만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정 생체 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 저선량의 베타 또는 감마선에 대한 만성 생체 내 노출에 의해 마우스 비장 세포에서 유도된 DNA 손상 및 복구를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 마우스를 내부 베타 또는 외부 감마선 조사에 노출시켜 DNA 손상 및 복구의 잠재적인 변화를 유발함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, PLE cyte를 분리하고 높은 도전적인 선량의 감마선으로 방사선을 조사하여 검출 가능한 DNA 손상을 유도하여 DNA 복구를 모니터링할 수 있습니다.

시간이 지남에 따라 비장 세포는 DNA 손상의 정량화를 허용하기 위해 감마 H, 2 A x에 대해 형광 면역 표지됩니다. 궁극적으로 섭씨 10도의 급성 감마선으로 인한 DNA 손상은 유세포 분석으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 직업, 의료 또는 공공 환경에서 일반적으로 접하는 저선량의 방사선이 실제로 암과 같은 건강에 해로운 영향을 미칠 가능성을 증가시키는지와 같은 무선 보호 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

면역형광 현미경 검사를 사용하여 감마 H 두 개의 A X 병소를 계수하는 것과 같은 기존 방법에 비해 당사 기술의 주요 장점은 당사의 기술이 분석에 훨씬 적은 시간을 필요로 하여 대규모 동물 연구에 적합하고 감마 H 두 개의 A X 정량화에서 작업자 관련 편향을 줄인다는 것입니다. 이 기술의 의미는 암의 약물 및 방사선 요법의 개인화로 확장되며, 환자의 방사선 요법 선량 요법을 조정하기 위해 말초 혈액 림프구를 사용하여 개별 환자의 무선 감도를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 방사선의 독성에 대한 통찰력을 제공하지만 환경 화학 오염 물질의 독성 조사 또는 생체 내 마우스에서 DNA 손상 형성 및 복구의 기본 메커니즘을 조사하는 것과 같은 다른 연구에도 적용할 수 있습니다.

내부 베타 방사선 조사의 경우, 외부 감마선 조사를 위해 삼중수소 물에 대한 AD libitum 접근으로 한 달 동안 동물을 치료합니다. 전체 생쥐 케이지를 삼중수소 노출의 선량률과 일치하도록 감마선 소스에서 적절한 거리에 배치합니다. 한 달 동안 노출을 시작하고 유지합니다.

열발광 선량계를 사용하여 노출 종료 시 총 흡수량을 측정합니다. 비장 채취 당일, 동물 한 마리당 하나의 작은 빈 페트리 접시 안에 세포 여과기를 놓고 각 접시에 5ml의 RPMI 배지를 추가합니다. 다음으로, 안락사된 쥐를 누운 자세로 놓고 동물이 완전히 젖었을 때 머리카락에 70% 에탄올을 뿌립니다.

집게를 사용하여 요도 입구 앞쪽의 피부를 잡고 이 절개 부위에서 회음부를 작게 절개합니다. 복부 정중선을 따라 흉강까지 자르고 아래 근육벽이 아닌 피부만 자르도록 주의하십시오. 정중선에서 피부를 절개합니다.

그런 다음 집게로 복벽을 잡습니다. 복강을 열기 위해 근육의 중앙 접근을 따라 자릅니다. 비장을 찾아 멸균 집게로 가볍게 잡습니다.

그런 다음 조직을 부드럽게 당기는 동시에 결합 조직을 욕합니다. 다운스트림 분석을 위해 비장의 약 10분의 1을 제거합니다. 그런 다음 모든 비장을 채취한 후 최대 2시간 동안 나머지 조직을 세포 여과기 중 하나로 옮깁니다.

멸균 곡선 겸자를 사용하여 개별 세포 여과기 내의 각 조직을 다지십시오. 비장이 충분히 균질화되면 스트레이너를 제거하고 여과된 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 각 스트레이너를 추가로 5ml의 배지로 헹구고, 나머지 세포 현탁액으로 세척제를 당기고, 세포를 Resus를 두 번 원심분리하여 첫 번째 회전 후 각각 10ml의 신선한 RPMI에 펠릿을 현탁시킵니다.

두 번째 스핀 다음. 펠릿을 5ml의 RPMI에 다시 현탁시키고 생성된 세포 현탁액 4ml를 25ml 조직 배양 플라스크로 옮겨 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 80% 습도에서 배양합니다. 나머지 세포 현탁액을 섭씨 4도의 새로운 1.5ml 튜브와 원심분리 전지로 옮깁니다.

진공 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 1ml의 TBS 완충액에 부드럽게 재현탁시키고 supinate를 다시 진공 청소기로 청소한 후 세포를 다시 스핀다운시킵니다. Reese는 펠릿을 각각 300마이크로리터의 TBS에 현탁시킵니다. 그런 다음 저속으로 와류를 치는 동안 섭씨 영하 20도의 700마이크로리터에서 각 튜브에 100% 에탄올을 주입합니다.

튜브를 몇 번 뒤집어 더 섞습니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 20도에서 최대 12개월 동안 보관하십시오. 수리 기계에 도전하기 위해 DNA 이중 가닥 절단을 유도합니다.

