Name: 형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 배우세요 형광 생체막 포스 프로브 기법으로 단일 T 림프구에서 수용체-리간드 결합 속도론과 칼슘 신호를 동시에 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 면역학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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이 논문과 관련된 연구와 Zhu 실험실의 fBFP 기술 개발은 NIH 보조금 AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 및 TW008753의 지원을 받았습니다. 이 강력한 실험 도구를 발명한 Evan Evans와 BFP를 구축하는 데 도움을 준 Evans 연구소의 구성원인 Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, Ken Halvorsen에게 감사드립니다. 또한 기기 개발에 도움을 주신 다른 Zhu lab 구성원인 Fang Kong, Chenghao Ge 및 Kaitao Li에게도 감사드립니다.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
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성공적인 fBFP 실험은 몇 가지 중요한 고려 사항을 수반한다. 힘의 계산이 신뢰할 수있는 위해 첫째, 마이크로 피펫, RBC, 프로브 비드가 가능한 동축에 가깝게 정렬되어야합니다. RBC 및 피펫 사이의 마찰을 무시할 수 있도록 피펫 내부 RBC의 투영 약 1 프로브 피펫 직경이어야한다. 전형적인 사람 RBC 들어, 최적 피펫 직경 17,30 식 1의 최적을 산출 2.0-2.4 ㎛ 인 것이다. 둘째, 힘 클램프 분석 및 열 변동 분석에서 측정이 단일 결합에 대한 대부분입니다 보장하기 위해, 20 %가 아래의 접착 주파수는 10,13,30를 유지한다. 여기서, 비 특​​정 유착 신중 (BSA 충분한 차단 통상 &lt;5 %)을 제어한다. 또한, 데이터는 단일의 힘 - 드롭 접착 이벤트 수집한다 - 단일 단계 실종 단일 분자 거동의 특징 (유사한단일 분자에 형광) FRET. 형광 염료의 셋째, 부하 농도가 최상의 영상 품질을 달성하기 위해 경우에 따라 최적화되어야한다. 넷째, T 세포 또는...

