Name: Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 학습하세요 마우스 뇌에서 상세각 절단법을 이용한 청각 구조 뇌절편 제작 방법을. 플라보단백질 이미징으로 연결성을 평가하여 청각 정보 처리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 D. A. Llano에게 National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125를, B. J. Slater에게 F31-DC-013501을 수여하고 Carver Foundation의 일부 지원을 받았습니다.
저자는 칼슘 이미징에 대한 기술적 조언을 해준 Jason MacLean과 Matthew Banks에게 감사를 표합니다.

모든 절차는 일리노이 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물 실험 동물 관리의 인증에 대한 미국 협회의 승인을 동물 보호 시설에 수용되었다. 모든 시도가 사용 동물의 수를 최소화하고 연구의 모든 단계에서의 고통을 감소시키기 위해 만들어졌다. 및 공격 태도를 보여준 마우스에서 뇌의 제거 1. 준비 <ol><li> 관류 및 슬라이스 배양을 위해 준비합니다. <ol><li> 약 30 분 슬라이스 전에 녹음 또는 영상 이전 슬라이스의 배양을위한 높은 크로스 커팅 솔루션 및 저 칼슘 ACSF을 준비합니다. </li><li> 모든 필요한 도구 (대형 무딘 끝 가위, 작은 봄 가위, 해부 포셉, 큰 가위 단두대, 홍채 가위, 보석상의 집게, 27G X 1/2 인치 바늘로 10 ML의 주사기, 1cm X 2cm 필터의 작은 조각을 배치합니다 종이 및 SL에 대한 깨진 팁 파스퇴르 피펫관류 및 슬라이싱 및 관류 트레이를 준비 얼음 전송). </li><li> 32 O C의 물을 욕조와 솔루션을 절단 가득 배양 접시에 산소 ACSF와 실을 배양 설정합니다. </li></ol></li><li> 공격 태도를 보여준 무대 절단 준비합니다. <ol><li> 약 1cm 3 범프의 뇌에 대한 역전과 1.5 cm X 1.5 mm X 3mm로 사용할 3 % 한천의 작은 조각을 잘라하는 IC를 지탱하는 데 사용합니다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트 접착제 스테이지뿐만 아니라 그들이 80 O 각도를 형성하도록 역전의 오른쪽에 범프 상 역전을 붙인다. </li></ol></li><li> 뇌를 제거합니다. <ol><li> 깊이 P12-P20 케타민 100 ㎎ / ㎏과 xylaxine 3 ㎎ / ㎏ (또는 유사한 윤리위원회의 승인 절차)와 (이상적 p14-18) 마우스를 마취. 참고 : 발가락 핀치에 응답의 부족을 통해 적절한 마취 수준을 확인합니다. 동물은 마취하에 간단히 바와 같이, 안연고는 불필요하다. </li><li> 무딘 사용가위를 종료 목에 칼 모양의 과정에서 갈비뼈를 노출. <ol><li> 칼 모양의 과정을 찾아 약 1.5 cm의 수평 절단을합니다. </li><li> 어깨에 이전 수평 절단의 끝에서 두 개의 수직 절단, 약 1.5 cm 각을 확인합니다. </li></ol></li><li> 다이아 프램 및 늑연골 접합을 극복하는 것은 마음을 노출. </li><li> 작은 스프링 가위, 마음의면을 지느러미에 복부에서 우심방으로 잘라 작은, 2-5mm합니다. </li><li> 1/2 인치 X 27G 바늘 10 ㎖ 주사기를 사용하여 좌심실을 주입하고 신속하게 높은 절삭 수크로오스 용액을 관류 동물. </li><li> 피가 명확한 실행하면, 머리를 제거하는 큰 가위를 사용합니다. 