뜨는 및 RPMI 5 ml의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 25 ㎖의 조직 배양 플라스크에 넣고 세포 현탁액 4 ㎖에 및 CO 2 인큐베이터에 제거 (37 ° C, 5 % CO 2, 80 % 습도) </li></ol> 4. 조사 도전 고정 <ol><li> 이동4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 얼음과 원심 분리기에 1.5 ML 튜브로 단계 3.8에서 세포 현탁액 1 ml의 나머지. 이 샘플에서 측정 된 DNA 손상은 DNA 복구 곡선의 건설을위한 모두 치료에 의한 손상 및 T = 0 데이터 포인트를 나타냅니다. </li><li> 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS 완충액 (20 mM 트리스 pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을) 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS의 300 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 낮은 속도로 소용돌이에 혼합하는 동안, -20 ° C 100 % 에탄올 700 μL를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 혼합 몇 번 반전. </li><li> -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 에탄올 고정 된 비장 세포 γH2AX 신호에 띄는 손실없이 최소 12 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 도전 γ-RAD와 단계 3.8에서 비장의 문화를 조사<html> 가능한 조사 장치를 이용 선량률 ≥ 200 mGy의 / 분의 2 Gy의 iation 도즈. 참고 :이 조사의 목적은 수리 기계에 도전하는 DNA DSB을 유도하는 것입니다. X 선은 또한이 목적을 위해 사용될 수있다. </li><li> 즉시 CO 2 배양기에 문화를 반환합니다. </li><li> 1 시간 도전 2 Gy를 조사 후, 생물 안전 캐비닛에 인큐베이터에서 문화를 제거합니다. 대표 샘플 나누어지는를 수집하려면, 부드럽게 얼음에 1.5 ML 튜브에 피펫과 세포 현탁액의 전송 1 ml의를 사용하여 세포를 다시 일시 중지합니다. CO 2 배양기에 세포 배양을 돌려줍니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 진공 펌프를 이용하여 상등액을 흡인. 부드럽게 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. </li><li> 반복 4.3 단계 - 4.5. </li><li> 24 시간 도전 2 Gy의의 γ-조사, 수확 후 단계 4.8에 설명 된대로 24 시간 샘플 =에 수정 - 4.10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. 안티 γH2AX 항체와 면역 형광 라벨링 참고 : 일반적으로 15 - 하루에 30 샘플 immunofluorescently 표시된 단일 실행에 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. 처리 군 간의 정확한 비교를 보장하기 위해, 각 그룹의 샘플 (S)을 포함한다. 또한 자세한 내용은 (16)을 참조하십시오. <ol><li> 얼음에 표시된 샘플 수에 대한 튜브 세트를 처리 할 장소를 준비합니다. 12 X 75mm 상한선 유리 튜브를 사용합니다. 불임은이 일을 위해 필요하지 않습니다. ( &quot;2 Ab의 전용&quot;) 만 차 항체와 라벨링에 대한 하나의 추가 역사적 제어 샘플을 포함합니다. 연구 내에서 실행 세포 계측법 모든 흐름이 역사적 제어 샘플을 사용합니다. </li><li> 각각의 튜브에 얼음처럼 차가운 TBS의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 5 초 동안 -20 ℃, 소용돌이에서 고정 된 비장 세포를 제거하고 TBS로 준비 튜브에 0.5 ml의 나누어지는을 전송합니다. -20 ° C 저장에 다시 샘플의 나머지를 놓고백업 샘플로 유지한다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 비장 세포. 상등액을 경사 분리하고 부드럽게 1 % FBS를 함유하는 빙냉 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시 </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. TST 완충액 (TBS의 0.05 % 트리톤 X-100, 2 % FBS)의 1 ml의 펠릿을 다시 일시 부드럽게 상등액을 가만히 따르다. 얼음에 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. 뜨는을 가만히 따르다 부드럽게 1 차 희석 방지 γH2AX 항체 200 μL에 펠렛을 다시 일시 : TST 버퍼 (150). &quot;2 Ab의 전용&quot;제어 샘플 TST 200 μl를 사용합니다. </li><li> (45)의 각도로 회전하는 통에 위치 튜브 - 60 °와 실온에서 300 XG에 1.5 시간 동안 흔들어. </li><li> TST 버퍼 200 희석 튜브 배양하는 동안 1 알렉사 488로 접합 된 염소 항 - 마우스 이차 항체의 충분한 용적 (200 μL / 시료)을 제조 하였다. 참고 : 알렉사-488를 포함한 모든 작업을복합 항체 (5.10 이하 5.16 단계를) 어두운 조명 조건에서 수행해야하며, 표시된 샘플은 알루미늄 호일에 튜브를 포장하여 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 1.5 시간 인큐베이션이 완료되면, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG 각 원심 관에 2 % FBS를 함유하는 빙냉 TBS 1 ㎖를 추가한다. 2 % FBS가 포함 된 TBS의 1 ml의 펠렛을 다시 중단 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 단계 5.8에서 차 항체 용액 200 μL에 펠렛을 다시 중단 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 단계 5.7에서와 같이 1 시간 동안 진탕 플랫폼에서 샘플을 품어. </li><li> 1 % FBS를 포함하는 얼음처럼 차가운 TBS의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 상등액을 경사 분리하고 부드럽게 빙냉 TBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다 부드럽게 50 μg의 / ㎖를 포함하는 TBS의 0.5 ml의 펠렛을 다시 중단요오드화 프로피 듐. </li><li> 빛으로부터 보호 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> 악기 고유의 프로토콜 16을 사용하여 흐름 cytometer에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 샘플 당 최소 10,000 세포를 읽어보십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 알려진 경쟁 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