세포 간 및 세포 - 대 - 세포 외 기질 (ECM)의 밀착성이 세포 표면 수용체, ECM 단백질, 및 / 또는 지질 1 간의 결합에 의해 매개된다. 바인딩은 세포의 기능을 형성 한 구조뿐만 아니라, 인식, 통신, 및 환경 1-3에 반응 할 수있다. 수용성 단백질 (예 : 사이토킨 및 성장 인자), 3 차원 (3D)에서 결합하는 세포 표면 수용체 상 유체 상 달리 세포 부착 수용체 분자 구속 두 대향면을 연결하는 좁은 접합부 갭에 걸쳐 그들의 리간드 결합을 형성 두 차원 (2D) 인터페이스 4-7에 확산. 일반적으로 기존의 결합 분석 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 또는 SPR)에 의해 측정되는 3D 동역학 달리, 챔버 (11, 12)을 흘러, 예컨대 원 자간 력 현미경 (AFM) 8-10 같은 전문 기술을 정량 2D 동력학 가지고 마이크로 피펫 13, 14, 광핀셋 (15)과 생체막의 힘 프로브 (BFP) 16-21. 단지 세포 응집력 물리적 링크를 제공하는 이상은, 부착 분자는 그 주변과 통신하는 셀에 대한 시그널링 장치의 주요 구성 요소이다. 부착 분자의 리간드 결합은 세포 내 신호 전달 및 방법은 초기 신호가 상기 형질 도입 된 세포의 내부를 개시한다 방법 이해에 관심이 증대되고있다. 직관적으로, 수용체 - 리간드의 성질은 그것이 유도 된 신호에 영향을 미칠 수 바​​인딩. 그러나, 그 때문에 예를 들면 많은 한계, 불량한 시간 해상도와 공간 해상도의 완전한 결핍의 생화학 적 분석법 전통적인 앙상블을 사용 세포 상호 작용 및 세포 내 신호 전달 기전 이벤트 간의 관계를 해부하기가 어렵다. 라이브에 모두 생물 물리학 (역학을 결합 2D 수용체 - 리간드)을 허용 방법과 생화학 (신호) 관측을 기존세포는 형광 기능을 24-26로 통합 조정 강성 (22)의 기판 (23) 엘라스토머 기둥 배열과 유량 용기 / 미세 유체 장치를 포함한다. 그러나, 신호와 결합 수용체 리간드의 판독이 어려운 신호 이벤트와 결합 특성의 공간적 관계를 해부하고, (다른 방법으로 가장 자주) 개별적으로 얻을 수있다. 기존의 BFP는 높은 시공간 해상도 (17)와 고감도 힘 분광법이다. 이는 단일 분자 동력학 2D, 기계적 특성 및 구조적 변화 14,16,19-21,27-29의 측정을 가능하게 힘 센서로서가요 적혈구 (RBC)를 사용한다. 형광 이미징 기반 BFP (fBFP)는 단일 분자 규모에서 결합 트리거 세포 신호와 수용체 - 리간드 결합 반응 속도의 상관 관계. 표면 mechani의 맥락에서 현장 세포 신호 활동이 설정으로CAL 자극은 T-27 세포에서 관찰되었다. fBFP 만능이며 다른 셀들에있는 다른 분자들에 의해 매개되는 세포 부착 및 시그널링의 연구에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>인산염 완충액 준비</td></tr><tr><td>Anhy. 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>인산나트륨 완충액 준비</td></tr>: <tr><td>탄산나트륨(Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 준비</td></tr><tr><td>, 중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 제제</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653</td><td>N2-5% 완충액 제제</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td>N2-5% 완충액 제제</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5655</td><td>N2-5% 완충액 제</td></tr>제 <tr><td>자당</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>S0389</td><td>N2-5% 완충액 제제</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>비드 기능화</td></tr><tr><td>비오틴-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>RBC 비오틴화</td></tr><tr><td>니스타틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>N6261</td><td>RBC 삼투압 조정</td></tr><tr><td>수산화암모늄(NH4OH)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A-6899</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>30% 과산화수소(H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>아세트산(빙차)</td><td>시그마-알드리치</td><td>ARK2183</td><td>유리 구슬 실란화</td></tr><tr><td>3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>붕규산 유리 구슬</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>Streptavidin&minus; Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>리간드 기능화</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>세포 내 칼슘 형광 염료 로딩</td></tr><tr><td>디메틸 설폭시드 (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>세포 내 칼슘 형광 염료 로딩</td></tr><tr><td>Quantibrite PE 비드</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>밀도 정량화</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR</td><td>II 밀도 정량화</td></tr><tr><td>모세관 0.7-1.0 mm x 30 인치</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>마이크로 피펫</td></tr><tr><td>제작 불연성 / 갈색 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td>마이크로 피펫 제작</td></tr><tr><td>피펫 마이크로 포스</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>마이크로피펫 제작</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>마이크로 인젝터</td><td>월드 정밀 기기</td><td>MF34G-5</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD&nbsp;</td><td>309602</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>마이크로피펫 홀더</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>챔버 어셈블리</td></tr><tr><td>CNC 가공을 사용하여 집에서 설계한 기계 부품 및 어댑터 제작.&nbsp;</td><td>생물 물리학 기기</td><td>: 모든 부품은 CAD 설계에 따라 맞춤화됩니다.</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>현미경(TiE 반전)</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>카메라, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, 모노</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP 고해상도</td></tr><tr>원격 제어 <td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP 시스템</td>방진 테이블 (5 'x 3')이있는<td>수동 서브 미크론 프로브 헤드</td></tr><tr><td></td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>3D 수동 번역 스테이지</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>솔리드 웍스 3D CAD 소프트웨어</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>버전 2012 SP5</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>LabVIEW 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td>버전 2009</td><td>BFP 시스템, BFP 프로그램</td></tr><tr><td>3D 피에조 변환 단계</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>선형 피에조 어큐에이터</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP 시스템</td></tr><tr><td>Micromanager 소프트웨어</td><td></td><td>버전 1.4</td><td>fBFP 시스템, 형광 이미징 프로그램</td></tr><tr><td>듀얼 캠 (DC-2)</td><td>광</td><td>77054724</td><td>fBFP 시스템</td></tr><tr><td>듀얼 캠 방출 필터 (T565LPXR)</td><td>광도</td><td>77054725</td><td>fBFP 시스템</td></tr><tr><td>형광 카메라</td><td>하마마츠</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP 시스템</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름 (파라 필름)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>병 밀봉</td></tr><tr><td>탄산염/ 중탄산염 완충액 (pH 8.5)</td><td></td><td></td> <td>8.4 g / L 탄산나트륨 (Na2CO3), 10.6 g / L 중탄산 나트륨 (NaHCO3)</td></tr> <tr><td>인산염 완충액 (pH 6.5-6.8)</td><td></td><td></td> <td>27.6 g / L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 &bull; H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate 이염기성(Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% 완충액(pH 7.2)</td><td></td><td></td><td>20.77g/L 염화칼륨(KCl), 2.38g/L 염화나트륨(NaCl), 0.13g/L 인산칼륨 일염기성(KH2PO4), 0.71 g/L anhy. 인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4), 9.70 g/L 자당</td></tr></tbody></table>