참고 : 우리는 체계적으로 관류의 유용성을 평가하지 않았습니다. 그러나, 우리의 경험에서,이 젊은 쥐 (rongeur)로 거의 100 % 성공을 함께 할 수 있고, 빨간색 (BL)을 제거하는 이점이 있는가형광 이미징 방해 할 수있는 짐 우드 세포. </li><li> 두개골을 노출하는 중간 선을 피부를 잘라. </li><li> 구부러진 홍채 가위를 사용하여 한 눈 사이의 절단, 조심스럽게 아래 뇌 손상되지 않도록 중간 선 봉합 돌보는 따라 전치부에서 잘라부터 눈 사이 두개골을 잘라. 참고 : 두라는 일반적으로 두개골과 떨어져 온다. 필요한 경우, 신중하게 뇌를 제거하기 전에 경질을 제거합니다. </li><li> 보석상의 집게 사용 놀리려는 두개골을 열고 조심스럽게 뇌를 제거하고 솔루션을 절단의 뇌를 놓습니다. 피질이 손상되지 않도록주의하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 공격 태도를 보여준 뇌를 준비 <ol><li> vibratome 무대에 장착 뇌를 준비합니다. <ol><li> 90 O에서 두 개의 라인으로 표시된 슬라이드 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 17 O에서 대각선을 사용하여, 두 선이 만나는 곳, 사용, 최대 뇌 등의 측면을 배치 교차면도날은, 평평한 표면을 생성 주동이의 끝 뇌의 2-4mm를 제거합니다. </li><li> 새로 만든 평평한 표면에 뇌 꼬리 쪽을 놓고 수평 및 수직 라인과 뇌의 중간 선으로 뇌의 등쪽 표면을 맞 춥니 다. </li><li> , 17 O 라인으로 면도날을 맞 춥니 다 (30) O 각도에서 면도칼을 기울이고 이중 대각선 컷 (관상에서 17 수평면에서 O와 60 O)의 오른쪽 피질의 약 3mm를 제거합니다. </li></ol></li><li> vibratome 무대에서 뇌를 장착. <ol><li> 긴 치수는 중심선에 수직이되도록 여과지 뇌의 복부 측 1cm X 2cm의 작은 조각을 배치했다. </li><li> 신중 백스톱 (및 범프의 좌측으로) 앞의 영역에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 적용. </li><li> 뇌와 후뇌의 꼬리 부분이되도록 홍보 접착제에에 두 번 대각선으로 잘라 뇌 얼굴을 배치범프에 opped 및 뇌의 우측에 대해 역전된다. </li><li> 섬세 전체면이 슬라이싱 챔버와 접촉하는 것을 보장하는, 뇌에 눌러. </li></ol></li></ol> 3. Colliculo-thalamocortical 슬라이스를 구하기 <ol><li> 신속하게 vibratome에서 절단 단계 및 발생하는 솔루션을 절단으로 무대를 채운다. </li><li> 뇌의 상단 (복부 측면)과 날을 맞 춥니 다. </li><li> 뇌의 상부로부터 1.5 mm를 제거 300-500 μm의 조각을 제거하고, 제거 후에 깊이를 평가한다. 참고 : IC, MGB 및 측면 geniculate 핵 (LGN)이 모두 볼 수 있습니다, 그리고 치아 이랑 (dentate gyrus)가 &#39;C&#39;모양이 600 μm의 슬라이스 한을 형성합니다. 도 3a를 참조하십시오. </li><li> 지주 (32 O를 C) 가열 된 챔버에 넣어 조각. </li></ol> 슬라이스 4. 영상 <ol><li> flavoprotein의자가 형광 이미징을위한 준비. <ol> &lt;리&gt; 표준 전기 생리 녹화 실에서 조각의 관류 ACSF을 준비, 95 %, O2 / 5 % CO 2와 버블 ACSF. </li><li> 자극 용 유리 전극을 당기십시오. 