Name: 자기 공명 이미지 지침에 열성 리포좀에서 시스플라틴의 트리거 된 릴리스를위한 맞춤 설계 레이저 기반의 가열 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 학습하세요 자궁경부암 종양을 대상으로 한 맞춤형 레이저 가열 장치를 이용한 열감응성 리포좀 약물 전달 방법을. 이 기술은 실시간 MRI 온도 모니터링으로 정확한 국소 가열을 가능하게 합니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(CIHR)가 C.A. 및 D.A.J.에 제공하는 운영 보조금으로 자금을 지원받습니다. 저자는 캐나다 혁신 재단(Canadian Foundation for Innovation)과 프린세스 마가렛 암 재단(Princess Margaret Cancer Foundation)이 이 연구의 이미징 및 치료 연구 구성 요소를 가능하게 하는 STTARR 연구 시설에 자금을 지원한 것에 대해 감사를 표합니다.

1. 리포좀 준비 <ol><li> (카보 닐 - 지질 1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DPPC), 1- 스테아로 일 -2- 히드 록시 -3- SN -glycero 포스파티딜콜린 (또는 S-MSPC 리소-PC)를 용해하고 N , 메 톡시 2000) 클로로포름 -1,2- 디 distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine (MPEG 2000 -DSPE). 예를 들어, HTLC 10 ㎖의 준비를 위해, 호박 유리 병 속으로 314.4 mg을 DPPC, 39.4 mg을 MSPC 및 83.9 mg의 된 mPEG 2000 -DSPE 무게. 그런 다음, 2 mL의 클로로포름에 용해하고 지질을 60 ℃ 수조에 30 초 동안 바이알​​을 가열. </li><li> 회전 증발기를 사용하여 클로로포름을 제거한다. 고압 진공 O / N에서 생성 된 지질 필름을 놓습니다. </li><li> HTLC 10ml를 들어, 1 시간 동안 5 ㎖ 0.1N 트리스 완충액 (pH 7.4)와 지질 막을 수화. 동시에, 달아 162.4 mg을 1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phosphoglycerol (DPPG) 지질 및 100 mg을 CDDP 분말 및 수화물 wi 번째 5 ㎖의 0.1N 1 시간 동안 30 % 에탄올 (PH 7.4)을 함유하는 트리스 완충액. </li><li> GD-HTLC 제형, DPPG 지질 및 10 mg을 CDDP 분말의 동일한 양을 계량 한 다음 (2.5 mL의 GD-HP-DO3A 용액 (279.3 ㎎ / ㎖)에 30 %의 에탄올을 함유하는 2.5 ml의 0.1 N 트리스 완충액으로 수화 1 시간 동안의 pH 7.4). 수분 동안 혼합물 호박색 유리 병에 보관해야 일정한 교반하고 10 분마다 볼 텍싱을 70 ℃에서 핫 플레이트 상에 두었다. </li><li> 지질 혼합물과 지질 약물 혼합물을 조합하고, 다시 1 시간 동안 수화. 소용돌이 매 15 ~ 20 분. </li><li> 200 nm의 폴리 카보네이트 필터의 두 스택과 함께 10 ml의 압출기를 조립합니다. 70 ° C에서 순환 수조에 압출기의 thermobarrel을 연결하고, 압축 된 질소 탱크에 압출기를 연결합니다. </li><li> 즉시 수화 한 후, 압출기 챔버에 혼합물을 전송. 세포막을 통해 리포좀을 돌출 할 수있는 질소 흐름 (200 PSI에 설정 압력)를 엽니 다. liposom를 수집50 ML 튜브에 말이지. 압출 공정 동안에 항상 온수 욕 (70 ℃)에서 튜브를 유지한다. 이 과정을 5 번 반복합니다. </li><li> 압출기를 분해하여 100 nm의 폴리 카보네이트 필터의 두 스택으로 변경합니다. 압출기를 재 조립하고 400 PSI에 압력을 설정합니다. 리포좀 10 번 돌출 제외하고 5 단계를 반복합니다. 15 ML 튜브로 최종 압출에서 샘플을 수집합니다. </li><li> 3 분 불용성 CDDP 침전 1,000 XG에서 RT에 리포좀, 원심 분리기를 냉각. </li><li> 멸균 조건에서 15,000 분자량 컷오프 (MWCO)과 투석 튜브에 0.9 % 식염수에 대한 리포좀 O / N을 투석. </li><li> 증류수 990 μL의 리포좀의 10 μl를 희석. HTLC 및 GD-HTLC의 크기 분포를 측정하기 위해 동적 광 산란을 사용한다. 10 실행하는 각 3 측정을 수행합니다. </li><li> 증류수 3,960 μL의 리포좀의 40 μl를 희석. 백금과 가돌리늄의 5-6 표준 용액 만들기0.1 내지 20 μg의 / ㎖의 농도 범위이다. 3 개의 다른 파장에서 유도 결합 플라즈마 - 원자 방출 분광기 (ICP-AES)을 사용하여 백금 및 가돌리늄의 농도를 측정한다. 평균 결과에 대한 각 파장에서 3 측정을 수행합니다. </li><li> 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용 HTLC 리포좀 제형의 액정 상 전이 온도 (T m)로 겔을 결정한다. 