Name: 형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 배우세요 형광 생체막 포스 프로브 기법으로 단일 T 림프구에서 수용체-리간드 결합 속도론과 칼슘 신호를 동시에 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 면역학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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이 논문과 관련된 연구와 Zhu 실험실의 fBFP 기술 개발은 NIH 보조금 AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 및 TW008753의 지원을 받았습니다. 이 강력한 실험 도구를 발명한 Evan Evans와 BFP를 구축하는 데 도움을 준 Evans 연구소의 구성원인 Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, Ken Halvorsen에게 감사드립니다. 또한 기기 개발에 도움을 주신 다른 Zhu lab 구성원인 Fang Kong, Chenghao Ge 및 Kaitao Li에게도 감사드립니다.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
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성공적인 fBFP 실험은 몇 가지 중요한 고려 사항을 수반한다. 힘의 계산이 신뢰할 수있는 위해 첫째, 마이크로 피펫, RBC, 프로브 비드가 가능한 동축에 가깝게 정렬되어야합니다. RBC 및 피펫 사이의 마찰을 무시할 수 있도록 피펫 내부 RBC의 투영 약 1 프로브 피펫 직경이어야한다. 전형적인 사람 RBC 들어, 최적 피펫 직경 17,30 식 1의 최적을 산출 2.0-2.4 ㎛ 인 것이다. 둘째, 힘 클램프 분석 및 열 변동 분석에서 측정이 단일 결합에 대한 대부분입니다 보장하기 위해, 20 %가 아래의 접착 주파수는 10,13,30를 유지한다. 여기서, 비 특​​정 유착 신중 (BSA 충분한 차단 통상 &lt;5 %)을 제어한다. 또한, 데이터는 단일의 힘 - 드롭 접착 이벤트 수집한다 - 단일 단계 실종 단일 분자 거동의 특징 (유사한단일 분자에 형광) FRET. 형광 염료의 셋째, 부하 농도가 최상의 영상 품질을 달성하기 위해 경우에 따라 최적화되어야한다. 넷째, T 세포 또는...

