분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화
December 19th, 2016
혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 특별한 장비를 사용하지 않고 간단한 방법을 사용하여 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 것입니다. 내피 세포를 분리하는 데 사용되는 다른 방법은 대부분 대동맥이 아닌 심장이나 폐에 적용됩니다. 대동맥에 대한 이 기술은 상당히 높은 수율과 높은 세포 생존율을 제공하며 특별한 장비나 기술이 필요하지 않습니다.
그것들은 녹아웃 또는 쥐를 수행하여 일차 내피 세포의 연구에 적용되는 반면, 마우스는 대부분의 질병 모델에서 왔습니다. 이 프로토콜은 매우 유용하고 연습하기 쉽습니다. 하루를 시작할 때 이 프로토콜을 시작하십시오.
생쥐를 마취하고 반사 작용 부족을 확인한 후 쥐를 수술 패드에 눕히고 그 위에 가열 램프를 올려 체온을 유지합니다. 그런 다음 복부에 70% 에탄올을 뿌려 소독합니다. 그런 다음 해부 가위로 정중선을 따라 복부를 열어 복부 대동맥을 노출시킵니다.
그런 다음 흉강을 열어 심장과 폐를 노출시킵니다. 이제 대동맥의 중심선을 따라 절개하여 쥐에서 혈액을 방출합니다. 그런 다음 좌심실에 헤파린 1000 단위와 PBS 1 밀리리터를 주입하여 대동맥을 관류합니다.
관류 후 방해 기관을 옆으로 밀어내고 흉부 대동맥을 빠르게 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다. 층류 공기 흐름 후드 아래에서 얼음처럼 차가운 PBS로 대동맥을 부드럽게 세척하여 25게이지 바늘과 주사기를 사용하여 남아 있는 혈액을 제거합니다. 그런 다음 현미해부 겸자를 사용하여 부착된 지방 조직과 측혈관을 가능한 한 많이 제거합니다.
심정지와 대동맥 분절이 기질에 파종되는 시점 사이의 시간은 내피의 생존력에 매우 중요합니다. 따라서 동맥 주위 지방 조직과 결합 조직을 제거하는 동시에 대동맥 스트레칭을 피하고 이 단계에 소요되는 시간도 제한해야 합니다. 많아야 15분입니다.
그런 다음 청소된 대동맥을 내피 성장 배지로 옮기고 메스로 대동맥을 1mm 고리로 자릅니다. 하나의 대동맥은 최대 10개의 고리를 생성합니다. 그런 다음 현저해부 가위로 각 링을 엽니다.
시작하려면 6웰 플레이트를 얼음 위에 놓고 기포를 쏟아내지 않고 1ml의 매트릭스 용액으로 코팅합니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 20분 동안 옮겨 매트릭스가 응고되도록 합니다. 일단 응고되면, 대동맥 조각은 내강 쪽이 아래로 향하게 하여 매트릭스에 놓일 수 있습니다.
내피를 건드리지 마십시오. 각 웰에 3-4개의 세그먼트를 배치합니다. 그런 다음 세그먼트가 젖지 않도록 충분한 성장 배지를 세그먼트에 붓습니다.
그런 다음 약 4-6시간 동안 5% 이산화탄소가 있는 인큐베이터로 옮깁니다. 하루가 끝나면 세그먼트가 포함되도록 더 많은 매체를 추가하십시오. 앞으로 며칠 동안 대동맥 분절이 주기적으로 싹을 틔울 것입니다.
매일 위상차 현미경으로 싹이 트는 것을 모니터링하십시오. 동시에 매체의 레벨을 조정합니다. 넷째 날에는 배지를 조심스럽게 제거하고 대동맥 분절을 부드럽게 제거합니다.
매트릭스에서 자라는 세포를 방해하지 마십시오. 그런 다음 매트릭스의 내피 세포에 2ml의 신선한 배지를 추가하고 2-3일 동안 배양을 계속합니다. 기질에서 대동맥 분절을 제거하는 타이밍은 내피 세포의 순도에 매우 중요합니다.
튜브 네트워크가 발달하기 전에 분절을 제거해야 하며, 그렇지 않으면 세포가 섬유아세포 또는 평활근 세포로 오염됩니다. 먼저 0.1%젤라틴이 함유된 T12.5 플라스크를 준비하고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 데운 PBS로 매트릭스 플레이트를 조심스럽게 세척한 다음 각 웰에 100단위의 중성 프로테아제를 추가하고 가끔 흔들면서 플랫폼 로커에서 실온에서 플레이트를 배양합니다.
위상차 하에서 세포가 분리된 것처럼 보이면 각 웰에 2밀리리터의 d-Val을 추가하여 반응을 종료합니다. 웰을 검사한 다음 15ml 튜브에 상등액을 수집합니다. 그런 다음 튜브를 900gs에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 4ml의 배지에 다시 현탁시킵니다.
준비된 플라스크에 현탁액을 플레이트화하고 2시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 교체하고 세포가 85-90% 융합될 때까지 3-4일 동안 배양을 계속합니다. 세포가 준비되면 이전과 같이 세포를 배양할 수 있도록 T12.5 플라스크를 두 개 더 준비합니다.