로드 5-10 DSC 팬에 HTLC mg의와는 참고로 빈 팬을 사용합니다. 60 ° C 0 ° C에서 온도를 진입로 5 ℃ / min의 스캔 속도를 사용합니다. </li><li> 4 ° C에서 빛 노출 및 저장을 방지하기 위해 알루미늄 호일에 리포좀을 감싸. </li></ol> 리포좀에서 체외 릴리스 2. <ol><li> 스핀 열을 준비합니다. <ol><li> 3-4 시간 동안 실온에서 400 mL의 0.9 % 식염수에 50g 겔 여과 비즈 부화. 0.9 %의 식염수에 젖은 유리 섬유 조각, 최대 롤과 1 ML의 주사기의 끝 부분에 배치. 약 0.05-0.1 ml의 주사기를 채우기 위해 유리 섬유를 누릅니다. 점차적으로 주사기에 약 1 ml의 겔 여과 매체를 추가 할 유리 피펫을 사용합니다. </li><li> 3 분 동안 1,000 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 주사기를 놓습니다. 스핀 열을 제거하고 15 ML 튜브에 넣습니다. </li></ol></li><li> 샘플 400 8 1 - DRAM 유리 병에 HTLC 또는 GD-HTLC의 μL, 37 ° C 또는 42 ° C 중 하나에 온도 조절 수조에서 부화. 각 시점에 한 병 (즉, 5, 15, 30, 60 분)을 꺼내 즉시 얼음에 놓습니다. </li><li> 다음 배양 (제어) 전에 HTLC 또는 GD-HTLC의 100 μl를 추가하거나 스핀 열에 수조에서 배양 한 후, 준비된 스핀 컬럼에 0.9 %의 식염수 100 μl를 추가합니다. 3 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 튜브로부터 주사기를 제거하고 ICP-AES 분석 튜브 용액을 희석. </li></ol> 자궁 경부의 피하 이종 이식 3. 주입종양 <ol><li> 모든 동물 실험은 대학 건강 네트워크의 동물 관리위원회 (UHN)의 승인을 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)의 모든 동물 연구를 수행합니다. 어떤 수술 전에 수술 도구를 압력솥. 각각의 수술 후, 70 % 에탄올과 수술 도구를 닦아 다시 뜨거운 비드 살균기를 사용하여 소독. </li><li> 안락사를 들어, 다음 경추 탈구를 수행, 절연 CO 2 챔버에서 동물을 배치합니다. </li><li> 100 % 산소를 사용하여 전신 마취를 들어, 유도 5 % 이소 플루오 란 및 유지 보수를 위해 2 %를 사용한다. 마취의 깊이를 확인하기 위해 동물의 반응을 관찰하는 발바닥의 손바닥 표면에 집게로 압력을 적용합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 적용합니다. </li><li> 수술을 한 동물은 다른 동물의 회사없이 깨끗한 케이지에 동물을 배치합니다. 충분한 의식이 회복 될 때까지 모니터링합니다. </li><li> 문화알파 - 최소 필수 배지, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충 된 (α-MEM)에서 ME-180 세포. </li><li> 세포를 수확하고 접종 전에 완료 미디어의 세포를 유지. 혈구를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 근육 (IM) ME-180 (인간의 자궁 경부암 세포) 종양을 부담하기 위해 각 기증자 마우스를 접종한다. 주 : IM 사이트 성장은 물론 종양의 혈관 발달을 보장하기 위해 선택되었다. 구매 여성 SCID 마우스 (세 6-8주, 약 20 g)를 사내 사육 시설에서. <ol><li> 암컷 SCID 마우스를 마취하고 27 G 바늘을 이용하여 뒷다리의 비복근 근육에 1 × 106 세포 ME-180를 주입. </li><li> 종양이 가장 긴 차원에서 9-12mm에 도달 할 때까지 캘리퍼스를 이용하여 종양의 크기를 측정한다. 종양이 12mm를 초과 한 경우에 연구를 종료, 또는 종양 덩어리 정상적인 동작, 보행, 음식과 물을 섭취 타협 경우. </li></ol></li><li> 받는 사람 쥐에 기증자 마우스에서 임플란트 종양 조각. <ol><li> 5 % 이소 플루오 란을 사용하여 도너 마우스를 마취. 마취하에 경추 탈구를 사용하여 마우스를 안락사. 기증자 마우스에서 기증자 종양을 제거합니다. 2-3mm 3 차 조각으로 종양을 잘라. </li><li> 5 % 이소 플루오 란을 사용하여 수신자 마우스를 마취. 멜 록시 캄 ml의 피하 수술 전 / 0.5 mg을 100 ㎕를 주입한다. 면도 피부에 요오드 수술 후 스크럽 솔루션, 70 % 에탄올, 그리고 마지막으로 요오드 용액을 적용합니다. 받는 사람 마우스의 왼쪽 뒷다리를 면도. 피부의 수준에서 절개를합니다. 절개를 통해 한 기증자 종양 조각의 피하에 삽입합니다. 1-2 상처 클립 (들)을 사용하여 절개를 닫습니다. </li><li> 이식 후 클립 3-5 일 제거합니다. 