Name: 효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기 2 O 2 신장에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 효소 바이오센서를 이용해 신장 조직에서 ATP와 H₂O₂를 실시간 정량화하는 방법을. 이 기술은 세포 신호 전달 메커니즘 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 본 논문에 사용 된 센서를 개발에 자신의 작품에 대한 Sarissa의 생명을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 국립 심장, 폐에 의해 지원되었다, 및 혈액 연구소는 HL108880 (A. Staruschenko)를 부여, HL 116,264 (A. 카 울리) 및 HL 122,662 (A. Staruschenko 및 A. 카 울리)의 의과 대학 재정 지원 사업 위스콘신 연구 업무위원회 # 9306830 (O. Palygin)과 건강한 위스콘신 연구 및 교육 프로그램 # 9520217를 전진, 국립 신장 재단의 젊은 연구자 그랜트 (O. Palygin).

실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 부착 된 다음 동물 절차. 이전 승인 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)로부터 얻은 것입니다. 참고 : 센서 제조업체 지침의 검토는 실험 설계 및 사용 전에 동안 수행해야합니다. 센서를 사용하는 경우이 지침을 따르는 것은 최적의 결과를 생성합니다. 1. 센서 교정 <ol><li> 실험 시작 전에 신선한 원액을 준비한다. </li><li> 10 mM의 NAPI 버퍼, 100 mM의 NaCl을, 1 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 글리세롤을 포함하는 버퍼를 작성합니다. NaOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li><li> -20 ℃에서 보관 콘텐츠 ATP 농도 (100 mm)를 사용하여, 버퍼 A. 90 μL에 10 μL 스톡을 첨가하여 10 mM의 ATP 신선한 교정 액을 만들 </li><li> T에의 팁 (그림 2)을 배치하여 ATP 센서를 재수2-8 ℃에서 적어도 10 분 동안 버퍼를 포함하는 그 재수 챔버. 주 : 재수 후, 센서는 20 초 동안 공기에 노출되지 않아야하거나, 센서의 감도가 감소 될 수있다. 공기에 장시간 노출이 예상되는 경우, 글리세롤의 솔루션으로 간단히 센서를 찍어. 센서는 여러 실험을 위해 사용될 수 있지만, 이들은 센서 재수 같은 날에 발생한다. 센서는 최대 24 시간 동안 완충액 A와 재수 화 챔버 내에 저장 될 수있다. </li><li> 듀얼 채널 텐쇼 (그림 3)의 전원을 켜고 녹화 시스템 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 버퍼 A. 찾는 3 ㎖ 교정 챔버로 기준 전극과 교정 챔버를 준비한다. 다음, 재수 실에서 각 센서를 가지고 조작에 부착하고 교정 실 솔루션에 삽입합니다. 참고 : 교정 실 같은 표준 실리콘 코팅 된 배양 접시를 사용합니다. 모든 교정과 일을 수행고성능 실험실 공기 테이블에 패러데이 케이지 udies는 amperometry 녹음 (그림 4) 동안 신호의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 교정은 가장 가능한 데이터 수집의 시작에 가깝게 수행됩니다. 생체 내 응용을 위해 교정을위한 최적의 시간은 동물의 수술 후 회복 기간이다. </li><li> 예 생체 내 교정 <ol><li> 10 사이클 100 mV / 초의 속도에서 +500 MV에 -500 mV 이상 센서를 순환시킴으로써 교정 챔버 내의 순환 전압 전류 법을 수행한다. 이것은 크게 센서의 감도를 향상시킨다. 10 사이클에서 관찰 된 흔적은 그림 5를 참조하십시오. </li><li> 마지막주기 후 600 MV에 센서를 극화. 센서 전류 점근선에 소멸한다. 꾸준한 독서는 최소 5 분 후에 얻을 수있다. 제로 값을 기록한다. </li></ol></li><li> 생체 센서 교정 <ol><li> 생체 열차에 순환 전압 전류를 수행하지 마십시오RS. 대신, MV +500 30 초 동안 챔버 내의 교정을 편광 센서. 그 다음에 0 MV 텐쇼를 설정하고, 센서 전류 점근선까지 상승 할 수있다. 