세포 간 및 세포 - 대 - 세포 외 기질 (ECM)의 밀착성이 세포 표면 수용체, ECM 단백질, 및 / 또는 지질 1 간의 결합에 의해 매개된다. 바인딩은 세포의 기능을 형성 한 구조뿐만 아니라, 인식, 통신, 및 환경 1-3에 반응 할 수있다. 수용성 단백질 (예 : 사이토킨 및 성장 인자), 3 차원 (3D)에서 결합하는 세포 표면 수용체 상 유체 상 달리 세포 부착 수용체 분자 구속 두 대향면을 연결하는 좁은 접합부 갭에 걸쳐 그들의 리간드 결합을 형성 두 차원 (2D) 인터페이스 4-7에 확산. 일반적으로 기존의 결합 분석 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 또는 SPR)에 의해 측정되는 3D 동역학 달리, 챔버 (11, 12)을 흘러, 예컨대 원 자간 력 현미경 (AFM) 8-10 같은 전문 기술을 정량 2D 동력학 가지고 마이크로 피펫 13, 14, 광핀셋 (15)과 생체막의 힘 프로브 (BFP) 16-21. 단지 세포 응집력 물리적 링크를 제공하는 이상은, 부착 분자는 그 주변과 통신하는 셀에 대한 시그널링 장치의 주요 구성 요소이다. 부착 분자의 리간드 결합은 세포 내 신호 전달 및 방법은 초기 신호가 상기 형질 도입 된 세포의 내부를 개시한다 방법 이해에 관심이 증대되고있다. 직관적으로, 수용체 - 리간드의 성질은 그것이 유도 된 신호에 영향을 미칠 수 바​​인딩. 그러나, 그 때문에 예를 들면 많은 한계, 불량한 시간 해상도와 공간 해상도의 완전한 결핍의 생화학 적 분석법 전통적인 앙상블을 사용 세포 상호 작용 및 세포 내 신호 전달 기전 이벤트 간의 관계를 해부하기가 어렵다. 라이브에 모두 생물 물리학 (역학을 결합 2D 수용체 - 리간드)을 허용 방법과 생화학 (신호) 관측을 기존세포는 형광 기능을 24-26로 통합 조정 강성 (22)의 기판 (23) 엘라스토머 기둥 배열과 유량 용기 / 미세 유체 장치를 포함한다. 그러나, 신호와 결합 수용체 리간드의 판독이 어려운 신호 이벤트와 결합 특성의 공간적 관계를 해부하고, (다른 방법으로 가장 자주) 개별적으로 얻을 수있다. 기존의 BFP는 높은 시공간 해상도 (17)와 고감도 힘 분광법이다. 이는 단일 분자 동력학 2D, 기계적 특성 및 구조적 변화 14,16,19-21,27-29의 측정을 가능하게 힘 센서로서가요 적혈구 (RBC)를 사용한다. 형광 이미징 기반 BFP (fBFP)는 단일 분자 규모에서 결합 트리거 세포 신호와 수용체 - 리간드 결합 반응 속도의 상관 관계. 표면 mechani의 맥락에서 현장 세포 신호 활동이 설정으로CAL 자극은 T-27 세포에서 관찰되었다. fBFP 만능이며 다른 셀들에있는 다른 분자들에 의해 매개되는 세포 부착 및 시그널링의 연구에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>인산염 완충액 준비</td></tr><tr><td>Anhy. 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>인산나트륨 완충액 준비</td></tr>: <tr><td>탄산나트륨(Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 준비</td></tr><tr><td>, 중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 제제</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653</td><td>N2-5% 완충액 제제</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td>N2-5% 완충액 제제</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5655</td><td>N2-5% 완충액 제</td></tr>제 <tr><td>자당</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>S0389</td><td>N2-5% 완충액 제제</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>비드 기능화</td></tr><tr><td>비오틴-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>RBC 비오틴화</td></tr><tr><td>니스타틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>N6261</td><td>RBC 삼투압 조정</td></tr><tr><td>수산화암모늄(NH4OH)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A-6899</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>30% 과산화수소(H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>아세트산(빙차)</td><td>시그마-알드리치</td><td>ARK2183</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>붕규산 유리 구슬</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>Streptavidin&minus; Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>리간드 기능화</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>세포 내 칼슘 형광 염료 로딩</td></tr><tr><td>디메틸 설폭시드 (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>세포 내 칼슘 형광 염료 로딩</td></tr><tr><td>Quantibrite PE 비드</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>밀도 정량화</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR</td><td>II 밀도 정량화</td></tr><tr><td>모세관 0.7-1.0 mm x 30 인치</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>마이크로 피펫</td></tr><tr><td>제작 불연성 / 갈색 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td>마이크로 피펫 제작</td></tr><tr><td>피펫 마이크로 포스</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>마이크로피펫 제작</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>마이크로 인젝터</td><td>월드 정밀 기기</td><td>MF34G-5</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD&nbsp;</td><td>309602</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>마이크로피펫 홀더</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>CNC 가공을 사용하여 집에서 설계한 기계 부품 및 어댑터 제작.&nbsp;</td><td>생물 물리학 기기</td><td>: 모든 부품은 CAD 설계에 따라 맞춤화됩니다.</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>현미경(TiE 반전)</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>카메라, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, 모노</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP 고해상도</td></tr><tr>원격 제어 <td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP 시스템</td>방진 테이블 (5 'x 3')이있는<td>수동 서브 미크론 프로브 헤드</td></tr><tr><td></td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>3D 수동 번역 스테이지</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>솔리드 웍스 3D CAD 소프트웨어</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>버전 2012 SP5</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>LabVIEW 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td>버전 2009</td><td>BFP 시스템, BFP 프로그램</td></tr><tr><td>3D 피에조 변환 단계</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>선형 피에조 어큐에이터</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>Micromanager 소프트웨어</td><td></td><td>버전 1.4</td><td>fBFP 시스템, 형광 이미징 프로그램</td></tr><tr><td>듀얼 캠 (DC-2)</td><td>광</td><td>77054724</td><td>fBFP 시스템</td></tr><tr><td>듀얼 캠 방출 필터 (T565LPXR)</td><td>광도</td><td>77054725</td><td>fBFP 시스템</td></tr><tr><td>형광 카메라</td><td>하마마츠</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP 시스템</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름 (파라 필름)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>병 밀봉</td></tr><tr><td>탄산염/ 중탄산염 완충액 (pH 8.5)</td><td></td><td></td> <td>8.4 g / L 탄산나트륨 (Na2CO3), 10.6 g / L 중탄산 나트륨 (NaHCO3)</td></tr> <tr><td>인산염 완충액 (pH 6.5-6.8)</td><td></td><td></td> <td>27.6 g / L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 &bull; H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate 이염기성(Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% 완충액(pH 7.2)</td><td></td><td></td><td>20.77g/L 염화칼륨(KCl), 2.38g/L 염화나트륨(NaCl), 0.13g/L 인산칼륨 일염기성(KH2PO4), 0.71 g/L anhy. 인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4), 9.70 g/L 자당</td></tr></tbody></table>