피하 종양은 레이저 기반의 난방 설정을 사용하여 필요합니다. </li><li> 종양이 가열 처리 전에 2~3주에 대한 성장하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 디자인, ASSEM생체 난방을위한 포멀 레이저 배달 조명기의 BLY 및 교정 <ol><li> 광섬유를 사용하여 컨 포멀 일루미네이터 결합 763 nm의 다이오드 레이저를 사용하여 조직 가열을 달성한다. <ol><li> 조명은 이종 이식 종양의 균일 한 표면 레이저 조명을 제공합니다. 그것은 중간에 하나의 챔버 (직경 16mm) 2 작은 챔버 양쪽에 (길이 16mm와 5mm를 챔버 분야를 통합하는 세 개의 인접 빛을 포함하는 고 반사 물질의 30 X 20 X 17mm 블록으로 구성된다 직경) (그림 1). </li><li> 위해서 빛이 다른 하나의 챔버로 전달하는, 두 개의 작은 5mm 직경 구멍 작은 외측 챔버와 챔버 사이에 큰 중간 절단 하였다. 빛은 600 ㎛의 직경의 구멍을 통하여 챔버로 전달되는 레이저에 연결된 400 μm의 절단 단 섬유를 이용하여 챔버 외부로 레이저로부터 전달된다. </li><li> 때문에 빛 INT의 특성챔버 벽 eraction은 작은 챔버 중 하나에 전달되는 광은 공간적으로 균질화는 상기 공간적으로 균질이고 큰 챔버 내로 내부 포트를 통과한다. 광은 중간 챔버에 10mm 직경의 포트를 종료한다. </li></ol></li><li> NIST를 이용하여 레이저 파워의 설정에 대해 일루미네이터 광의 전달을 교정은 전송 전력을 측정하는 적분 구를 보정 50mm. <ol><li> 종양의 간략화 된 구조에 기초한 몬테 칼로 시뮬레이션을 이용하여 종양에서의 광 분포를 계산한다. 자크 등. (14)의 다층 조직에서 빛 전송의 몬테 카를로 모델링의 표준 코드에 상용 전산 소프트웨어 패키지와베이스로 작성된 사용자 정의 알고리즘에 몬테카를로 코드를 생성합니다. </li><li> 그 반구가 피부 표면에서 7mm의 평균 종양 크기를 일치 직경 평면 피부 라인에 누워 같이 종양 모델5mm의 ight. 임의로 구의 중심에 직접 노출 반구 걸쳐 광자를 실행하여 표면의 균일 한 조명 모델. </li><li> 흡수 포함한 광학 특성을 사용하면 = 0.025 mm -1, 산란 μ, μ들 10mm -1, 이방성 계수, g = 0.9 및 굴절률 N = 1.4 =. 계산에 백만 광자를 사용합니다. </li><li> 초기 교정 후 더 이상의 수정을 어떤 생체 가열 실험 전에 이러한 측정을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 맞춤 디자인 레이저 회의소 설정을 사용하여 종양의 5 포멀 난방 <ol><li> 레이저 소자 및 조명 장치에 반대쪽 레이저 섬유의 한쪽 끝을 연결한다. </li><li> 5 % 이소 플루오 란을 사용하여 동물을 마취. 마우스의 측면 꼬리 정맥에 27 G 주입 카테터를 삽입합니다. 종양의 중심에 22 G 카테터를 삽입합니다. 광섬유의 온도를 배치 PR중공 카테터에 OBE는 온도 변화를 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 조명 (그림 2)와 종양 전체를 커버. 먼저 레이저의 전원을 켜고 온도가 상승 할 때까지 기다립니다 W. 0.8-1의 전원을 설정합니다. 수동 W. 0.1-0.8 사이의 레이저 파워를 조정함으로써 42 ℃에서의 종양의 온도를 유지 </li></ol> MR 온도 측정을 통해 평가되는 6 온도 분포 (MRT) <ol><li> 광섬유 온도 센서 측정치와 함께 7 테슬라 전임상 MR 촬상 시스템 (15)에 양성자 공명 주파수 시프트 (PRF 시프트) MRT 통해 레이저 기반 가열 설정을 이용하여 가열 된 종양의 온도 분포를 측정한다. </li><li> 2D-FLASH 펄스 시퀀스를 사용하여 10 초 간격 (에코 시간 4.5 밀리 초, 반복 시간 156.25 밀리 초)에서 체온계 이미지를 획득 312 X 312 μm의 면내 해상도와 광섬유의 레벨에서 단일 슬라이스에 2mm 슬라이스 두께 온도 프로있다. </li></ol> 에이전트 릴리스 7. MR 모니터링 <ol><li> T 1 -weighted 이미징 이전과 GD-HTLC의 투여 후 20 분을 수행합니다. </li><li> 이식 3 절에 상술 된 방법을 사용하여 암컷 SCID 마우스 이식 종양 두, 뒷다리에 각각 하나. 66.3 ㎎ / ㎏ GD-HP-DO3A 및 1.4 ㎎ / ㎏ CDDP의 용량 GD-HTLC 주입하기 전에 42 ℃에서 5 분 동안 왼쪽 뒷다리에서 종양을 예열하고 추가 20 종양을 가열 분 후 분사. 가열 처리시 주입을 수행합니다. 난방 제어로 오른쪽 뒷다리에 종양을 사용합니다. </li><li> 동적 자기 공명 영상 획득 (36 X 20mm 시야, 200 X 200 μm의에서 평면 해상도, 2mm 슬라이스 두께, MR 시퀀스 프로토콜)은 전체 20 분 12 초 간격으로 하나님-HP-DO3A 자료를 모니터링 GD-HTLC의 사후 관리, 주입하기 전에 30 초를 시작. </li><li> (가열 및 비가 열) 종양과 근육의 볼륨을 컨투어입니다.각각의 윤곽 볼륨 내의 모든 복셀의 평균 MR 신호를 계산합니다. </li></ol>