분당 200 미니 그라 이하의 선량 속도로 2 개의 회색 감마선을 가진 조사기 scy 배양. 챌린지 직후 배양물을 CO2 인큐베이터로 되돌립니다. 1시간 후, 방사선 조사된 배양액을 생물학적 안전 작업대로 옮기고 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

생성된 세포 현탁액 1ml를 얼음 위의 1.5ml 튜브로 옮긴 다음 세포를 스핀다운합니다. 진공 펌프를 사용하여 supinate를 조심스럽게 흡입한 다음 펠릿을 TBS 1ml에 부드럽게 매달아 놓습니다. 그런 다음 두 번째 TBS 세척 후 세포의 면역 형광 분석을 위해 섭씨 영하 20도의 보관을 위해 방금 설명한 대로 세포를 에탄올에 고정합니다.

먼저 0.5ml의 얼음처럼 차가운 TBS를 적절한 샘플 튜브에 추가합니다. 다음 소용돌이 분취액 Eloqua, 섭씨 영하 20도의 고정된 값은 SPL 세포를 5초 동안 저장했습니다. 그런 다음 0.5 ml의 세포를 적절한 튜브로 옮기고 1% FBS와 원심 세포를 포함하는 1 ml의 얼음처럼 차가운 TBS에 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다.

다시 한 번, 얼음 위에서 튜브당 1ml의 TST 완충액에 샘플을 20분 동안 배양합니다. 세포를 스핀 다운 한 후, 다시, 펠릿을 200 마이크로 리터의 1 차 반 감마 H 2 축 항체에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 45-60도 각도로 회전하는 셰이커에 튜브를 300배 G에서 1.5시간 동안 놓고 배양이 끝날 때 실온에서 놓습니다.

2%FBS가 함유된 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 TBS로 샘플을 두 번 세척합니다. 그런 다음 진탕 플랫폼에서 새로 준비된 2차 항체 200마이크로리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 1시간 후 1%FBS가 함유된 TBS라는 얼음 1ml로 세포를 씻은 다음 TBS라고 하는 얼음 1ml로 TBS만 씻습니다.

마지막으로 PROPIDIUM iodide를 함유한 0.5 ml의 TBS에 펠릿을 재현탁시킵니다.이 그래프에서는 대표적인 유세포 분석 결과가 표시됩니다. 세포는 전자 부피 측면을 기반으로 먼저 게이트되었습니다. 산란 프로피듐 요오드 염색을 통해 대조군 샘플과 방사선 챌린지 샘플이 모두 정상적인 세포 주기 분포를 나타냈음을 확인했습니다. 감마 H 2축 신호의 측정은 여기에서 처리되지 않은 대조군에 비해 방사선 조사된 두 개의 회색 세포 내에서 DNA 이중 가닥 파괴가 2배 이상 증가한 것으로 나타났지만, 저선량 또는 고선량의 감마선에 대한 생체 외 노출 1시간 후 마우스 세포의 상대적인 감마 H 2 AX 수준은 예상대로 나타났습니다.

이중 가닥 절단의 강력한 3배 유도가 두 개의 회색 챌린지 후에 감지되었습니다. 0.1 회색에 노출된 후 약간이지만 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었으며, 이는 방법의 충분한 민감도를 나타냅니다. 현미경 검사로 관찰된 형광의 표시된 초점과 유사한 패턴은 신호가 CH 염색질 내의 개별 DNA 이중 가닥 절단에서 발생한다는 것을 나타내며 염색의 특이성을 검증합니다.

여기서, 한 달간의 삼중수에 노출된 마우스에서 수확한 PLE 세포에 의해 나타나는 DNA 이중 가닥 절단의 수준이 표시됩니다. 이 치료로 기저 감마 H two A X 수치가 10% 증가했지만, 그 변화는 통계적으로 유의하지 않았습니다. 또한, 측정된 감마 H 2축의 형성 및 손실에는 차이가 없습니다.

DNA의 동역학을 나타내는 챌린지 후, 삼중화 수처리 마우스와 대조군 사이에서 이중 가닥 브레이크 수리가 관찰되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 지역 방사선 방호 협회에서 제정한 규칙과 규정을 준수하고 내부 및 외부 방사선 소스를 모두 사용하여 대규모 마우스 프로젝트를 수행할 수 있는 인증된 실험실 또는 시설을 활용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 일단 숙달되면 이러한 기술은 제대로 수행되면 10마리의 마우스당 약 1일 반만 완료하면 됩니다.

이 동영상을 시청한 후에는 Gamma H two A X 발현의 유세포 분석을 사용하여 저선량의 삼중수소 또는 감마선 노출로 인해 생체 내에서 유도된 DNA Doublet strand break 및 repair를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차 외에도 혈액 림프구의 M FISH, 골수 MICRONUCLEUS 분석 및 스트레스 반응 유전자의 발현을 측정하기 위한 R-T-Q-P-C-R과 같은 다른 방법을 수행하여 저선량 방사선 노출과 관련된 건강 위험을 평가할 수 있습니다.