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

멤브레인 수용체 - 리간드 상호 작용은 다수의 세포 기능을 매개한다. 바인딩 역학 이러한 분자의 상호 작용에 의해 트리거 다운 스트림 신호는 가능성이 기계적인 환경에서 결합 및 신호 포획 장소에 의해 영향을받습니다. 최근 연구는 기계적인 힘에 의한 항원 인식을 조절하고 T 세포 수용체 (TCR)의 트리거링 할 것을 보여 주었다. 이 형광 현미경으로 단일 분자 힘 분광법을 결합한 새로운 우리가 개발 한 기술이라고 형광 생체막의 힘 프로브 (fBFP)에 의해 가능하게되었다. 민감한 힘 센서로서 고속 카메라와 실시간 영상 추적 기술을 매우 부드러운 인간 적혈구를 사용 fBFP 1 ~ PN (10-12 N) ~ 3nm 이상이며 ~ 0.5 밀리의 힘, 공간과 시간 해상도. fBFP으로, 하나는 정확하게 힘 조절에 따라 단일 수용체 - 리간드 결합 동력학과 동시​​에 이미지가 트리거 바인딩 세포 내 칼을 측정 할 수 있습니다cium 하나의 살아있는 세포에 신호. 이 새로운 기술은 기계적인 규제에서 다른 세포에서 다른 막 수용체 - 리간드 상호 작용과 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

BFP 기술 1995 17 에반스 실험실에 의해 개척되었다.이 picoforce 도구는 광범위하게, 그들의 리간드 16,19,20과 상호 작용하는 부착 분자의 이차원 동력학을 분석하기 위하여, 표면에 고정화 된 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용 된 30, 분자 탄성 21,29을 측정하고, 단백질의 구조적 (21)을 변경 결정합니다. 대한 fBFP, 추가되는 해당 소프트웨어 시스템 (표 1)과 에피 형광 관련 장치 (그림 1A - C)의 추가 세트. fBFP 시스템은 하드웨어 시스템 (광학 기계 및 전기 부품) 및 소프트웨어 시스템 (표 1 및도 1A, B)로 구성된다. 명 시야 및 에피 형광 현미경을 가능 광학 부품과 거꾸로 현미경 ...

