2015년 10월 21일
두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서 영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.
다음 실험의 전반적인 목표는 얼룩말 활 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 간 대조 및 확장을 시각화하는 것입니다. 이는 SOX 10 ERT two Cree zebra bow M 라인을 생성하여 클론 분석을 위한 두개골 안면 연골 및 배아의 조직 특이적 재조합을 달성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 배아에 10에서 타목시펜으로 펄스를 박동하여 진드기 단계를 3시간 동안 진행하여 재조합 과정을 유도합니다.
그런 다음 CRE 활성과 강한 적색 형광 또는 RFP 발현을 위해 배아를 선택하고 C 두개안면 연골의 이미징을 위해 배아를 장착합니다. 결과는 컨포칼 이미징을 기반으로 두개골 안면 연골 세포의 다중 스펙트럼 세포 분석을 보여줍니다. 파란색 염색의 S와 같은 기존 방법이나 so, GFP 또는 SOX 및 kde와 같은 형질전환 라인에 비해 이 기술의 주요 장점은 얼룩말 활을 사용하면 장기 형성에 관여하는 클론 세포 집단을 구체적으로 관찰하고 추적할 수 있다는 것입니다.
첫날 배아 채취를 준비하기 위해, RFP 필터가 있는 형광 현미경으로 배아가 10 셀룰라이트 단계에 도달했음을 광학 현미경으로 확인한 후 다음 날 오후 5시에서 6:00 사이에 분할된 짝짓기 탱크에 여러 쌍의 수컷과 암컷 sox, 10 ERT 두 마리의 Cree 얼룩말 활 M 형질전환 얼룩말 물고기를 설정합니다. 밝은 빨간색 배아를 분리하고 신선한 E 3 배지가 있는 새로운 페트리 접시로 옮겨 크리어 재조합을 유도합니다. 페트리 접시에 10마이크로몰의 하이드록시 타목시펜 용액을 넣고 섭씨 28.5도에서 3시간 동안 배아를 배양합니다.
그런 다음 Tamoxifen 용액을 생물학적 폐기물 용기에 넣고 E 3을 사용하여 배아를 하룻밤 동안 배아를 28-29로 배아를 배양한 후 배아를 여러 번 세척하므로 진드기 단계에서 배아를 E 3 PTU 용액으로 옮기고 인큐베이터로 되돌립니다. 완전히 발달된 C 두개안면 구조를 시각화하려면 망막에서 강렬한 빨간색 신호와 노란색 Cree 발현이 있는 4개의 DPF에서 배아를 선택합니다. Trica에서 배아를 마취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 깨끗한 컨포칼 슬라이드에서 메틸셀룰로오스 한 방울이 들어 있는 페트리 접시에 배아를 옮깁니다.
신선한 메틸셀룰로오스 한 방울을 떨어뜨리고 마이크로 로더 팁을 사용하여 배아를 등쪽에 장착하면서 25 x 25 커버 슬립으로 배아를 직접 만지지 않도록 주의합니다. 배아를 덮고 필요한 경우 커버 슬립을 사용하여 배아를 조작합니다. 배아를 이미지화하려면 20 x dry lens objective를 사용합니다.
피사체에 초점을 맞추려면 현미경의 L 100 버튼을 누른 다음 컨포칼 설정 버튼을 선택합니다. 자동을 클릭하고 채널 1에 대해 CFP를 선택하고, 채널 2에 대해 GFP를 선택하고, 채널 3에 대해 RFP 또는 M 체리를 선택합니다. 그런 다음 창을 닫습니다.
인터록 제거 버튼을 클릭하기 전에 채널 2와 3을 켭니다. 그런 다음 재생을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 설정을 조정한 후 원하는 이미지를 캡처하고 채널별 이미지 처리를 위해 컨포칼 소프트웨어 형식과 TIF 형식으로 저장합니다.
CFP 이미징을 수행하려면 초점 영역을 변경하지 않고 채널 2와 3을 끄고 채널 1을 켭니다. 이미지를 캡처하기 전에 스캔 설정을 다시 조정하고, 방금 설명한 대로 이미지를 저장하고, 여기에 표시된 대로 pan과 동료의 설명에 따라 이미지 처리를 수행합니다. 샨산 전체 블루 염색에 의한 전통적인 연골 시각화는 발달하는 메켈 연골을 관찰하는 데 매우 유용했으며, 시간 경과에 따른 연골 세포 형성을 추가로 분석하기 위해 최종 세포 조직을 시각화하는 데 일반적으로 사용됩니다.
SOX 10 kda 형질전환 세포주를 사용하여 얼룩말 bow m 형질전환 세포주의 실시간 이미징을 사용하여 살아있는 배아의 세포 이동 및 수렴 및 확장을 연구하는 데 사용되었습니다. 더 나아가 C 두개안면 골격 구조에서 연골 세포의 조직을 연구하면 메켈 연골의 확장과 성장을 매개하는 연골 세포 간 대조 및 신장 과정이 밝혀졌습니다. 이 그림은 UI 얼룩말 활 M Sox 10 ERT의 아래턱을 보여주며, 3D PF와 수정 후 5일 사이에 두 개의 Cree 형질전환 배아를 보여줍니다.
아래턱은 여기에서 볼 수 있듯이 연골 연골의 세포 조직을 명확하게 볼 수 있도록 복부 방향으로 가장 잘 그려집니다. 안정적으로 유지되고 유전되는 색상은 계통 추적이 용이하고 두개골 신경 능선 세포 운명 매핑이 가능합니다. 단일 청색 세포는 인접한 세포와 함께 이동하고 보간하는 것으로 보이며, 그 다음 전방 후방 축을 따라 연장되어 균일한 모양의 연골 부위를 형성하여 전방으로 확장될 때 멜레스 연골의 전체 모양을 유지합니다.
이 기술은 고양이 발달 분야의 연구자가 제브라피시 골격 형성에서 콘드로를 조사할 수 있는 길을 열어줍니다.
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이 연구는 Zebrabow 형질전환 물고기를 사용하여 젤리피쉬의 두개안면 연골에서 연골세포의 교대와 확장을 시각화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 기관 형성 중 동적인 세포 행동을 직접 관찰할 수 있게 합니다.
Understanding chondrocyte organization in craniofacial cartilage provides mechanistic insights into mandible morphogenesis, informing target validation for craniofacial disorders. The Zebrabow clonal analysis approach enables direct visualization of cellular behaviors driving tissue extension, supporting predictive confidence in preclinical models of mandibular development. This mechanistic de-risking value aids in prioritizing therapeutic hypotheses related to skeletal patterning and growth.
The Zebrabow clonal analysis method integrates into early discovery workflows by providing direct readouts of chondrocyte intercalation and elongation, informing target validation and lead identification stages.