배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

다음 실험의 전반적인 목표는 제브라보(zebra bow) 클론 세포 분석을 통해 연골세포의 상호 배치 및 확장을 시각화하는 것입니다. 이는 두개안면 연골과 배아에서 조직 특이적 재조합을 달성하여 클론 분석을 수행하기 위해 SOX 10 ERT2 Cree 제브라보 M 라인을 구축함으로써 이루어집니다. 다음으로, 재조합 과정을 유도하기 위해 10-somite 단계의 배아에 타목시펜(tamoxifen)을 3시간 동안 처리합니다.

그런 다음 CRE 활성 및 강한 적색 형광 또는 RFP 발현이 나타나는 배아를 선택하고, C 두개안면 연골 이미징을 위해 배아를 고정합니다. 결과는 공초점 이미징을 기반으로 한 두개안면 연골세포의 다중 스펙트럼 세포 분석을 보여줍니다. S 청색 염색이나 so 및 GFP 또는 SOX 및 kde와 같은 형질전환 라인과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, zebra bow를 통해 기관 형성에 관여하는 클론 세포 집단을 특이적으로 관찰하고 추적할 수 있다는 점입니다.

1일차 배아 수집을 준비하기 위해, 오후 5시에서 6시 사이에 sox, 10 ERT two Cree zebra bow M 형질전환 제브라피쉬 암수 쌍을 분할 산란 탱크에 배치합니다. 다음 날, 광학 현미경으로 배아가 10-세포 단계에 도달했는지 확인한 후, RFP 필터가 장착된 형광 현미경으로 관찰합니다. 밝은 붉은색의 배아를 분리하여 Cree 재조합을 유도하기 위해 신선한 E3 배지가 담긴 새 페트리 접시로 옮깁니다. 페트리 접시에 10 µM 하이드록시 타목시펜 용액을 첨가하고 배아를 28.5 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

그 다음 Tamoxifen 용액을 생물학적 폐기물 용기에 따라 버리고, 배아를 하룻밤 동안 배양하여 28~29 somite 단계가 된 후 E3로 배아를 여러 번 세척하십시오. 배아를 E3 PTU 용액으로 옮긴 후 다시 배양기에 넣으십시오. 완전히 발달한 두개안면 구조를 시각화하려면, 망막에서 강한 붉은색 신호와 노란색 Cree 발현이 나타나는 4 DPF 배아를 선택하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 Tricaine으로 배아를 마취시킨 후, 깨끗한 공초점 슬라이드 위의 Methylcellulose 한 방울이 담긴 페트리 접시에 배아를 옮기십시오.

신선한 Methylcellulose 한 방울을 떨어뜨리고, 마이크로 로더 팁을 사용하여 배아의 등쪽이 위로 향하도록 배치한 다음 25 by 25 커버슬립으로 덮습니다. 이때 배아에 직접 닿지 않도록 주의하십시오. 커버슬립으로 배아를 덮고, 필요한 경우 커버슬립을 이용하여 배아의 위치를 조정합니다. 배아를 촬영하려면 20 x 건식 렌즈 대물렌즈를 사용하십시오.

피사체에 초점을 맞추려면 현미경의 L 100 버튼을 누른 다음, 공초점 설정 버튼을 선택하십시오. auto를 클릭하고 채널 1에는 CFP, 채널 2에는 GFP, 채널 3에는 RFP 또는 M cherry를 선택하십시오. 그런 다음 창을 닫으십시오.

인터록 해제 버튼을 클릭하기 전에 2번 및 3번 채널을 켭니다. 그런 다음 재생 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 설정을 조정한 후, 원하는 이미지를 캡처하고 공초점 소프트웨어 형식과 채널별 이미지 프로세싱을 위한 TIF 형식으로 각각 저장합니다.

CFP 이미징을 수행하려면 초점 영역을 변경하지 않은 상태에서 채널 2와 3을 끄고 채널 1을 켭니다. 이미지를 캡처하기 전에 스캔 설정을 다시 조정하고, 앞서 설명한 대로 이미지를 저장하며, 여기에서 보여주는 pan 및 동료들의 설명에 따라 이미지 처리를 수행합니다. 전체 마운트 알시안 블루 염색을 통한 전통적인 연골 시각화는 발달 중인 메켈 연골을 관찰하는 데 매우 유용하며, 시간 경과에 따른 발달 중인 연골세포의 계보 추적을 추가로 분석하기 위해 최종 세포 조직을 시각화하는 데 흔히 사용됩니다.

SOX 10 kda 형질전환 라인을 사용하여 제브라피쉬 bow M 형질전환 라인의 생체 이미징을 통해 살아있는 배아 내 세포 이동과 수렴 및 신장(convergence and extension)을 연구해 왔습니다. C 두개안면 골격 구조 내 연골세포의 조직화를 추가로 연구하면, 메켈 연골(meckel's cartilage)의 신장과 성장을 매개하는 연골세포의 상호 배열(inter collation) 및 신장 과정을 알 수 있습니다. 이 그림은 3DPF에서 5DPF 사이의 UI 제브라피쉬 bow M Sox 10 ERT two Cree 형질전환 배아의 하악골을 보여줍니다.

하악골은 여기에서 보여주는 것과 같이 메켈 연골(meckel's cartilage)의 세포 조직을 명확하게 관찰하기 위해 복측에서 촬영하는 것이 가장 좋습니다. 안정적으로 유지되고 유전되는 색상을 통해 계보 추적과 두개 신경능 세포의 운명 지도를 쉽게 작성할 수 있습니다. 단일한 파란색 세포가 주변 세포들 사이로 이동 및 보간된 후, 전후축을 따라 길어지면서 균일한 형태의 연골 부위를 형성하며, 이를 통해 전방으로 확장되는 메켈 연골의 전체적인 형태를 유지합니다.

이 기술은 고양이 발달 분야의 연구자들이 제브라피쉬 골격 형성 과정에서 연골을 조사할 수 있는 길을 열어줍니다.