센서 전류는 점근선에 적어도 2 분 소요됩니다. 제로 값을 기록한다. </li></ol></li><li> 연속적으로 원하는 검출 범위를 포괄 검량선을 제조 챔버로 ATP 용액의 양 세트를 추가한다. ATP가 챔버 전체에 고르게 확산로서 ATP 용액 붕괴 뒤에 처음 센서 신호에서 날카로운 피크를 생성한다. 기록 신호 값은 신호 레벨이되면. 각 ATP 첨가 후도 6a 및도 7 트레이스 안정화 각각 생체 내 연구 모두에 대한 생체 외 및 ATP의 농도를 제안했다. 주 : 분석 물 거제를 사용하여 전극의 선택성을 확인하는 것이 중요하다. 본 프로토콜은 H &lt;대한 ATP 센서와 카탈라아제의 특이성을 테스트 apyrase 사용서브&gt; 2 O 2 신호 (도 6B). 약물이 투여되는 경우, 센서와의 반응성 측정을 연구하기 전에 결정되어야한다. </li><li> ATP 센서 (제로 수준 (그림 7)로 감소한다 ATP 응용 프로그램에 의해 생성 된 전류의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖ (89 UN / mg)의 재고에서 apyrase의 3 μl를 추가합니다. </li><li> (2 O 2 응용 프로그램이 제로 독서로 감소한다 (H)에 의해 생성 된 전류) ​​널 센서의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖의 재고 (100 UN / mg)을에서 카탈라아제의 3 μl를 추가합니다. </li></ol> 센서 연구 2. 동물 수술 <ol><li> 생체 수술 <ol><li> 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. (12) 동물이 지속적으로 마취의 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링해야합니다 (15)를 제공합니다. 세인트수 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다. 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사 :합니다. 모든 비 생존 절차의 완료시 동물 (12)의 인간적인 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. </li><li> 앙와위에서 온도 조절 수술대에 쥐를 놓습니다. 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 왼쪽 신장에 부합하는 약 5cm의 정중선을 절개하고 원위 복부 대동맥을 노출. </li><li> 복강 및 상 장간막 동맥, 이러한 동맥 위의 복부 대동맥 주위에 끈을 감싸하지만 결찰하지 않습니다. 신장 동맥 아래 복부 대동맥 주위에 두 개의 합자를 감싸. </li><li> 합자 위의 복부 대동맥을 클램프. 낮은 합자 넥타이. 폴리에틸렌 관 (PE50)와 복부 대동맥을 카테 테르를 꽂다. 두 번째 대동맥 결찰로 카테터를 고정. </li><li> 클램프를 제거하고 장간막과 복강 동맥을 결찰. 신장이 완전히 희게 때까지 2-3 분 동안 실온에서 행크스 균형 염 용액 6 ml / 분으로 신장을 관류. </li><li> 대동맥의 일부를 접속 신장 및 카테터를, 절제. 목욕 솔루션으로 가득 3 ㎖ 페트리 접시에 신장을 놓습니다. 주 : 실험 프로토콜은 RT에서 수행 될 수있다. (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl 2, 1 염화칼슘 2, 10 HEPES, NaOH로 pH를 조정 7.35 : 목욕 솔루션은 mm 단위가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> 생체 수술 <ol><li> 승인 IACUC 프로토콜을 사용하여 랫트를 마취. 생체 분석을 위해 케타민와 쥐 (20 ㎎ / ㎏ 임) 및 inactin (50 ㎎ / ㎏ IP)을 마취. 동물은 계속적으로 마취 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링되어야한다. 안정된 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 적절한 마취 깊이는 취득 후에드, 공기 테이블에있는 온도 조절 접지면에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 표면을 예열하고 36 ℃로 유지되어야한다. </li><li> 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 신장에 맞춰 중간 선 절개를 약 5cm합니다. </li><li> 편향 및 전체 신장이 보이도록 피부와 피하 조직을 고정하는 봉합사를 사용한다. 