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

멤브레인 수용체 - 리간드 상호 작용은 다수의 세포 기능을 매개한다. 바인딩 역학 이러한 분자의 상호 작용에 의해 트리거 다운 스트림 신호는 가능성이 기계적인 환경에서 결합 및 신호 포획 장소에 의해 영향을받습니다. 최근 연구는 기계적인 힘에 의한 항원 인식을 조절하고 T 세포 수용체 (TCR)의 트리거링 할 것을 보여 주었다. 이 형광 현미경으로 단일 분자 힘 분광법을 결합한 새로운 우리가 개발 한 기술이라고 형광 생체막의 힘 프로브 (fBFP)에 의해 가능하게되었다. 민감한 힘 센서로서 고속 카메라와 실시간 영상 추적 기술을 매우 부드러운 인간 적혈구를 사용 fBFP 1 ~ PN (10-12 N) ~ 3nm 이상이며 ~ 0.5 밀리의 힘, 공간과 시간 해상도. fBFP으로, 하나는 정확하게 힘 조절에 따라 단일 수용체 - 리간드 결합 동력학과 동시​​에 이미지가 트리거 바인딩 세포 내 칼을 측정 할 수 있습니다cium 하나의 살아있는 세포에 신호. 이 새로운 기술은 기계적인 규제에서 다른 세포에서 다른 막 수용체 - 리간드 상호 작용과 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

BFP 기술 1995 17 에반스 실험실에 의해 개척되었다.이 picoforce 도구는 광범위하게, 그들의 리간드 16,19,20과 상호 작용하는 부착 분자의 이차원 동력학을 분석하기 위하여, 표면에 고정화 된 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용 된 30, 분자 탄성 21,29을 측정하고, 단백질의 구조적 (21)을 변경 결정합니다. 대한 fBFP, 추가되는 해당 소프트웨어 시스템 (표 1)과 에피 형광 관련 장치 (그림 1A - C)의 추가 세트. fBFP 시스템은 하드웨어 시스템 (광학 기계 및 전기 부품) 및 소프트웨어 시스템 (표 1 및도 1A, B)로 구성된다. 명 시야 및 에피 형광 현미경을 가능 광학 부품과 거꾸로 현미경 ...

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

이 절차의 전체적인 목표는 단일 세포에서 수용체와 유사한 결합 및 결합을 동시에 측정하고, 결합으로 유도된 칼슘 신호를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 biotin을 분리하고 인간 적혈구(RBC)의 삼투압을 조절하여 이를 초민감도 힘 변환기로 사용함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세척, 팽창 및 리간드 코팅을 포함한 마이크로 규모 유리 비드의 기능화입니다.다음으로, T 세포를 분리하여 세포 내 칼슘 이온 농도 관찰이 가능하도록 calcium dye Fluo-4와 함께 배양합니다. 마지막 단계는 실험 설정에 특별히 필요한 실험 챔버 내의 마이크로 피펫을 준비하는 것입니다. 최종적으로, 형광 바이오 막 힘 프로브(fluorescence bio membrane force probe, BFP) 기술을 사용하여 리간드가 코팅된 비드에 세포가 부착되는 것을 보여주고, 수용체-리간드 결합 역학을 측정하며, 동시에 세포 내 칼슘 수준을 모니터링합니다.이 기술은 안드로겐 인식을 통해 T 세포가 기계적 힘을 어떻게 감지하는지 이해하는 데 유용합니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 FBIP를 통해 수용체-리간드 결합 kinetics와 세포 내 신호 전달을 동시에 측정할 수 있다는 점입니다. 이 프로토콜에서 까다로운 부분으로는 적절한 직경의 마이크로 펩(pep) 경로를 수동으로 제작하는 것, 마이크로 PEP를 사용하여 세포와 비즈를 집어 올리는 것, 그리고 포스 프로브(force probe)를 조립하는 것이 있으며, 초기에는 조립에 실패할 수 있습니다. 비록 그가 이 영상의 시연을 위해 이곳에 함께할 수는 없었지만 말입니다.최근 본 연구실에서 박사 학위를 마친 공동 저자 Arnold G는 FBAP 프로토콜의 초기 제작 검증에 크게 기여하였습니다. 손가락 끝 채혈을 통해 8~10 µL의 혈액을 얻어 1 mL의 carbonate bicarbonate 버퍼에 첨가한 후, 혼합물을 볼텍싱하거나 피펫팅하고 900 G에서 1분 동안 원심 분리하십시오. carbonate bicarbonate 버퍼로 세척하기 전 상층액을 제거하십시오. 다시 한 번 세척하십시오.다음으로, 생성된 RBC 팩 10 µL, carbonate bicarbonate 버퍼 171 µL, 그리고 biotin-PEG NHS 링커 용액 1049 µL를 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 동일한 세척 절차를 사용하여, 생성된 RBC 혼합물을 carbo

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

이 비디오에서는 BFP(biomembrane force probe)를 사용하여 수용체와 리간드 사이의 힘을 측정합니다. 이 기술은 프로브 비드에 접합된 pMHC와 표적 세포의 TCR 사이의 결합을 끊는 데 필요한 압력을 모니터링하여 상호 작용을 감지할 수 있습니다.

수용체-리간드 상호작용을 정량화하기 위한 Biomembrane Force 프로브

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&amp;B) 분석을 기반으로 합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

배우세요 형광 생체막 포스 프로브 기법으로 단일 T 림프구에서 수용체-리간드 결합 속도론과 칼슘 신호를 동시에 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 면역학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

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