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리포좀은 먼저 그들의 지질 이중층 (2) 내에는 내부 수성 부피 친수성 소수성 약물과 약물 전달 약물 전달 비히클로서 1960 년에 개발되었다. 방사성 핵종으로 표지 또는 촬상 조영제 17로 로딩 될 때 치료 용도로 사용할뿐만 아니라, 리포솜의 진단 애플리케이션에 탐구되어왔다. 최근 몇 년 동안, theranostics 및 치료 진단 쌍에서 영상 유도 환자 계층화 및 약물 전달 (17, 18)의 기회를 제공하기 위해 추진되고있다. 본 연구는 MR의지도하에 맞춤 디자인 레이저 기반 가열 설정을 사용하여 온도 감응성 리포좀에서 트리거 된 약물 방출을 평가하기위한 영상 유도 약물 전달의 개념을 구축합니다. 상술 한 바와 같이, 수조 또는 히팅 카테터 일반적 피하 종양을 가열하는데 사용되어왔다. 수욕 방법은 고온에서 w 전체 사지의 침지를 필요의 ater는 또한 사지 통하여 비특이적 약물 방출을 초래하는 종양 부위에서 방출한...

나노 스케일 시스템의 향상된 통기성 및 체류 (EPR)의 고형 종양 결과의 병태 생리. 이는 전신 부작용을 최소화하면서 1 종양 조직을 대상으로이 효과를 활용 많은 약물 전달 시스템의 개발을 유도 하였다. 리포좀 전달 기술이 널리 약물 또는 이미징 프로브 (2)에 대해 조사되었다. 리포좀은 상당히 종래 화학 요법에 비해 독성이 감소하였으나, 임상 적 효능에 3,4- 약간 개선이 있었다. 연구는 제한된 효능 캐리어 4,5-로부터 약물 방출의 부족에 기인 한 것으로 나타났다. 그 결과, 외부 자극에 응답하여 캡슐화 약물을 방출하기 위해 활성화되고 리포좀 개발 상당한 관심을 끌고있다. 온열 요법은 암 환자 6 비교적 안전한 치료 방법으로 수십 년 동안 사용되어왔다. 따라서 개발외부 트리거로 열을 온도 감응성 리포좀의, 표준 임상 번역에 대한 상당한 잠재력을 가진 논리 조합하고있다. 실제로, LTSL-DOX로 알려진 독소루비신의 lysolipid 함유 온도 감응성 리포좀 제형은 현재 임상 평가 (7)에 도달했습니다. LTSL-DOX에 대한 최근 임상 데이터는 열 전달을위한 프로토콜은 크게 환자 결과 (8)에 영향을 미칠 수있는 중요한 요소 인 것으로 나타났습니다. 인간에서, 고주파, 마이크로파, 레이저와 초음파 트랜스 듀서는 종양 부위 (9)에 로컬로 고열을 적용하는 데 사용됩니다. 피하 종양의 난방을 필요로하는 임상 연구에서, 가열 카테터 (10, 11)와 수조 (12, 13)은 가장 자주 사용된다. 이 논문에서는, 종양 체적의 더 균일 한 가열을 가능하게하는 주문 설계 레이저 기반 가열 설정을 사용하여 피하 종양을 가열하기위한 새로운 방법을 소개한다. MR 호환 엄마를 사용하여terials, 설치, 레이저 가열시 조직의 온도 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있도록, 작은 동물 MR 메이져의 보어 내에 맞도록 충분히 작다. MR 조영제, gadoteridol (GD-HP-DO3A)은, GD-HTLC라고도 CDDP (HTLC)의 감온 리포솜 제형에 CDDP와 공동으로 캡슐화하고, 실시간 미스터 열 모니터링 및 평가를 영상 유도 부활 약물 방출 가열 프로토콜의 검증. 우리의 결과는 MR 이미징을 통해 감시하면서, 레이저 기반의 가열 장치를 효율적 GD-HTLC 제제에서 캡슐화 된 제제의 방출을 활성화 함을 입증.