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 신장 컵에서 신장을 놓습니다. </li><li> 혈액량을 유지 경정맥을 통하여 1 ㎖ / 100g의 / hr이고 0.9 %의 NaCl : 2 % BSA의 IV 주입을 사용한다. 소변 수집을위한 두 요관을 Cannulate. 장소 장간막과 복강 동맥 주변의 관계 및 신장 관류 압 (도 10a)의 조작을위한 원심 aortal. </li><li> 약학 제제의 적용은 생체 내 실험을하는 동안 필요하다면, 간질 카테터 삽입 (도 10B 추천 </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. 데이터 수집 설정 <ol><li> 데이터 수집 프로그램을 열고 모두 생체과 양극 긍정적으로 생체 실험에서 극성을 설정합니다. ASCII 코드로 데이터를 저장하는 프로그램을 설정합니다. </li><li> 신장에 센서의 빠른 삽입을위한 미세 조작기를 놓습니다. 참고 : 또는 센서의 원하는 위치를 달성 할 수 있도록 미세 조작기에 부착 된 더미 프로브를 사용합니다. </li><li> 생체 데이터 취득 <ol><li> / 분으로 650 μL의 일정한 속도로 대동맥을 통해 캐 뉼러 (2.1.6)에서 욕조 용액 신장을 관류. 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 센서 삽입에 필요한 신장 캡슐을 제거합니다. </li><li> 고무 밴드 신장을 통해 묶여 핀과 실리콘 코팅 접시에 부착와 신장을 고정합니다. </li><li> 그 팁에 빠져들와 페트리 접시에 신장에 가까운 기준 전극을 배치완충 용액. </li></ol></li><li> 생체 데이터 취득에 <ol><li> 신장 컵에서 신장을 놓습니다. 동물의 변형 및 연령에 따라. 느슨하게 신장 보유 컵의 크기를도 8을 사용하여 신장 컵의 크기를 두 도표. 유사 컵 그러한 micropuncture 등 16 신장 기능의 분석에 집중 다른 생리적 접근을 위해 사용된다. 신장 컵의 위치는 동물의 호흡에 의해 생성 된 기계적인 노이즈를 제거하는 것이 중요하지만, 방해 또는 신장 관류 또는 소변의 흐름을 차단하지 않아야합니다. </li><li> 데이터 수집을 수행하기 전에 복구 시간이 45 분을 허용한다. </li><li> 26-30G 바늘을 사용하여, 신장에서 센서의 위치 및 소정의 깊이에 천공 구멍을 만든다. 스며 혈액을 제거하기 위해 표면에 구멍을시킨다. 신장의 표면에 글리세롤 솔루션을 추가합니다. 이 실험 기간 동안 마르지 신장 표면을 방지 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 재수 실에서 제 1 센서를 제거하고는 미세 조작기에 연결합니다. 신속, 20 초 이내에, 신장에서 갓 만든 구멍에 전극을 삽입합니다. 반복 널 센서 3.5-3.9 단계를 반복합니다. </li><li> 센서에서, 신장에 약 1cm를 기준 전극을 삽입합니다. </li></ol></li><li> 텐쇼의 전원을 켜고 컴퓨터에 기록 프로그램을 활성화합니다. (9) 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다. (10)가 삽입 된 카테터와 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 기원 또는 임의의 다른 유사한 소프트웨어에 ASCII 데이터 파일을 가져. </li><li> 농도 현재 관계 <ol><li> 전류에 선형 농도 (X- 축)을 구축하기 위해 ATP 또는 H 2 (Y시킴으로써 행한다)의 관계를 선형 피팅 / 외삽 기능을 사용하여 </suB&gt; O 2 교정 점 (도 6 및도 7). 선형 피팅 라인 : Y = MX + B </li></ol></li><li> 농도 전류 동일시 </li><li> 세포 내 ATP에 의해 생성 된 실제 전류를 얻기 위해 ATP 센서들로부터 널 센서의 측정 흔적을 뺀다. </li><li> 4.2.1에 설명 된 교정 방정식을 사용하여 nm의 amperometry에 의해 얻어진 포장 된 ATP 값을 변환합니다. &quot;X&quot;값으로 각각 조정 전류를 가져 오기 및 Y (분석의 농도)에 대한 해결하여 ATP 센서의 감산 데이터 트레이스의 농도를 결정합니다. </li><li> 필요한 경우 유사하게, 그것의 교정 식 H 2 O 2 농도를 계산한다. </li></ol>