이 논문에 제시된 프로토콜은 전리 방사선 등 다양한 화학적, 물리적 에이전트의 낮은 수준의 유전 독성 효과를 조사 생체 내 연구에 대규모 마우스를 수행하는 데 유용합니다. 우리 고유의 무균 동물 시설은 GammaBeam 150 조사 장치를 장착하고 30 미터 길이의 조사 홀은 수백 또는 마우스의 수천에 낮거나 매우 낮은 선량률 조사되어 관련된 평생 연구를 수행 할 수 있습니다. 만성 저용량 조사를위한 작은 조사 시설은 방사선 생물학 연구가 정기적으로 실시하고 방사선 보호 지침 / 규정이 구현 된 대학 또는 병원 환경에서 설정할 수 있습니다. 그러나, 규제 강화는 일반적으로 삼중 수소 등의 방사성 핵종의 처리가 수행되는 내부 동물 조사를 위해 설계 시설에 적용됩니다. 드문 있지만, 이러한 내부 방사선 노출 연구 인증 실험실은 다양한 재에 존재검색 기관 세계적 그들의 고유 한 기능이 프로토콜에 설명 된 연구에 사용될 수있다. 프로토콜 내에서, 우리는 정확하게 실험...

(매스 미디어에 의해 악화) 방사선 히로시마와 나가사키 원자 폭탄의 희귀 원자력 발전소 사고의 이미지에 의해 구동 방사선 대중의 공포를, 이온화​​ 낮거나 매우 낮은 용량 중 하나의 잠재적 인 해로운 영향에 비해 상당한 논쟁에 주도하고있다 매우 엄격한 방사선 방호 규제와 잠재적으로 과학적으로 정당하지 않은 기준. 지난 30 년에, 다수의 보고서는 유해의 부족과 낮은 선량 방사선 1-4에 의한 잠재적으로 유익한 생물 효과의 존재를 모두 기록했다. 주요 방사선 건강 위험 요인은 방사선의 높은 또는 중간 용량을 수신 원자 폭탄 생존자의 역학 연구에 기초하여 추정 암의 확률이다. (그래서 선형 노 임계 값 또는 LNT 모델 호출되지) 이러한 데이터의 선형 외삽은 낮은 용량에서 암의 위험을 추정하는 데 사용됩니다. 그러나,이 접근법은 세계적 과학 수용을받지 못한무겁게 5를 논의한다. 그것은 더 연구가이 문제를 명확히하고 아마도 방사선 보호 기준을 개선하는 데 필요한 것이 명백하다. 이러한 연구는 DNA 손상 비율, DNA 수리 및 돌연변이 유발 등과 같은 엔드 포인트 (인간에 효과를 외삽을 위해 최선을) 생체 내 동물 모델에서 만성 치료 (환경 적, 직업적 노출의 가장 근사치)를 포함한다. 그것은 DNA가 돌연변이와 암 개발 (6)으로 이어질 수 방사선 효과와 불완전하거나 잘못된 수리 손상의 기본 목표 것으로 알려져있다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 DNA 병변의 가장 해로운 유형 중 하나이며, 세포 사멸 및 종양 7 발생할 수 있습니다. 이는, 따라서, 중요한 확실하고 정확하게 저용량 방사선 및 / 또는 화학 물질과 같은 다른 오염물 스트레스에 노출 된 후 DSB의 수준을 측정 할 수 있어야한다. 가장 민감하고 특이 마커의 한DNA DSB의 γH2AX 8라는 인산화 히스톤 H2AX이며, 또 다른 마커 및 방법은 9,10 제안되었다. 그것은 H2AX 분자 수천, 유도 DSB의 근방에, 안티 γH2AX 항체 및 형광 현미경 (11)에 의한 면역 형광 라벨링 개별 DSB의 검출을 가능 γH2AX의 형성에 관여하는 것으로 추정된다. 반응은 최소 30 내지 60의 최대 도달 매우 빠르다. 