그런 다음 데운 PBS로 세포를 세척하고 약 50ml의 트립신-EDTA를 사용하여 배양 후 1분 이내에 대부분을 분리합니다. 다음으로, 2밀리리터의 미디어로 이 반응을 종료합니다. 이제 피펫을 통해 현탁액을 여러 번 흐르게 하고 15ml 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 900gs에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 4밀리리터의 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 준비된 두 플라스크 사이에 현탁액을 나누고 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 교체하고 이전과 같이 세포를 포화 상태로 계속 성장시킵니다.
이러한 통로를 2-3회 정도 거친 후 세포를 특성화합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 배양 2일 후 마우스 대동맥 분절에서 자발적 내피 세포 발아가 관찰되었습니다. 4일 후, 수많은 내피 세포가 분절에서 멀어졌고, 새로 형성된 새싹은 분절과 가지에서 계속 확장되었습니다.
이 세포를 배양하고 한 번 전달한 후, 세포는 방추 모양이고 조약돌과 같은 모양이었습니다. 그런 다음 부착된 세포를 Dil-ac-LDL 및 Ulex Lectin으로 한 시간 동안 라벨링했습니다. 핵도 염색되었습니다.
대부분의 세포는 Dil-ac-LDL 흡수 및 Ulex 결합에 대해 이중 양성이었습니다. 두 번째 통과 후, 세포의 95% 이상이 혈소판 내피 세포 접착 분자 1에 대해 양성이었습니다. 이 세포는 VEGFR2, VE-Cadherin 및 eNOS에 대해서도 양성이었습니다.
또한, 세포는 평활근 마커인 칼포닌에 대해 대부분 음성이었습니다. 이 프로토콜은 표적 분자의 내피 특이적 활성을 연구할 수 있는 좋은 기회를 제공하며 녹아웃 및 형질전환 마우스 모델에서 수행할 수 있어 심혈관 연구 분야에서 매우 유용합니다.
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개요
이 기사는 특별한 장비 없이 마우스 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 높은 세포 생존율을 보장하도록 설계되었으며, 내피 세포의 생리병리학 연구에 특히 유용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심혈관 질환
- 내피 세포 생물학
- 세포 분리 기술
배경
- 내피 세포는 심혈관 건강 및 질환에 중요합니다.
- 내피 세포를 분리하는 전통적인 방법은 종종 심장이나 폐에 초점을 맞춥니다.
- 이 연구는 대동맥에 대한 새로운 접근법을 소개합니다.
- 높은 효율과 생존율은 효과적인 연구에 필수적입니다.
연구 목적
- 내피 세포 분리를 위한 간단한 프로토콜을 제공합니다.
- 내피 세포 생리병리학에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 특수 장비 없이 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 마우스 대동맥에서 내피 세포의 분리.
- 분리된 세포의 통제된 환경에서의 확장.
- 세포 생존율과 수율의 평가.
- 다양한 질병 모델에서 프로토콜의 적용.
주요 결과
- 이 방법은 전통적인 기술에 비해 더 많은 수의 생존 내피 세포를 제공합니다.
- 세포는 추가 실험을 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.
- 프로토콜은 사용하기 쉽고 특별한 교육이 필요하지 않습니다.
- 내피 세포 연구의 다양한 연구에 적용 가능합니다.
결론
- 이 프로토콜은 내피 세포 분리를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 심혈관 질환 연구를 크게 발전시킬 수 있습니다.
- 사용 편의성은 다양한 연구 환경에서 접근하기 쉽게 만듭니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolating primary endothelial cells from the mouse aorta enables mechanistic de-risking of cardiovascular targets by providing a disease-relevant system for target validation. This method supports assay development and phenotypic screening by yielding high-viability cells without specialized equipment, reducing technical barriers in early discovery. The approach facilitates translational biomarker studies and preclinical model generation, improving predictive confidence in lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-specific molecular mechanisms in cardiovascular physiopathology.
- Operational Value: Provides a reproducible primary cell source for target engagement and pathway clarification studies.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets through Dil-ac-LDL uptake, lectin binding, and CD31 staining assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized endothelial cell monolayers for quantitative assay readouts.
- Operational Value: Yields high-purity cells (>95% CD31+ after second passage) suitable for high-throughput screening.
- Scientific Value: Enables assessment of angiogenic sprouting and tube formation as functional endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant studies in knockout and transgenic mouse models.
- Operational Value: Allows expansion to second/third passages for consistent in vitro and in vivo experimentation.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic studies of VEGFR2, VE-Cadherin, and eNOS signaling pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing validated endothelial cells for target validation, progressing to assay development and screening applications, and supporting translational continuity into preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of endothelial targets through isolation of physiologically relevant primary cells.
- Screening: Delivers standardized, reproducible cell preparations for compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Provides quantitative outputs including sprouting kinetics, marker expression, and functional uptake assays.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation via passage-expanded cells suitable for in vivo studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, equipment-free platform for repeated use across cardiovascular projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through endothelial-specific phenotypic confirmation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined isolation and passaging protocol.
- Strategic Value: Reduced biological risk in lead selection by confirming target engagement in primary human-relevant cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets using validated cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and aseptic tissue handling.
- Needs access to laminar flow hood, incubator, and phase contrast microscopy.
- Demands standardization of aortic ring preparation and seeding timing.
- Requires optimization for different mouse strains and genetic backgrounds.
- Limited by the 15-minute window from cardiac arrest to matrix seeding for endothelial viability.