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</ol>

이 원고의 비디오 녹화 센서는 Sarissa 생명 한정판 (코번 트리, 영국)에 의해 제공되었다.

본 프로토콜은 ATP의 향상된 시간과 공간 분해능을 제공하기 위해 개발 된 생체 관류, 격리 및 생체 내에서 혈액 관류 신장을위한 H 2 O 2 신호가. 여기에 사용되는 프로토콜과 센서 간의 차이는 약리학 적 또는 생리 학적 연구 제제 중 최적 데이터 수집을 제공한다. 프로토콜 1) 센서 교정, 2) 외과 적 절차, 3) 데이터 획득 설정, 4) 데이터 분석 이루어져있다. 이들은 수많은 실험 조건에 대한 분석 물질의 실시간 측정을 가능하게한다. 이것은 큰 신장 질환에 대한 통찰력과보다 효과적인 약물 치료의 발전으로 이어질 것입니다. 여기서 우리는 ATP와 H 2 O 2를 분석하는 센서를 사용했다. 그러나, 다른 물질 센서도 사용할 수 있습니다 및 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 래트 신장에서 ATP 및 H 2 O 2를 연구하기 위해 적용되지만 동일한 운전 방식 하...

(또한 본 원고에서 센서로 참조) 효소 미세 바이오 센서는 세포와 조직 생활에 동적 신호 전달 과정을 연구하기위한 유용한 도구가되고있다. 센서는 생물학적으로 관련 농도에서 세포 신호 분자의 시공간적 해상도를 증가 제공합니다. 대신 샘플링하고 장시간 간격에서 찍은 세포 외 체액을 분석하는 그들의 효소 분석 물에 반응으로, 이들 센서하여 실시간 측정 1,2- 제조, 빠르게 반응한다. 퓨린 또는 과산화수소 및 그들의 방출 역학 같은자가 분비 및 주변 분비 인자의 농도의 격자 간 고속 검출은 정상 및 병리학 적 상태 (3)에 약물의 효과에 대한 프로파일을 구축하는 데 사용될 수있다. 현재의 센서를 사용하는 애플리케이션의 대부분은 뇌 조직 슬라이스 및 세포 배양 4-10에왔다. 이 논문의 목적에 자세히 프로토콜정확하게 전체 신장의 분석을 실시간으로 농도를 측정하는 수단을 설치한다. 다음 프로토콜은 간질 ATP와 H 신장 2 O 2 신호를 연구하기 위해 개발되었다. 신장의 네이티브 환경에서 세포 외 ATP 빠르게 그 유도체 (ADP, AMP 및 아데노신)로 내인성 ectonucleotidases에 의해 이화됩니다. 여기에 사용 된 센서는 다른 퓨린 또는 ATP 분해물 11 위에 ATP에 매우 선택적이다. 이 ATP 릴리스 및 신호 함수의 상수 및 동적 농도를 정확하게 모니터링 할 수 이것은 큰 장점을 제공합니다. 간질 ATP 농도는 두 개의 마이크로 전극의 조합, ATP 센서 및 null 센서를 사용하여 측정된다. 카탈라제 애플리케이션과 함께 널 센서 간질 H 2 O 2 농도 12을 검출 할 수있다. 다음 프로토콜은 열차의 두 개의 서로 다른 디자인을 사용하여중 생체 또는 생체 내 응용 프로그램에서 최적의 특성을 가지고 RS. 두 가지 설계는 효소 센서 층에 함유 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 인산 옥시 다제의 연속 촉매 반응에 기초하고 있으며 ATP의 존재에 의해 구동된다. 생체 외 연구에 사용 된 센서의 세트, H 2 O 2, 최종 효소 반응 생성물에서, 백금 / 이리듐 (PT-IR), 와이어 전극의 산화에 의해 검출된다. 생체 내 연구를위한 센서 대신에 혈액 관류 조직을 위해 설계 중재자 코팅 된 금 전극에 2 O 2의 감소 (H)을 기반으로합니다. 이 논문에 기술 된 두 프로토콜의 방식은 그림 1에서 보여진다. 이 효소 결합 결여 제외 널 센서는 해당 센서 ATP와 동일하다. 따라서, 카탈라제 효소로 H 2 O (2)의 검출에 더하여, 널 센서 MEAsures 비특이적 간섭. ATP 농도는 널이 비특이적 간섭과 ATP 센서 신호로부터 배경 H 2 O 2를 감지 빼서 계산한다. 여러 센서는 해당 널 (null)와 결합 할 때 생체에 대한 아데노신, ionosine, 하이포크 산틴, 아세틸 콜린, 콜린, 글루타민산, 포도당, 젖산, 생체 응용 프로그램이나 아데노신, ionosine을위한 D- 세린 및 하이포크 산틴을 포함하여 다른 분석을 감지 상업적으로 이용 가능하다 센서. 정확하게 분석 물을 검출하는 센서의 기능은 적절한 교정 전후 13에 의존한다. 이 분석은 생물학적 조직의 사용 중에 발생하는 센서의 감도의 편차를 차지하는 것을 보장한다. 센서는 센서 효소 반응에서 시약으로서 사용되는 글리세롤의 저장소를 보유하고있다. 센서를 포함하는 조 글리세롤 용액에 사용되지 않는 경우, 시간이 지남에 따라 세척한다. 짧은 Recording 시간은 센서 드리프트를 최소화 할 필요가있다. 또한 크게 센서 (14)의 감도를 감소시킬 수있는 내인성 단백질 분해 효소 및 단백질 절편으로 오염 센서. 본 원고는 생체 외 및 생체 신장에 효소 제제 미세 바이오 센서의 사용을 설정한다. 실시간 분석 정량 신장 질환 및 약리 에이전트의 메커니즘에 새로운 통찰력을 공개 할 수 세포 신호 전달의 전례가없는 세부 사항을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>센서 키트</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>이 키트에는 저장 병, 재수화 챔버, 전극 리드 및 참조 전극이 포함되어 있습니다. 또한 키트에는 사용자가 선택할 수 있는 센서가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP 바이오센서 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>사용 전 2-8 oC에서 보관</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>사용 전 2-8 oC에서 보관</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null 센서 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>사용 전 2-8 oC에서 보관</td></tr><tr><td>Sarissagold 널 센서 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>사용 전 2-8 oC에서 보관</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP 매뉴얼</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>패러데이 케이지&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>듀얼 채널 전위차조절기</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II 패러데이 케이지</td></tr><tr><td>데이터 수집 프로그램</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>모델 R99E</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 조명기</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>미세 조작기</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터 마그네틱 스탠드</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>이소 플루란 인공 호흡기</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3ml 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>산타 크루즈</td><td></td><td>26-30G</td></tr><tr><td>핀</td><td></td><td></td><td>표준 해부 핀</td></tr><tr><td>카테터</td><td></td><td></td><td>폴리에틸렌 튜브 (PE50)</td></tr><tr><td>카테터 조직 접착제</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td></td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>고무 밴드</td><td></td><td></td><td>2-4mm 너비의 고무 밴드</td></tr><tr><td>실리콘</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>표준 해부 키트</td><td></td><td></td><td>키트에는 메스와 해부 시저가 포함되어야 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>자체 설계</td>표준 화학 물질의 <td>신장 컵</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP 용액</td></tr>, <tr><td>과산화수소</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>아피 라제</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 atp 또는 h를 정량화하기<sub&gt; 2</sub&gt; o<sub&gt; 2</sub&gt; 신장에