증거 γH2AX 나누기의 사이트에 다른 수리 요소를 유치 및 깨진 DNA의 끝을 고정하고 (12에서 검토) 다른 수리 단백질에 대한 액세스를 제공하기 위해 크로 마틴 구조를 수정하여 DNA DSB의 수리를 용이하게하는 것이 존재한다. DNA DSB의 수리가 완료되면, γH2AX은 인산화 해제 및 / 또는 저하를 거쳐, 새로 합성 H2AX 분자는 크로 마틴 (10)의 영향을받는 지역에 γH2AX 교체됩니다. γH2AX의 형성과 손실을 모니터링 할 수 있습니다,따라서, DNA 복구 DSB 동력학의 정확한 추정치를 제공한다. 이 방법은 방사선 감수성 13-15과 상관하는 것으로 나타났다 방사선 및 그 잔류 율 및 DSB 레벨 고용량 조사 다양한 인간 종양 세포주에서 DSB 수리를 연구하기 위해 사용되었다. 우리는이 실험적인 접근 방식을 수정 DNA DSB 수준 및 수리 (그림 1)에 만성 γ-와 β-조사의 낮은 용량의 영향을 조사하기위한 생체 내 마우스 연구에 적용했다. 첫째, 우리는 마시는 물에 용해 β-방사선 삼중 물 (HTO)의 형태로 하나의 삼중 수소에 의해 방출 (수소 3) 또는 유기적으로 결합 된 삼중 수소 (OBT) 마우스의 장기 만성 노출을 수행하는 방법을 보여 . 두 형태의 축적 및 / 또는 다른 신체에 따라서 분배, 상이한 생물학적 효과를 생성 할 것으로 예상된다. 두 형태의 원자력 산업에 잠재적 인 위험이 있습니다. 이 치료상대적인 생물학적 효능의 평가를 위해 중요하다 방사선 두 종류의 정확한 비교를 할 수 있도록 상응하는 투여 율 γ-만성 방사선에 노출 병행된다. 베타 방사선 γ 방사선, 고 에너지 광자에서 매우 상이한하게 전자 구성된다. 이 때문에 차이로 Β-방사선은 주로 내부 건강 위험을 나타내며, γ-방사선을 비교하여 서로 다른 생물학적 효과를 생성 할 수있다. 이 합병증은 β-방사선에 HTO에 의해 방출을 노출의 규제에 비해 상당한 논쟁의 결과. 따라서, 공공 식수에 HTO의 규제 수준은 유럽에서 100 BQ / L에서 호주에서 75,000 BQ / L로 변화한다. 또한 γ-방사선의 선량 당량 HTO의 생물학적 효과를 비교하는 것이 중요하다. 둘째, DNA DSB의 속도는 immunofluorescently 감지 γH2AX 표시하여 만성 노출의 완료에 고립 된 비장 세포에서 측정유동 세포 계측법에 의해 에드. 이는 생체 내 노출에 의해 가해진 DNA 손상의 정도를 평가할 수있다. 그러나, 이러한 낮은 수준의 노출이 DNA 중 어느 DSB 검출 속도를 얻지 못할 수 있다는 기대 분별이고; 대신, 숨겨진 변경 / 응답은 DNA 손상을 복구하는 세포의 능력에 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다. 이러한 변화는, 발견하는 경우가 될 수도 있고 자극 (해로운 효과를 생산) (유익한 효과를 생산) 또는 억제. 제안 된 프로토콜은 손상의 상당한 양의 생산 방사선의 고용량으로 추출 비장 도전하여 그러한 변경을 드러내는 허용 (예를 들어, 2 Gy의 약 50 셀당 DNA DSB 또는 3의 제조 -. 총 γH2AX 레벨의 5 배 증가) . 그 후, DSB 수리의 시작과 완료를 반영 형성과 γH2AX의 손실, 유동 세포 계측법에 의해 감시된다. 이러한 방식으로, 기저 및 DNA DSB의 치료 - 유도 수준뿐만 아니라 측정 될 수 있지만,또한 세포의 기능에 미치는 잠재적 인 효과가 응답하고 수리 DNA 손상이 훨씬 더 높은 스트레스 수준에 의해 유도.