<table><tbody><tr><td>회전 증발기</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG</td><td>Laborota 4000</td><td></td></tr><tr><td>고압 압출기</td><td>Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>10ml thermobarrel</td></tr><tr><td>가열 순환기</td><td>VWR International LLC.</td><td>11305</td><td>압출기</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 멤브레인 필터</td><td>Whatman</td><td>110605에 연결됨; </td><td></td>110606</tr><tr><td>시차 주사 열량계 (DSC)</td><td>TA Instruments</td><td>Q100</td><td></td></tr><tr><td>Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer (ICP-AES)</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 7300DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments Ltd.</td><td>Nano-ZS</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양기</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-5800</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 상처 클립 애플리어</td><td>Becton Dickinson</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 상처 클립 제거제</td><td>Becton Dickinson</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>상처 클립</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631</td><td>9mm</td></tr><tr><td>763 nm 레이저 장치</td><td>Biolitec</td><td>Ceralas CD 403 레이저</td><td></td></tr><tr><td>프로브</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>FT400EMT</td><td>SMA 및 플랫 클리브 커넥터 포함</td></tr><tr><td>Spectralon(조명기)</td><td>Labsphere Inc.</td><td>FAST-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>CSTM-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td>7 Tesla 예비 자기 공명(MR) 이미징 시스템</td><td>Bruker Corporation</td><td>Biospec 70/30</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 온도 센서</td><td>LumaSense Technologies Inc.</td><td>Luxtron FOT 랩 키트</td><td></td></tr><tr><td>적분구</td><td>Newport Corporation</td><td>819C</td><td></td></tr><tr><td>광 파워 미터</td><td>Newport Corporation</td><td>1830-R</td><td></td></tr></tbody></table>

자기 공명 이미지 지침에 열성 리포좀에서 시스플라틴의 트리거 된 릴리스를위한 맞춤 설계 레이저 기반의 가열 장치

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

리포좀 향상된 통기성 및 전신 독성의 현저한 감소의 결과 체류 (EPR) 효과의 착취를 통해 고형 종양을 표적으로하는 약물 전달 체계로서 사용되어왔다. 그럼에도 불구하고, 리포좀에서 캡슐화 된 약물의 불충분 한 자료는 임상 효능을 제한하고있다. 온도에 민감한 리포좀은 한정된 종양 약물의 생체 이용률 문제를 극복하기 위해 약물의 부위 특이 적 방출을 제공하도록 설계되었다. 우리의 실험실 설계 및 고형 종양에서 CDDP의 트리거 릴리스를 제공하기 위해, HTLC로 알려진 시스플라틴의 열 활성화 온도 감응성 리포좀 제형 (CDDP)를 개발했다. 생체 내에서의 열 전달은 활성화 MR 체온계 (MRT)에 의해 확인 된 종양 부위에 균일 한 가열 패턴을 제공 맞춤형 레이저 기반의 가열 장치를 사용하여 뮤린 모델에서 달성되었다. 광섬유 온도 감시 장치는, 실시간으로 온도를 측정하는 데 사용 된레이저 파워를 번갈아 열 전달의 온라인 조정과 전체 가열 구간 동안. 약물 전달은 가열 프로토콜을 검증하는 종양 축적을 평가하는 수단으로서 감온 리포좀 내로 CDDP 함께 MR 조영제 (예 gadoteridol)의 공동 캡슐화하여 자기 공명 (MR) 화상의지도하에 최적화 하였다. 가열 프로토콜은 종래 HTLC 투여하고 20 분 가열 후 분사 5 분 예열 기간으로 구성되었다. 이 가열 프로토콜 밖 종양 및 근육에 비해 가열 종양에서 관찰 된 최고 MR 신호 변화 캡슐 제의 효과적인 방출 결과. 이 연구는 임상 전 열성 리포솜 개발 레이저 기반의 가열 장치 및 약물 전달의 최적화를위한 가열 프로토콜 MR 유도 검증의 중요성 성공적인 적용을 설명했다.