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

이 절차의 전체적인 목표는 단일 세포에서 수용체와 유사한 결합 및 결합을 동시에 측정하고, 결합으로 유도된 칼슘 신호를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 biotin을 분리하고 인간 적혈구(RBC)의 삼투압을 조절하여 이를 초민감도 힘 변환기로 사용함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세척, 팽창 및 리간드 코팅을 포함한 마이크로 규모 유리 비드의 기능화입니다.다음으로, T 세포를 분리하여 세포 내 칼슘 이온 농도 관찰이 가능하도록 calcium dye Fluo-4와 함께 배양합니다. 마지막 단계는 실험 설정에 특별히 필요한 실험 챔버 내의 마이크로 피펫을 준비하는 것입니다. 최종적으로, 형광 바이오 막 힘 프로브(fluorescence bio membrane force probe, BFP) 기술을 사용하여 리간드가 코팅된 비드에 세포가 부착되는 것을 보여주고, 수용체-리간드 결합 역학을 측정하며, 동시에 세포 내 칼슘 수준을 모니터링합니다.이 기술은 안드로겐 인식을 통해 T 세포가 기계적 힘을 어떻게 감지하는지 이해하는 데 유용합니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 FBIP를 통해 수용체-리간드 결합 kinetics와 세포 내 신호 전달을 동시에 측정할 수 있다는 점입니다. 이 프로토콜에서 까다로운 부분으로는 적절한 직경의 마이크로 펩(pep) 경로를 수동으로 제작하는 것, 마이크로 PEP를 사용하여 세포와 비즈를 집어 올리는 것, 그리고 포스 프로브(force probe)를 조립하는 것이 있으며, 초기에는 조립에 실패할 수 있습니다. 비록 그가 이 영상의 시연을 위해 이곳에 함께할 수는 없었지만 말입니다.최근 본 연구실에서 박사 학위를 마친 공동 저자 Arnold G는 FBAP 프로토콜의 초기 제작 검증에 크게 기여하였습니다. 손가락 끝 채혈을 통해 8~10 µL의 혈액을 얻어 1 mL의 carbonate bicarbonate 버퍼에 첨가한 후, 혼합물을 볼텍싱하거나 피펫팅하고 900 G에서 1분 동안 원심 분리하십시오. carbonate bicarbonate 버퍼로 세척하기 전 상층액을 제거하십시오. 다시 한 번 세척하십시오.다음으로, 생성된 RBC 팩 10 µL, carbonate bicarbonate 버퍼 171 µL, 그리고 biotin-PEG NHS 링커 용액 1049 µL를 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 동일한 세척 절차를 사용하여, 생성된 RBC 혼합물을 carbonate bicarbonate 버퍼로 1회, 그 후 N two 5% 버퍼로 2회 세척합니다.다음으로 Nystatin을 N two 5%buffer에 희석합니다. 최종 농도를 ml당 40 µL로 만들기 위해, biotinylated RBC 5 µL와 Nystatin 용액 71.4 µL를 혼합하고 0 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 샘플을 N two 5%buffer로 2회 세척하고, biotinylated RBC를 N two 5%buffer와 0.5%BSA가 혼합된 용액과 함께 냉장 보관하며, 3인치 마이크로 피펫 1개를 마이크로 피펫 풀러에 장착합니다.풀(pull) 버튼을 클릭하면 모세관의 중앙 부분이 기기에 의해 가열되고 양 끝이 당겨져 끝이 뾰족한 두 개의 모세관, 즉 가공 전의 피펫이 만들어집니다. 다음으로 가공 전의 피펫을 마이크로 피펫 포지(Forge)의 피펫 홀더에 장착합니다. 포지에서 유리 구체를 녹이기 위해 가열합니다. 가공 전 피펫의 팁을 유리 구체 내부에 삽입하십시오.유리 구체를 냉각시키고 원시 피펫을 당겨 외부에서 끊어내어, 피펫 팁이 구체 내부에 남게 합니다. 원하는 팁 구경을 얻을 때까지 이 과정을 반복하여 세포 챔버를 구축합니다. 먼저 40 mm x 22 mm x 0.2 mm 크기의 커버 슬립을 유리 절단기로 40 mm x 11 mm x 0.2 mm 크기의 두 조각으로 자릅니다. 