체외 HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 만성 HIV 감염 환경에서 말라리아에 대한 선천성 면역 반응을 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 HIV 양성 및 감염되지 않은 상태에서 얻은 말초 혈액 단핵 세포인 두 번째 단계로 인간 적혈구에서 살아있는 P 거짓 파룸 기생충을 배양함으로써 달성됩니다. 기증자는 말라리아 기생충에 감염된 적혈구와 함께 배양됩니다.

궁극적으로 유세포 분석은 HIV에 감염된 사람의 선천성 면역 세포 사이토카인 활성을 감염되지 않은 대조군과 비교하여 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 동시 감염 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. HIV와 같은 한 가지 감염의 존재가 말라리아와 같은 두 번째 감염의 면역 반응에 어떤 영향을 미치는지와 마찬가지로 기생충을 동기화하려면 기생충 배양을 중단하고 트로포조이트를 실온에서 섭씨 37도의 알라닌 용액 19권으로 펠릿에 넣는다 15분 후 RPMI 0의 세포를 두 번 스핀다운합니다.

두 번째 세척 후 R-P-M-I-A에서 헤마토크릿을 3%로 조정합니다. 그런 다음 플라스크를 가스로 주입하고 영양 동물이 5-10 % parsit에 도달 할 때까지 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌려 샘플의 parsit를 계산합니다. 혈액층에서 10마이크로리터 샘플을 유리 슬라이드에 분배하고 혈액이 건조된 후 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 혈액의 박막을 만듭니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 HEMA 3가지 염색 키트를 사용하여 슬라이드를 염색합니다. 감염된 적혈구의 총 수를 계산합니다. 광학 현미경으로 300개의 세포를 계수하고 짙은 자주색으로 염색된 기생된 적혈구의 수를 연한 분홍색의 감염되지 않은 세포의 수와 비교하여 헤마토크릿을 측정합니다.

혈액 세포 분석기를 사용하여 기생충 배양 밀리리터당 적혈구 수를 측정합니다. 그런 다음 기생충 배양을 다시 스핀다운하고 세포를 R-P-M-I-S 플러스에서 밀리리터당 6개의 기생된 적혈구에 6배 10으로 재현탁시켜 HIV 양성 또는 HIV 음성 기증자로부터 얻은 인간 PBMC 희석 혈액 샘플을 동일한 부피의 차가운 DPBS로 분리합니다. 다음으로 15 밀리리터의 실온에서 Fial을 각각 50 밀리리터 튜브에 넣습니다.

25ml의 혈액 DPBS 용액을 주입한 다음 최대 25ml의 혈액 및 DPBS 용액을 조심스럽게 층을 이룹니다. 멸균 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 원심분리로 세포를 분리한 다음 멸균 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 계면에서 PBMC를 수집합니다. 최대 20mL의 PBMC 부분 표본을 개별 50mL 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 멸균 콜드 DPBS로 각 튜브의 총 부피를 최대 50ml까지 가져옵니다. 이제 셀을 다시 회전시키고 최종 세척 후 두 번 더 세척하기 위해 50ml의 신선한 멸균 DPBS에 펠릿을 현탁시킵니다. Reus는 카운팅을 위해 10 밀리리터의 R-P-M-I-S plus에 세포를 현탁시킨 다음 PBMC를 R-P-M-I-S plus의 밀리리터당 6개 세포에 10 곱하기 10의 최종 농도로 조정하여 동시 감염을 설정합니다.

배양은 24 웰 플레이트에 100 마이크로 리터의 R-P-M-I-S 플러스에서 갓 분리 된 HIV 양성 및 HIV 음성 PBMC를 1 번 10에서 6으로 파종하여 시작합니다. 각 우물의 총 부피를 최대 500 마이크로 리터로 가져오고 400 마이크로 리터의 R-P-M-I-S 플러스 3 배 및 우물 당 총 부피 500 마이크로 리터로, 6 개의 감염되지 않은 적혈구 중 3 배 10 개 또는 6 개의 기생 된 적혈구 중 3 배 10을 HIV 감염 및 HIV 감염되지 않은 세포에 가져옵니다. 동시 감염 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.

그런 다음 적절한 실험 기간이 지난 후 세포를 펠렛화하고 각각에서 700마이크로리터의 배양 상등액을 수집합니다. 상등액을 잘 원심 분리하여 파편을 제거한 다음 적절하게 샘플을 분취합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 나중에 분석할 수 있도록 섭씨 영하 20도 이하에서 동결합니다.

세포 특이적 사이토카인 생산 분석 6-8시간 전. 샘플을 펠덴당 1000D의 1마이크로리터로 처리하고, 배양 종료 시 웰당 샘플을 처리합니다. 접시를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.

그런 다음 멸균 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 세포를 제거하고 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이제 세포를 스핀다운하고 펠릿을 500마이크로리터의 유세포 분석 버퍼에 재현탁합니다. 각 샘플에 전체 항체 염색을 위한 튜브가 하나 이상 있도록 세포를 분할합니다.

형광 마이너스 1 대조군 항체 염색을 위한 하나의 튜브에는 염색되지 않은 단일 유세포 분석 대조군도 포함됩니다. 그런 다음 전체 항체 염색 및 형광 마이너스 1 대조 세포를 50마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 사전 적정 농도의 플루오로로 표시합니다. 4개의 접합 항체를 섭씨 4도에서 원하는 세포 표면 마커에 연결하고 20분 후에 빛으로부터 보호했습니다.

1ml의 유세포 분석 버퍼와 100μl의 cyto fixed cyto perm 용액으로 샘플을 각 튜브에 세척합니다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 20분 후 1ml의 투과 세척 버퍼로 세포를 세척하고, 세포를 스핀다운하고, 100마이크로리터의 투과 세척 버퍼에 펠릿을 현탁시키고, 전체 항체에 원하는 관심 세포 내 마커에 fluoro four conjugated antibody의 사전 적정 농도를 추가합니다. 염색 샘플.

모든 튜브를 빛으로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브당 1ml의 투과 세척 버퍼로 샘플을 세척합니다. 마지막으로 300 마이크로 리터의 저세포 분석 완충액에 펠릿을 고정하고 15 분 동안 1 % 파라 폼 알데히드를 보충하여 유세포 분석에 의한 분석 전에 HIV를 중화시킵니다.이 그래프에서는 기생화 된 적혈구에 노출되거나 감염되지 않은 적혈구를 대조하는 HIV 양성 및 HIV 음성 개인의 자연 살해 T 세포에서 인터페론 감마 생성 수준이 표시됩니다.

HIV 양성 PBMC에서 관찰된 말랄 감염에 대한 억제된 선천성 면역 반응은 HIV 음성 개인에서 PBMC가 보여준 강력한 사이토카인 생성과 비교하여 기생된 적혈구가 있을 때 인터페론 감마 생성이 부족한 것으로 입증되었습니다. 따라서 HIV와 함께 일하는 것은 매우 위험하며 이러한 프로토콜을 수행하는 동안 레벨 2 생물 안전 캐비닛의 모든 단계를 수행하고, 적절한 안전 장비를 착용하고, 유리로 된 날카로운 물체와 흡입기의 사용을 피하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.