HTLC 리포좀은 지질 성막, 수화, 압출 및 투석을 포함하여 일반적인 방법을 사용하여 제조된다. CDDP 검은 침전물의 형성을 통해 비활성화되는 바와 CDDP 관련된 단계 동안주의 임의 알루미늄 재 CDDP에 노출되지 않도록주의하여야한다. HTLC의 그림은 그림 3에 표시됩니다. HTLC의 물리 화학적 특성은 최근 서방 (16)의 저널에 발표 된 논문에 요약 하였다. GD-HTLC 제형의 가돌리늄 백금 농도는 1.87 ± 0.28 ㎎ / ㎖ 및 0.10 ± 0.02 ㎎ / ㎖, 각각. 레이저 기반의 난방 설치의 조명은 10mm 직경의 출력 포트에서 균일 한 광 분포 (± 15 %)을 제공하는 세 개의 작은, 연결 챔버를 사용합니다. 레이저의 전력 설정에 따라 전력 측정 값으로, 1.7 W / cm 2로 0.5의 범위 내에서 전달된다D 보정 적분 구를 사용하여. 결과는 종양 취한 <stron...

MRI 호환 주문 설계된 레이저 기반의 가열 장치는 특히 종양 영역에서 감온 리포좀 제제로부터의 방출을 활성화하기 위해 피하 종양 국소 가열을 제공하기 위해 개발되었다.