세포 챔버는 두 개의 금속 정사각형 조각과 이를 연결하는 핸들로 구성된 수제 챔버 홀더를 기반으로 구축됩니다.글루를 사용하여 두 금속 정사각형을 연결하도록 챔버 홀더의 바닥면에 커버 슬립 하나를 부착합니다. 마찬가지로, 다른 커버 슬립을 윗면에 부착하여 평행한 커버 슬립 셀 챔버를 형성합니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 두 커버 슬립 사이에 200 µL의 실험 완충액을 주입합니다.완충액이 두 커버슬립 모두에 부착되었는지 확인하십시오. 챔버를 부드럽게 회전시키고 흔들어 완충액이 챔버의 양 끝단에 모두 닿게 하십시오. 그런 다음, 실험용 완충액 구역의 양옆으로 미네랄 오일을 조심스럽게 주입하여 완충액이 외부 공기에 노출되지 않도록 밀봉하십시오.프로브 비드, bcs 및 타겟의 현탁액을 각각 버퍼 존의 상단, 중단 및 하단 영역에 주입합니다. BFP 실험을 시작하려면 현미경과 광원을 켭니다.챔버를 현미경 메인 스테이지 위에 배치합니다. 다음 단계는 BFP의 마이크로 피펫 3개를 모두 설치하는 것입니다. 왼쪽에 있는 프로브는 A RBC를 잡기 위한 것입니다.오른쪽의 타겟은 세포를 잡기 위한 것이며, 오른쪽 아래의 헬퍼는 설치할 비드를 잡는 용도로 사용됩니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 마이크로 피펫에 실험 버퍼를 역충전하십시오. 마이크로 피펫을 피펫 홀더에서 분리하고, 팁에서 액체가 떨어질 수 있도록 낮은 위치에 둡니다. 공기 방울이 마이크로 피펫 내부로 들어가지 않도록 주의하며 마이크로 피펫을 홀더 팁에 빠르게 삽입하십시오.삽입하는 동안 홀더 나사를 조인 후, 각 피펫 홀더를 해당 마이크로 매니퓰레이터에 장착하십시오. 마이크로 피펫의 팁이 챔버 버퍼 영역에 진입하도록 마이크로 피펫을 챔버 쪽으로 밀어 넣으십시오. 마이크로 피펫의 위치를 조정하여 현미경 시야 내에서 확인하십시오.챔버 홀더 스테이지를 이동하여 세 가지 요소의 콜로니를 찾습니다. 조작기의 노브를 돌려 해당 마이크로 피펫의 위치를 하나씩 조정하여 마이크로 피펫 팁이 세포나 비드 하나에 접근하게 한 후, 세포 또는 비드를 흡입합니다. 해당 마이크로 피펫 내부의 압력을 조절함으로써 세 개의 마이크로 피펫 모두 각각의 대응하는 요소를 포획하게 됩니다.챔버 홀더 스테이지를 이동하여 주입된 요소들의 콜로니로부터 떨어진, 실험을 수행할 빈 공간을 찾으십시오. 현미경 시각 모드를 전환하여 컴퓨터 프로그램에서 이미지를 확인하십시오. 피펫 팁에 있는 세 가지 요소를 모두 프로그램의 시야 내로 이동시키십시오.다음으로, 프로브 비드와 RBC를 정렬하고 프로브 비드를 조심스럽게 조작하여 RBC의 정점으로 이동시킵니다. 이제 비드를 RBC에 짧게 접촉시킨 후 부드럽게 후퇴시키고, 헬퍼 마이크로피펫의 압력을 조절하여 비드를 살짝 불어내어 RBC 정점에 부착되도록 합니다. 헬퍼 피펫을 치우고 프로그램상에서 타겟과 프로브 비드를 정렬합니다.시야 창에서 프로그램 도구를 사용하여 프로브 마이크로 피펫, RBC 및 RBC와 프로브 비드 사이의 원형 접촉 영역의 각 반지름을 측정합니다. 이 값들을 통해 텍스트 프로토콜에 기재된 식을 이용하여 RBC의 용수철 상수를 추정할 수 있습니다. 프로그램에 원하는 RBC 용수철 상수를 입력한 후, RBC 정점에 가로선을 그리면 인접한 창에 각 픽셀의 밝기를 나타내는 곡선이 생성됩니다.이 선을 따라 임계값 선을 곡선 깊이의 약 절반 지점으로 드래그하십시오. 다음으로, 열 변동 분석(thermal fluctuation assay), 접착 빈도 분석(adhesion frequency assay) 또는 포스 클램프 분석(force clamp assay) 중 원하는 실험 모드를 선택하십시오. 매개변수를 원하는 대로 설정하십시오.시작 버튼을 클릭하면 프로그램이 대상 피펫을 이동시키고 프로브와 대상의 접촉 및 분리를 구동하며, 동시에 프로브 비드의 위치를 실시간으로 기록하는 데이터 수집이 수행됩니다. '실험 중지(stop experiment)' 버튼을 클릭하여 프로그램을 종료하면 데이터 저장을 위한 창이 나타납니다. BFP 시스템의 형광 기능을 사용하여 획득한 데이터를 저장하려면, 별도의 프로그램으로 제어되는 여기 광원과 형광 카메라를 켜십시오.