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

효소 미세 바이오 센서가 널리 실시간으로 세포 외 시그널링을 측정하는 데 사용되어왔다. 그 사용의 대부분은 뇌 조각 및 신경 세포 배양에 국한되고있다. 최근에,이 기술은 전체 기관에 적용되었다. 센서 설계의 발전은 혈액 관류 생체 신장에서의 세포 신호의 측정을 가능하게했다. 본 프로토콜은 쥐의 신장 간질의 ATP와 H 2 O 2 신호를 측정하는 데 필요한 단계를 나열합니다. 두 개의 개별 센서 디자인에 대한 생체 외 및 생체 내 프로토콜을 사용한다. 센서의 두 가지 유형은 빠른 응답, 민감하고 선택적 바이오 센서를 제공하기 위해 침투 선택성 층 위에 얇은 효소 biolayer로 코팅되어있다. 침투 선택성 층은 생체 조직 내의 간섭 물질로부터의 신호를 보호하고, 효소 층은 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 진료 기관 연합의 연속 촉매 반응을 이용하는ATP의 존재 phate 다제는 H 2 O 2를 생성한다. 생체 연구에 사용되는 센서의 세트는 더 백금 / 이리듐 (PT-IR) 와이어 전극에 H 2 O 2의 산화에 의한 분석을 감지했습니다. 생체 내 연구 센서 대신 혈액 관류 조직을 위해 설계 매개 코팅 금 전극 상 H 2 O (2)의 감소에 기초한다. 최종 농도 변화를 분석 알려진 농도로 보정 한 다음 실시간 amperometry에 의해 감지됩니다. 또한, 전류 측정 신호의 특이성은 O 2와 H 2 ATP 대응 분해 같은 카탈라제 등의 효소와 apyrase의 첨가에 의해 확인 될 수있다. 이 센서는 이전과 각 실험 후 정확한 교정에 크게 의존하고있다. 다음 두 프로토콜은 ATP와 H 2의 실시간 검출에 대한 연구를 확립신장 조직에서의 O 2를, 또한 다른 생물학적 제제 또는 전체 기관에서 사용하기위한 상술 한 방법을 확장하도록 변형 될 수있다.