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

이 절차의 전반적인 목표는 열 활성 리포좀 제형의 전달을 위해 피하 종양을 국소적으로 가열하는 데 사용할 수 있는 맞춤 제작 레이저 기반 가열 장치의 작동법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 지질막 형성, 수화 압출 및 투석을 통해 HTLC 제형을 준비합니다. 두 번째 단계에서는 공여 마우스에 자궁경부암 세포를 접종합니다.4~5주 후, 종양을 절제하여 조각으로 자른 뒤 수용 쥐에게 각각 이식합니다. 마지막 단계로, 레이저 기반 가열 시스템을 사용하여 수용 쥐의 종양을 42 °C로 국소 가열합니다. 이 레이저 기반 가열 장치는 MR 호환이 가능하여 광 조사 중 조직 온도의 변화를 모니터링할 수 있으며, 소형 및 휴대 가능하여 소동물 MR 보어 내부에서 종양을 쉽고 효과적으로 가열할 수 있습니다.최종적으로, 열 민감성 HTLC의 열 활성 방출은 실시간 자기공명영상으로 모니터링할 수 있습니다. 수조나 가열 카테터를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 열 치료 시작 후 1~2분 이내에 종양에 열을 전달하는 정형화된 방법을 제공하며, 레이저 출력을 실시간으로 조정하여 시술 중 온도 변동을 최소화할 수 있다는 점입니다. 저희는 HTLC 열 민감성 리포좀 제형으로 in vivo 연구를 시작했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.기존의 방법으로는 피하 종양에 효율적인 국소 가열을 제공할 수 없음을 확인했습니다. 리포좀 조제 과정은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 myung이 시연할 예정입니다. 리포좀을 조제하려면, 갓 조제한 지질 혼합물과 갓 조제한 지질 약물 혼합물을 결합한 후, 지질 혼합물이 수화되는 동안 15~20분마다 볼텍싱을 하며 1시간 동안 수화시킵니다. 200 nm 폴리카보네이트 필터 두 층을 사용하여 10 mL 압출기를 조립하고, 압출기의 써모 배럴을 70 °C로 설정된 순환 수조에 넣은 후 장치를 압축 질소 탱크에 연결합니다.수화 직후, 지질을 압출기 챔버로 옮기고 질소 흐름을 엽니다. 그런 다음 200 PSI 압력에서 리포좀을 멤브레인을 통해 압출하며, 70 °C 항온수조에 놓인 50 milliliter 원추형 튜브에 리포좀을 수집합니다. 리포좀을 5회 압출한 후, 장치를 분해하고 100 nanometer 폴리카보네이트 필터 두 겹으로 다시 조립합니다.압력을 400 PSI로 설정하고 방금 시연한 대로 리포좀을 10회 압출합니다. 마지막 압출 단계에서 리포좀을 15 milliliter conical tube에 수집하여 실온까지 식힌 후, 원심분리를 통해 불용성 cisplatin을 침전시킵니다. 그 다음, 멸균 조건 하에서 15,000 molecular weight cutoff의 투석 튜브를 사용하여 0.9% saline에 대해 리포좀을 하룻밤 동안 투석합니다. 자궁경부암 제논그라프트(xenograft)를 이식하기 위해, 90% confluent 배양액에서 180개의 세포를 수확하고 hemo를 사용하여 생존 가능한 자궁경부암 세포 수를 측정합니다.유세포 분석기(Cytometer)를 사용한 후, 세포를 100 µL당 1 × 10⁶ cells의 농도로 희석합니다. 모든 동물 실험은 Star Innovation Center에서 수행되었습니다. 캘리퍼스를 사용하여 뒷다리 비복근에 근육 내 주사로 암컷 SCID 마우스에 접종하고, 종양의 가장 긴 직경이 9~12 mm에 도달할 때까지 종양 크기를 측정합니다. 그 후 공여자 마우스에서 종양을 절제하고 2~3 mm³ 크기의 조각으로 잘게 다집니다.이제 수용 동물의 왼쪽 뒷다리 털을 깎고 노출된 피부에 절개창을 냅니다. 공여 종양 조각 하나를 절개창을 통해 피하로 삽입하고, 이식 3~5일 후에 1~2개의 상처 클립을 사용하여 피부를 봉합합니다. 클립을 제거하고 종양이 2~3주 동안 성장하도록 하여 열처리를 수행합니다.먼저, 레이저 파이버의 한쪽 끝을 레이저 장치에 연결하고 다른 쪽 끝을 조사기에 연결합니다. 다음으로, 마취된 수 recipient 마우스의 꼬리 외측 정맥에 27 gauge 주입 카테터를 삽입한 후, 종양 중심부에 22 gauge 카테터를 삽입합니다. 그런 다음 중공 카테터 내에 광섬유 온도 프로브를 넣어 온도 변화를 모니터링하고, 조사기로 종양 전체를 덮습니다. 완료.전력을 0.8~1W로 설정한 후 레이저를 켜고 온도가 상승할 때까지 기다립니다. 치료 과정 동안 레이저 전력을 0.1~0.8W 사이에서 수동으로 조절하여 종양의 온도를 42°C로 유지하며, 이는 열 처리된 종양의 단면 이미지에 잘 나타나 있습니다. 총 전력이 1W라고 가정할 때, 종양 내 어느 지점에서든 최대 플루언스율(fluence rate)은 70mW/cm²이며, 피부 깊이에서의 종양 내 플루언스율은 최대 플루언스율의 50%로 측정되었으며, 이는 양성자 공명 주파수 이동(proton resonance frequency shift) 기반의 자기공명 온도 측정 가열법으로 확인되었습니다. 레이저 기반 가열 장치를 사용하면 이미지에 표시된 것처럼 비교적 균일한 온도 분포 지도가 생성되며, 이는 점광원에 의한 가열 전 획득한 절대 기준 측정값으로부터의 상대적인 온도 변화를 추적한 것입니다. 자기공명 신호 분석 결과, gad HTLC 투여 후 가열된 종양은 가열되지 않은 근육 조직에 비해 가장 높은 상대적 신호 증가를 보였으며, 이 신호는 가열 기간이 끝날 때까지 유지되었습니다. 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행했을 때 15분 이내에 설정할 수 있으며, 이는 열 민감성 리포좀 제형의 전임상 평가를 위한 유용한 도구가 됩니다.Class 4 레이저를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 안전 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

두개골이 노출된 마취된 인간 환자부터 시작하십시오. 환자는 두개내 종양 진단을 받았습니다.노출된 두개골에 구멍을 뚫어 접근 지점을 생성합니다.정위 유도를 사용하여 미리 결정된 경로를 따라 레이저 확산 섬유 또는 LDF를 삽입하고 제자리에 고정합니다.환자를 MRI 스캐너로 옮기고 LDF를 레이저 소스에 연결합니다.여러 각도에서 MRI 이미지를 캡처하여 섬유 경로와 종양을 시각화합니다.이를 통해 LDF가 종양 근처에 배치되었는지 확인하여 레이저 시술을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.종양 경계 내에서 가열을 제한하고 주변 조직을 보존하기 위해 목표 열 보호 지점을 설정합니다.집중된 열 에너지가 종양 세포 사멸을 일으키는 동안 레이저 절제를 시작합니다.최대 절제를 달성한 후 레이저를 중단하십시오.후속 MRI를 수행합니다. 감소된 종양 크기는 열 손상 정도를 확인하여 열 치료의 치료 가능성을 검증합니다.