그런 다음 이득(gain), 노출(exposure) 및 여기 채널(excitation channels)을 포함한 형광 이미징 파라미터를 선택합니다. 340 nm 또는 380 nm 여기광에 의해 여기되는 표적 세포의 생체 내 형광 이미지를 시각화할 수 있도록 프로브와 표적을 정렬하는 과정을 포함하여, BFP 실험 프로토콜의 모든 준비 사항을 따릅니다. 섹셔닝 도구를 사용하여 전체 기록 기간 동안 세포가 머무를 영역을 대략적으로 섹셔닝합니다.다음으로, record와 start clicking을 동시에 클릭합니다. Record 기능을 통해 340 nm와 380 nm 광원이 세포 내 형광 염료를 교대로 여기시킵니다. 이에 대응하는 한 쌍의 형광 이미지가 약 1초 간격으로 교대로 기록됩니다.'시작(start)'을 클릭하면 분자 상호작용 분석을 위한 BFP 실험과 세포 내 칼슘 신호 전달을 모니터링하기 위한 형광 이미징 실험이 시작되며, 이후 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 데이터를 분석합니다. 시간-힘(time-force) 원시 데이터 곡선에서 힘은 프로브 비드의 위치 변화를 추적하여 도출됩니다. 접착 이벤트가 발생하지 않은 경우, 표적 세포가 비드 표면에서 물러난 후 힘 역전 시간 신호에서 힘은 0으로 되돌아갑니다.반대로, 파단력 이벤트의 경우, 접착은 리트랙션(retraction) 동안 힘이 양의 수준으로 빠르게 상승했다가 다시 0으로 빠르게 떨어지는 현상으로 나타납니다. 라이프타임(lifetime) 이벤트에서는 양의 힘이 유지되어 고원(plateau) 형태가 나타납니다. 이 고원의 길이가 바로 라이프타임입니다.VFP 실험 사이클을 반복적으로 수행하여 힘 대 시간 곡선을 도출합니다. 여기에는 340nm 및 380nm 광채널로 여기시킨 몇 개 또는 두 개의 로딩된 T-세포의 형광 이미지가 나타나 있습니다. 두 이미지 모두 세포의 윤곽이 뚜렷하게 나타나며, 이는 세포가 잘 염색되었음을 나타냅니다. T-세포로부터 결합 속도론 데이터와 형광 데이터가 도출된 후, 두 데이터 간의 상관관계를 찾기 위해 누적 수명 곡선과 칼슘 농도 곡선을 동일한 그림에 함께 나타냅니다.이제 A-F-B-I-P 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 절차를 진행하는 동안 마이크로 피펫의 직경, 고무 셀 돌출부의 길이, 비드 위치와 같이 포스 프로브(force probe)에 결함이 있는지 확인하는 것이 중요합니다.이 모든 요소는 힘 측정의 정확도에 영향을 미칩니다. 이 기술은 분자 기계 생물학 분야의 연구자들이 가능한 모든 생물학적 시스템에서 기계적 신호 전달 메커니즘을 연구할 수 있는 길을 열어줍니다.

fluorescence-biomembrane-force-probe-concurrent-quantitation-receptor

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오에서는 BFP(biomembrane force probe)를 사용하여 수용체와 리간드 사이의 힘을 측정합니다. 이 기술은 프로브 비드에 접합된 pMHC와 표적 세포의 TCR 사이의 결합을 끊는 데 필요한 압력을 모니터링하여 상호 작용을 감지할 수 있습니다.

수용체-리간드 상호작용을 정량화하기 위한 Biomembrane Force 프로브

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

배우세요 형광 생체막 포스 프로브 기법으로 단일 T 림프구에서 수용체-리간드 결합 속도론과 칼슘 신호를 동시에 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 면역학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

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