<table><tbody><tr><td>HTO: 삼중화수, [3H]</td><td>원자로에서 국부적으로 획득&nbsp;</td><td></td><td>재고 활성도 3.7 GBq/mL;&nbsp; Perkin Elmer의 HTO로 대체 가능</td></tr><tr><td>OBT: 알라닌, L-[3-3H]: 유기 결합 삼중수소(OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml(185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: 글리신, [2-3H]: 유기 결합 삼중수소</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml(185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: 프롤린, L-[2,3-3H]: 유기 결합 삼중수소(OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>삼중수, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>현지 원산지 HTO를 대체합니다&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>현지에서 제조</td>된 <td>GammaBeam 150</td><td>irradiator Atomic Energy of Canada Limited</td><td>는 충분히 낮은 활성의 다른 g-방사선 소스로 대체될 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anti-gH2AX 항체, 클론 JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse 항체</td><td>Life Technologies (이전 Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>상업용 알코올</td><td>P006-EAAN</td><td>500 ml 병 앱솔루트 에탄올</td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td><td>마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>린데</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75mm 뚜껑이 없는 유리관</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>일회용 붕규산 유리관(일반 끝이 있는</td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue 배양 25ml 플라스크(공급업체 번호 156340)</td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Wagner 가위 12cm 날카롭고 날카로운</td></tr><tr><td>집게, 스트레이트</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>셈켄 집게 13cm, 직선</td></tr><tr><td>집게, 곡선</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>좁은 패턴 집게 12cm, 곡선</td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD 팔콘 조직 배양 접시 60 x 15mm</td></tr><tr><td>세포 여과기, 70mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>팔콘 세포 여과기 50 / 케이스</td></tr><tr><td>PBS 레시피: 탈이온수 200ml에 1정을 녹이고 필요한 경우 pH를 7.4로 조정합니다.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>인산염 완충 식염수 정제</td></tr><tr><td>TBS 레시피: 10x 재고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30g TRIS HCl</td><td>만들기 시그마 Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma 염산염</td></tr><tr><td>88g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>염화나트륨</td></tr><tr><td>2g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>염화</td></tr><tr><td>칼륨탈이온수 1L에 녹이고 pH를 7.4</td><td></td><td></td><td></td>로 조정합니다.</tr></tbody></table>

만성 후 마우스 비장 세포에서 dna 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

저용량 방사선 노출은 높은 방사선 량에 의해 생성 효과에서 수량과 품질이 상이한 생물학적 효과의 다양성을 생성 할 수있다. 적절한 과학적으로 정당화 방식으로, 환경 산업 및 공중 보건 안전과 관련된 질문을 해결하는 것은 크게 정확하게 방사선 및 화학 물질을 이온화 낮은 복용량 오염 물질의 생물학적 효과를 측정 할 수있는 능력에 의존한다. DNA 손상 및 수리로 인해 암과 같은 잠재적 인 장기 결과에 건강 위험의 가장 중요한 초기 지표입니다. 여기에서 우리는 마우스의 비장 세포에서 DNA 손상 수리 및 γ-와 β-방사선의 낮은 복용량에 생체 노출 만성의 효과를 연구 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. DNA 이중 가닥 나누기 일반적으로 받아 들여지는 마커를 사용하여, γH2AX라는 인산화 히스톤 H2AX, 우리는 DNA 손상뿐만 아니라 레벨을 평가하는 데 사용될 수있는 방법을 설명하지만,도 변화DNA 복구 능력에 잠재적으로 생체 내 노출의 저용량에 의해 생산. 많은 수의 샘플에 표지 immunofluorescently γH2AX의 빠르고 정확하고 신뢰성있게 측정 계측법 흐른다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리는 (DNA 수리를 트리거 쉬는 충분한 수를 생성하기 위해 2 Gy의의 도전 량 추출 비장 세포를 노출시킴으로써 및 유도 (1 시간 조사 후) 잔류 DNA 손상을 측정함으로써, 24 시간을 평가할 수있다 사후 조사). 잔류 DNA 손상은 불완전한 복구 및 장기 게놈 불안정성과 암의 위험을 나타내는 것이다. 용이하게 생체 내 연구 (예를 들면, 염색체 수차 골수 망상 적혈구의 소핵 주파수, 유전자 발현, 등) 등으로 측정 할 수있는 다른 분석 및 종점과 결합하여,이 방법은 생물학적 효과의 정확한 상황 평가할 수있다 낮은 수준의 스트레스.