효소 미세 바이오 센서의 설계는 전체 신장의 분석 물질의 실시간 검출 할 수있다. 어느 생체 외 또는 생체 내 연구에서 일반적인 실험 디자인이 사용될도 1 국지적 센서에 도시되고, 수술 절차는 연구 하는가에 따라 달라 생체 외 또는 생체 내에서이다. 재현 가능한 결과, 정확한 사전 및 사후 교정을 얻으려면입니다 중요.도 6a는 교정하는 동안 생체 ATP 센서에서 본 신호의 대표 추적을 보여줍니다. 신속하게 apyrase 참고 ATP 신호를 제거. 카탈라제는 ATP 신호에 미치는 영향은 없습니다이 생성 H 2 O 2 (그림 6B)에 그 특이성을 보여줍니다. 교정 과정에서 VI. ATP의 동적 변경 (도 6A, 오른쪽 패널)을...

효소 마이크로전극 바이오센서는 생물학적으로 관련된 농도에서 세포 외 세포 신호를 실시간으로 측정할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 바이오센서의 적용을 신장에서 ATP 및H2O2의 생체 외 및 생체 내 검출로 확장합니다.

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; 신장에

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

이 절차들의 전반적인 목표는 전체 신장에서 TP와 과산화수소의 내인성 간질 농도를 실시간으로 측정하는 것입니다. 이는 먼저 ex vivo 및 in vivo 응용을 위해 센서를 재수화하고, TP와 과산화수소의 기지 농도로 교정함으로써 달성됩니다. ex vivo 센서 설치를 위해, 신장을 외과적으로 기구화하고 혈액을 세척하였습니다.이 절차는 대동맥을 통해 신장을 세척함으로써 수행됩니다. 그 다음 쥐의 신장을 외과적으로 분리하여 기록 챔버에 넣고 식염수로 관류합니다. in vivo 절차를 위해 ex vivo 센서를 사용하여 TP와 과산화수소를 측정합니다.혈류가 흐르는 신장을 시각화하기 위해 절개를 수행합니다. 신장을 고정 캡에 배치하고, 약물 투여를 위해 간질 카테터를 설치할 수 있습니다. 이후 생체 내(in vivo) 센서를 사용하여 신장 간질의 ATP 및 과산화수소 농도를 측정합니다.궁극적으로, 이 프로토콜들은 신장 간질에서 TP 및 과산화수소의 실시간 측정을 위한 효소 마이크로 전극 바이오센서의 활용을 용이하게 합니다. 효소 바이오센서의 주요 장점은 생체 조직 내의 내인성 간질 농도를 직접 측정할 수 있다는 점입니다. 본 기술은 고립된 셀린 관류 신장 또는 생체 내(in vivo)의 간질에서 TP 및 과산화수소 농도를 검출하는 데 사용됩니다.효소 바이오센서의 정밀함은 세포 외 ATP 또는 과산화수소 농도의 기저 및 동적 조절을 실시간으로 측정할 수 있게 합니다. 이러한 측정값은 기능적으로 구별되는 신장 부위에 대한 약물 적용 또는 질병 프로필을 설정하는 데 활용될 수 있습니다. ATP 센서와 null 센서의 팁을 버퍼 A가 담긴 각각의 재수화 챔버에 넣고 2~8°C에서 최소 10분 동안 재수화하십시오.듀얼 채널 POTENTIA stat의 전원을 켜고 기록 시스템 소프트웨어를 실행하십시오. 프로그램의 데이터 저장 형식을 A-S-C-I-I 코드로 설정하고 센서 극성을 양극(+)으로 설정하십시오. 3 mL의 완충액이 담긴 교정 챔버를 준비하고, 기준 전극을 챔버 안으로 내리십시오.각 센서를 재수화 용액에서 꺼냅니다. 센서를 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 교정 챔버 용액에 삽입합니다. 신호 노이즈를 줄이기 위해 모든 교정 및 연구는 고성능 실험실 에어 테이블 위의 패러데이 케이지 내에서 수행하십시오.고온 측정 기록 중에, 교정 챔버 내의 ex vivo 센서에 대해 주기적인 전압 텔레메트리를 수행하십시오. 센서를 -500 mV에서 +500 mV까지 초당 100 mV의 속도로 10회 주기적으로 반복함으로써 센서의 감도를 크게 향상시킨 후, 센서를 +600 mV로 분극시키십시오.마지막 사이클 이후, 센서 전류는 일정한 값으로 감소합니다. 최소 5분 후에 안정된 판독값이 얻어집니다. 제로 리딩(zero reading)을 기록한 후, ATP 센서의 원하는 검출 범위를 포함하는 검정 곡선을 생성하기 위해 정해진 양의 ATP 표준 용액을 챔버에 연속적으로 첨가하십시오.A TP 용액을 첨가하면 초기에는 센서 신호에서 날카로운 피크가 생성되고, 이후 A TP가 챔버 전체로 균일하게 확산되면서 신호가 감소합니다. 신호 레벨이 안정화되면 신호 값을 기록해야 합니다. A TP 센서의 특이성을 테스트하기 위해, 각 A TP 첨가 시 2 mg/mL의 스톡 용액에서 3 µL를 첨가하십시오.TP 적용으로 인해 생성된 전류는 챔버 내에 정해진 양의 과산화수소 용액을 연속적으로 첨가함에 따라 0 수준으로 감소해야 하며, 널 센서 신호 값의 검출 범위를 포함하는 검정 곡선을 생성하기 위해 신호 수준이 안정화된 후 값을 기록해야 합니다. 