자기 공명 이미지 지침에 열성 리포좀에서 시스플라틴의 트리거 된 릴리스를위한 맞춤 설계 레이저 기반의 가열 장치

이 절차의 전반적인 목표는 열 활성 리포좀 제형의 전달을 위해 피하 종양을 국소적으로 가열하는 데 사용할 수 있는 맞춤 제작 레이저 기반 가열 장치의 작동법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 지질막 형성, 수화 압출 및 투석을 통해 HTLC 제형을 준비합니다. 두 번째 단계에서는 공여 마우스에 자궁경부암 세포를 접종합니다.

4~5주 후, 종양을 절제하여 조각으로 자른 뒤 수용 쥐에게 각각 이식합니다. 마지막 단계로, 레이저 기반 가열 시스템을 사용하여 수용 쥐의 종양을 42 °C로 국소 가열합니다. 이 레이저 기반 가열 장치는 MR 호환이 가능하여 광 조사 중 조직 온도의 변화를 모니터링할 수 있으며, 소형 및 휴대 가능하여 소동물 MR 보어 내부에서 종양을 쉽고 효과적으로 가열할 수 있습니다.

최종적으로, 열 민감성 HTLC의 열 활성 방출은 실시간 자기공명영상으로 모니터링할 수 있습니다. 수조나 가열 카테터를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 열 치료 시작 후 1~2분 이내에 종양에 열을 전달하는 정형화된 방법을 제공하며, 레이저 출력을 실시간으로 조정하여 시술 중 온도 변동을 최소화할 수 있다는 점입니다. 저희는 HTLC 열 민감성 리포좀 제형으로 in vivo 연구를 시작했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

기존의 방법으로는 피하 종양에 효율적인 국소 가열을 제공할 수 없음을 확인했습니다. 리포좀 조제 과정은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 myung이 시연할 예정입니다. 리포좀을 조제하려면, 갓 조제한 지질 혼합물과 갓 조제한 지질 약물 혼합물을 결합한 후, 지질 혼합물이 수화되는 동안 15~20분마다 볼텍싱을 하며 1시간 동안 수화시킵니다. 200 nm 폴리카보네이트 필터 두 층을 사용하여 10 mL 압출기를 조립하고, 압출기의 써모 배럴을 70 °C로 설정된 순환 수조에 넣은 후 장치를 압축 질소 탱크에 연결합니다.

수화 직후, 지질을 압출기 챔버로 옮기고 질소 흐름을 엽니다. 그런 다음 200 PSI 압력에서 리포좀을 멤브레인을 통해 압출하며, 70 °C 항온수조에 놓인 50 milliliter 원추형 튜브에 리포좀을 수집합니다. 리포좀을 5회 압출한 후, 장치를 분해하고 100 nanometer 폴리카보네이트 필터 두 겹으로 다시 조립합니다.

압력을 400 PSI로 설정하고 방금 시연한 대로 리포좀을 10회 압출합니다. 마지막 압출 단계에서 리포좀을 15 milliliter conical tube에 수집하여 실온까지 식힌 후, 원심분리를 통해 불용성 cisplatin을 침전시킵니다. 그 다음, 멸균 조건 하에서 15,000 molecular weight cutoff의 투석 튜브를 사용하여 0.9% saline에 대해 리포좀을 하룻밤 동안 투석합니다. 자궁경부암 제논그라프트(xenograft)를 이식하기 위해, 90% confluent 배양액에서 180개의 세포를 수확하고 hemo를 사용하여 생존 가능한 자궁경부암 세포 수를 측정합니다.

유세포 분석기(Cytometer)를 사용한 후, 세포를 100 µL당 1 × 10⁶ cells의 농도로 희석합니다. 모든 동물 실험은 Star Innovation Center에서 수행되었습니다. 캘리퍼스를 사용하여 뒷다리 비복근에 근육 내 주사로 암컷 SCID 마우스에 접종하고, 종양의 가장 긴 직경이 9~12 mm에 도달할 때까지 종양 크기를 측정합니다. 그 후 공여자 마우스에서 종양을 절제하고 2~3 mm³ 크기의 조각으로 잘게 다집니다.

이제 수용 동물의 왼쪽 뒷다리 털을 깎고 노출된 피부에 절개창을 냅니다. 공여 종양 조각 하나를 절개창을 통해 피하로 삽입하고, 이식 3~5일 후에 1~2개의 상처 클립을 사용하여 피부를 봉합합니다. 클립을 제거하고 종양이 2~3주 동안 성장하도록 하여 열처리를 수행합니다.

먼저, 레이저 파이버의 한쪽 끝을 레이저 장치에 연결하고 다른 쪽 끝을 조사기에 연결합니다. 다음으로, 마취된 수 recipient 마우스의 꼬리 외측 정맥에 27 gauge 주입 카테터를 삽입한 후, 종양 중심부에 22 gauge 카테터를 삽입합니다. 그런 다음 중공 카테터 내에 광섬유 온도 프로브를 넣어 온도 변화를 모니터링하고, 조사기로 종양 전체를 덮습니다. 완료.

전력을 0.8~1W로 설정한 후 레이저를 켜고 온도가 상승할 때까지 기다립니다. 치료 과정 동안 레이저 전력을 0.1~0.8W 사이에서 수동으로 조절하여 종양의 온도를 42°C로 유지하며, 이는 열 처리된 종양의 단면 이미지에 잘 나타나 있습니다. 총 전력이 1W라고 가정할 때, 종양 내 어느 지점에서든 최대 플루언스율(fluence rate)은 70mW/cm²이며, 피부 깊이에서의 종양 내 플루언스율은 최대 플루언스율의 50%로 측정되었으며, 이는 양성자 공명 주파수 이동(proton resonance frequency shift) 기반의 자기공명 온도 측정 가열법으로 확인되었습니다. 레이저 기반 가열 장치를 사용하면 이미지에 표시된 것처럼 비교적 균일한 온도 분포 지도가 생성되며, 이는 점광원에 의한 가열 전 획득한 절대 기준 측정값으로부터의 상대적인 온도 변화를 추적한 것입니다. 자기공명 신호 분석 결과, gad HTLC 투여 후 가열된 종양은 가열되지 않은 근육 조직에 비해 가장 높은 상대적 신호 증가를 보였으며, 이 신호는 가열 기간이 끝날 때까지 유지되었습니다. 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행했을 때 15분 이내에 설정할 수 있으며, 이는 열 민감성 리포좀 제형의 전임상 평가를 위한 유용한 도구가 됩니다.

Class 4 레이저를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 안전 고글 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.