인간 환자의 두개내 종양 절제술을 위한 레이저 간질 온열 요법

우리는 이와 같은 강력한 광열 치료 에이전트 기능, 구조에 의존 형광 자기 담금질 독특한 광열 속성이 porphysomes라는 새로운 내장 다기능 nanovesicles을 개발. 우리는 고압 압출을 사용하여 porphysomes을 공식화하고 이종 이식 종양 모델에서 자신의 광열 치료 효과를 조사 하였다.

한 분, Porphysomes를 사용하여 하위 한 와트 광열 종양 절제, 내장 다기능 Nanovesicles

이 프로토콜은 시판중인 물질과 광 반응 형 리포좀 집적 금 나노 입자에 대한 간단한 제조 방법을 설명하는데 이용된다. 또한, 펄스 레이저의 치료에 합성 리포좀 마이크로 버블 공동화 과정을 측정하는 방법을 보여준다.

펄스 레이저인가 전압에 따라 금 나노 입자 통합 사진 응답 리포좀과 그들의 마이크로 버블 공동 현상의 측정의 합성

이 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서 미세유체 장치를 사용하여 열감도 리포좀을 준비하기 위한 최적화된 파라미터를 제시합니다. 이것은 또한 리포솜으로 독소루비신과 인도시아닌 녹색의 공동 캡슐화와 통제/트리거된 약물 방출을 위한 독소루비신의 광열 트리거 방출을 허용합니다.

리소리피드 함유 온도 민감성 리포좀의 미세유체 생산

여기에 제시된 자기 조립을 통한 산화철 나노입자 껍질 마이크로버블(NSM)의 제조를 위한 프로토콜이 제시되어, 자기 고열증 및 광열 병용 암 치료를 위한 하나의 나노치료 플랫폼에서 자기 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 시너지 효과를 낼 수 있다.

자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블

이 프로토콜은 정교한 전달 및 모니터링 시스템을 사용하여 자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다.

맞춤형 전달 시스템을 사용한 자성 나노입자 온열요법의 체외 및 생체 내 전달

여기에 제시된 프로토콜은 횡문근육종 마우스 모델에서 온도에 민감한 리포솜에서 약물 방출을 유발하기 위해 자기 공명 유도 고강도 집속 초음파에 의해 생성된 제어된 온열요법을 사용하는 프로토콜입니다.

자기 공명 유도 고강도 집속 초음파 생성 온열요법: 쥐 횡문근육종 모델에서 실현 가능한 치료 방법

열플라즈몬 천공법은 공초점 현미경, 광학 핀셋 및 금 나노 입자를 통합하여 세포 및 거대 단층 소포에서 원형질막 복구 중 단백질 반응을 연구합니다. 이 기술은 빠르고 국소적인 막 천자를 가능하게 하여 복잡한 원형질막 수리 기계에서 주요 단백질과 그 기능적 역할을 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

교모세포종은 파괴적인 형태의 원발성 뇌암이며, 레이저 간질성 열 요법은 수술이 불가능한 교모세포종에 대한 기존 외과적 절제술의 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 치료 효과 또는 보조 및 조합 치료를 연구하는 데 사용할 수 있는 최적화된 전임상 마우스 모델을 설명합니다.

교모세포종의 레이저 간질성 열처리 치료를 위한 면역 역량 있는 쥐 모델

이 프로토콜은 고형 종양 모델에서 표적 온열 요법에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다. 이 접근법은 종양 내 주입된 금 나노로드에 의한 근적외선의 광열 변환을 활용하여 종양 미세 환경 내에서 국부적인 가열을 유도합니다.

종양내 금 나노로드에 의한 근적외선의 광열 변환을 통한 쥐 종양 모델에서 표적 경미한 온열요법 유도

학습하세요 자궁경부암 종양을 대상으로 한 맞춤형 레이저 가열 장치를 이용한 열감응성 리포좀 약물 전달 방법을. 이 기술은 실시간 MRI 온도 모니터링으로 정확한 국소 가열을 가능하게 합니다.

자기 공명 이미지 지침에 열성 리포좀에서 시스플라틴의 트리거 된 릴리스를위한 맞춤 설계 레이저 기반의 가열 장치

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