널 센서의 특이성을 테스트하기 위해, 과산화수소를 매번 첨가할 때마다 2 mg/mL의 스톡 용액에서 3 µL의 cattle lace를 첨가하십시오. ex vivo 연구를 위해 과산화수소 적용으로 생성된 전류는 0의 읽기 값으로 감소해야 합니다.셀리악 동맥, 상장간막 동맥 및 이들 동맥 상부의 복부 대동맥 주위를 결찰합니다. 단, 신동맥 하부의 복부 대동맥을 결찰하지 마십시오. 신동맥 하부의 복부 대동맥 원위부를 결찰하십시오.결찰 부위에서 최소 1cm 위쪽이자 신동맥 아래쪽에서 대동맥을 클램프로 고정합니다. 가장 낮은 결찰 부위와 클램프 사이의 복부 대동맥에 폴리에틸렌 튜브로 카테터를 삽입합니다. 두 번째 대동맥 결찰사를 사용하여 카테터를 고정합니다.클램프를 제거하고 장간막 동맥과 복강 동맥, 그리고 이들 동맥 상단의 대동맥을 결찰합니다. 실온의 Hank's balance salt solution을 사용하여 분당 6mL의 속도로 신장을 2~3분 동안, 신장이 완전히 하얗게 될 때까지 관류합니다. 또한, 유출액 수집을 위해 신정맥에 카테터를 삽입할 수 있습니다.수술용 핀셋을 사용하여 센서 삽입에 필요한 신장 캡슐을 조심스럽게 제거합니다. 대동맥의 카테터 연결 부위를 포함하여 신장을 절제합니다. 신장을 bath solution이 채워진 3mL 페트리 접시에 넣습니다.캐뉼라를 삽입한 대동맥을 통해 분당 650 µL의 일정한 속도로 신장에 배양액을 관류합니다. 신장 위에 고무줄을 고정하고 핀을 사용하여 실리콘 코팅 접시에 부착해 신장을 고정합니다. 기준 전극을 페트리 접시 내 신장 가까이에 배치하고 전극 끝이 배양액에 잠기도록 합니다.센서를 신장에 빠르게 삽입할 수 있도록 마이크로 매니퓰레이터를 배치합니다. 또는, 각 마이크로 매니퓰레이터에 더미 프로브를 부착하여 각 센서의 원하는 위치를 잡는 데 도움을 받을 수 있으며, 이 과정은 20초 이내로 완료해야 합니다. 재수화 챔버에서 센서를 꺼내 마이크로 매니퓰레이터에 부착한 후, 센서를 디쉬 배스 용액에 삽입합니다.공기 노출 시간이 길어질 것으로 예상되는 경우, 각 노출 시마다 센서를 글리세롤 용액에 잠시 담그십시오. 전위 가변기(potentia stat)를 사용하여 센서를 +600 mV로 분극시키고 전류가 안정될 때까지 기다리십시오. 각 센서를 신장의 동일한 깊이까지 삽입하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행하십시오. 효소 마이크로 전극 바이오센서의 설계는 분석물과 신장 전체를 실시간으로 검출하여 재현 가능한 결과를 얻을 수 있게 합니다. 정확한 사전 및 사후 보정은 매우 중요합니다.이 그림은 TP 센서 보정 중에 X pvo, TP 및 null 센서에 의해 생성된 신호의 대표적인 트레이스를 보여줍니다. 보정 절차를 통해 TP의 동적 변화를 계산하는 데 사용되는 선형 적합(linear fit)을 생성합니다. null 센서는 bath 용액에 알려진 농도의 과산화수소를 첨가하여 보정하며, asim 및 am 파라미터 값을 기록합니다. bath 용액에 촉매를 첨가하면 전류가 빠르게 감소합니다.in vivo 센서는 유사한 트레이스를 생성하지만, 산화 전류가 아닌 환원 전류를 검출하므로 전류 값이 음수로 나타납니다. 보정 또한 0.3에서 80 micromolar 범위에서 선형 적합도를 보입니다. 다른 퓨린 생성물에 비해 TP에 대한 in vivo 센서의 특이성이 여기에 나타나 있습니다. 이 그림에서는 염 저항성 및 염 민감성 쥐의 갓 분리한 신장에서 angiotensin two에 의해 유도된 간질 내 내인성 과산화수소 농도 변화를 보여줍니다.안지오텐신 II는 양쪽 신장 모두에서 과산화수소의 급격한 방출을 유도합니다. 그러나 최대 진폭은 염분 민감성 쥐의 신장에서 유의미하게 높게 나타났으며, 특히 고염분 식이 식이 시 더욱 그러했습니다. 이 절차를 수행할 때, 센서 팁과 신장 피질 표면은 매우 섬세하므로 어느 쪽이라도 손상될 경우 정확한 기록이 어려워질 수 있다는 점에 유의해야 합니다.이 영상을 시청한 후에는 내인성 물질과 신장과 같은 전체 장기를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 성공적인 기록에 필요한 보정 작업과 외과적 수술 절차를 정확하게 수행할 수 있게 될 것입니다. 우리는 이 방법을 적용하여 TP와 과산화수소의 기저 수준 및 신장에서의 방출을 연구하였습니다.하지만 해당 센서들을 적용하면 동일한 접근 방식을 사용하여 아데노신, 글루타메이트, 포도당 및 기타 일부 물질의 농도를 결정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