비장 예상 그래프 여기서 설명한 방법을 이용하여 제조 계측법도 2는 플로우의 예를 나타낸다. 세포가 처음 &lt;전자 볼륨 측 분산&gt; 산점도를 기반으로 문이된다 (그림 2A 및 2D, 전자 볼륨 앞으로 분산에 해당). FL3 / 프로피 디움 요오드 히스토그램 (도 2B 및 2E)는 정상 세포주기 분포를 확인한다. FL1 채널을 이용하여 계산 γH2AX 신호를 말은 미처리 대조군 (도 2c)에 비해 세포 (도 2F)에 2 Gy를 조사에서 DNA DSB에서&gt; 2 배의 증가를 확인한다. 다음으로, 우리는 immunofluorescently 마우스 비장 세포 유세포 γH2AX 표지 측정 한 방법의 민감도를 조사 하였다.도 3a는 마우스 비장 세포에서 γH2AX 수준 DNA DSB 지시...

유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

다음 실험의 전반적인 목표는 저선량의 베타 또는 감마 방사선에 만성적으로 체내 노출되었을 때 마우스 비장 세포에서 유도되는 DNA 손상 및 복구를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스에 내부 베타 또는 외부 감마선을 조사하여 DNA 손상 및 복구의 잠재적 변화를 유도합니다. 두 번째 단계로, PLE 세포를 분리한 후 감마선 고선량 조사를 통해 검출 가능한 수준의 DNA 손상을 유도함으로써 DNA 복구 과정을 모니터링합니다.시간이 지난 후, DNA 손상을 정량화하기 위해 비장 세포를 $\gamma\text{H2AX}$에 대해 형광 면역 표지합니다. 궁극적으로 $10\text{ cGy}$와 같이 낮은 급성 감마선 조사량으로 인해 발생한 DNA 손상을 유세포 분석법으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 직업적, 의료적 또는 공공 환경에서 일반적으로 접하는 저선량 방사선이 암과 같은 해로운 건강 영향의 확률을 실제로 증가시키는지와 같은 방사선 방호 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.면역형광 현미경을 이용한 $\gamma$H2AX 포커스 계산과 같은 기존 방법과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은 분석 시간이 훨씬 적게 소요되어 대규모 동물 연구에 적합하며, $\gamma$H2AX 정량 분석 시 작업자 관련 편향을 줄일 수 있다는 점입니다. 이 기술의 활용 가능성은 맞춤 의학 및 암 방사선 치료까지 확장되며, 말초 혈액 림프구를 사용하여 개별 환자의 방사선 민감도를 결정함으로써 환자의 방사선 치료 용량 regimens을 조정할 수 있습니다. 이 방법은 방사선 독성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 환경 화학 오염 물질의 독성 조사나 생체 내(in vivo) 마우스의 DNA 손상 형성 및 복구의 근본적인 메커니즘 연구와 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다.내부 베타 조사를 위해서는, 외부 감마 조사를 위한 대조군과 마찬가지로 동물들이 삼중수소수를 자유롭게 섭취(ad libitum)할 수 있도록 한 달 동안 처리합니다. 마우스가 들어있는 케이지 전체를 감마선원으로부터 적절한 거리에 배치하여 삼중수소 노출 시의 선량률과 일치시킵니다. 조사를 시작하고 한 달 동안 유지합니다.노출 종료 시 총 흡수 선량을 측정하기 위해 열형광선량계(thermoluminescence dosimeters)를 사용하십시오. 비장 수집 당일, 동물마다 작은 빈 페트리 접시에 셀 스트레이너(cell strainer)를 하나씩

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

방사선에 대한 피부 반응의 정량적 광학 바이오마커를 제공하는 확산 광학 분광법(DOS) 접근법을 제시합니다. DOS 기기 설계, 광학 매개변수 추출 알고리즘 및 방사선 유발 홍반의 전임상 마우스 모델에서 대표 데이터를 생성하는 데 필요한 동물 취급 절차에 대해 설명합니다.

마우스 모델을 사용하여 급성 이온화 방사선 유발 피부 독성의 정량적 평가를위한 광학 분광학 확산

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

이 프로토콜은 생쥐에서 자외선 B 노출의 전신 및 국소 피부 영향에 대한 연구를 설명합니다.

자외선 B 방사선에 대한 마우스의 만성 노출 연구 

배우세요 마우스 비장 세포에서 저선량 방사선에 의한 DNA 손상 및 복구를 측정하는 방법을. 흐름 세포 분석법을 활용하여 방사선 생물학 연구에 필수적인 정량적 분석 기술을 익히실 수 있습니다.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정

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