이 비디오는 방사성 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 피로포스포키나제 활성을 결정하기 위한 박층 크로마토그래피 기반 효소 분석을 보여줍니다. 이 방법은 뉴클레오티드 합성 및 인산 전달 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.

박층 크로마토그래피 기반 효소 활성 분석: 박층 크로마토그래피를 사용하여 체외 피로포스포키나제 활성을 측정하는 기술

우리는 Xenopus 난모세포에서 효소의 이종 발현을 통해 K+-역수송 P형 ATPase의 활성을 정량화하고 원자 흡수 분광 광도법으로 개별 세포로의 Rb+ 또는 Li+ 흡수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소 플럭스 실험에 대한 민감하고 안전한 대안으로 복잡한 동역학 연구를 용이하게 합니다.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.

생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

단백 분해 효소 형광 탐지 키트는 fluorometry를 사용하는 프로 테아제 활동의 측정을 위해 설계되었습니다. 그것은 또한 프로 테아제 오염 성분의 검출에 적합합니다. 방법은 FITC - 카제인 표시 기판의 독자적인 배합의 proteolytic hydroysis을 기반으로합니다.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

학습하세요 효소 바이오센서를 이용해 신장 조직에서 ATP와 H₂O₂를 실시간 정량화하는 방법을. 이 기술은 세포 신호 전달 메커니즘 연구에 필수적인 도구입니다.

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기

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