그 여러 가지 자극 전극 및 구성 (유리, 텅스텐, 탄소 섬유, 모노 폴라, 바이폴라) flavoprotein의자가 형광 이미징 모든 작업이 매우 잘 결합을합니다. </li><li> 컴퓨터, 카메라, 미세 조작기, 광원, 자극 소프트웨어, 이미지 캡처 소프트웨어를 켭니다. </li><li> 챔버에서 슬라이스를 상승 사용자 정의 다리 (보충 자료에서 사용할 수있는 디자인)를 배치, 산소 ACSF로 기록 챔버를 관류. 참고 : 관류 속도가 설정 개인에 따라 달라질 수 있습니다 5-15 ml의 / 분 여기에 사용됩니다. </li><li> 남북의 경로를 통해 하프 문자열을 배치하지 않도록주의하면서 조각을 통해 특별히 제작 된 하프를 배치하는 동안 다리를 들어 올려에서 슬라이스를 방지하기 위해 챔버 내의 액체 레벨을 낮추고, 챔버에서 슬라이스를 배치EST (그림 1A). 슬라이스 위와 아래 ACSF 흐름을 유지하기 위해 슬라이스 위의 약 1-2mm에 액체 수준을 높입니다. 주 : 재배치가 필요한 경우, 파손 단부 파스퇴르 피펫을 사용하거나 ACSF 레벨이 상승하고는 조심스럽게 집게를 사용하도록 허용. </li><li> (그림 1A 참조), ACSF 가득 유리 전극에 염화은 전극을 삽입 미세 조작기에 유리 전극을 삽입하고 아이솔레이터를 자극에 연결하고 조심스럽게 시상으로 이어지는 IC / 백질에 유리 전극을 배치합니다. </li></ol></li><li> 자가 형광 이미지 획득을 Flavoprotein. <ol><li> (무한 보정 2X 매크로 목표를 사용하여 (NA 0.13)) 4 Hz에서 이미지와 105 초 동안 카메라를 전기적으로 자극하면서 (각 자극이 0.05 Hz에서 40 Hz에서 2 밀리 초 펄스 조직의 1 초를 다섯 번으로 구성) 조명하면서 수집 푸른 빛 470-490 nm에서 515 nm의 위의 캡처와 조직. 이미지가 어느 쪽인지 확인O 어두운,도 터져 참조 그림 3 참조 열을 떠났다. 주 : 수집 시간, 컬렉션 주파수 및 자극 주파수는 실험과 같은 변형 될 수 부원료 포함 지정 프로그램에 적합하도록 변경 될 수있다. </li><li> matlab에, 및 보충 자료에서 사용할 수있는 사용자 작성 프로그램을 사용하여 내보내기 이미지는 0.05 Hz에서 이미지의 스펙트럼 전력을 분석합니다. 결과 이미지는 연결 경로를 표시합니다. 주 : 지정 프로그램은 화상을 생성하는 고속 푸리에 시계열의 화소 값의 변환을 이용한다. </li></ol></li><li> 칼슘 이미징을위한 준비. <ol><li> ACSF는 약 32 O C.을 온도를 유지하도록 가열 패드 상부 및 슬라이스의 아래쪽, 및 장소 모두에 도달 할 수 있도록 3cm 배양 접시에 올려 배양 막을 이용한 작은 배양 챔버를 준비 </li><li> 95 % O 따뜻한 ACSF 천천히 거품 작은 배양 챔버를 입력5분의 2 %의 CO 2. </li><li> 2 플루로 닉 F-127 산의 μL 및 DMSO 48 μL에 용해의 Fura - 오전 2시의 50 μg의 혼합. </li><li> 제기 막 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 작은 배양 챔버에 넣어 슬라이스 염색 직접 MGB 상기 혼합물 (또는 관심의 다른 구조)를 추가합니다. </li><li> 1 시간 - 이전 영상에 표백을 방지하고, 조각이 45 분 동안 배양 할 수 있도록 슬라이스를 커버. </li><li> 를 초과하는 물질을 씻어 10 ~ 15 분 동안 가열 보유 챔버 조각을 제거합니다. </li><li> 자극 준비와 이미지 colliculo-thalamocortical 슬라이스 4.1.6에 단계 4.1.1을 따르십시오. </li></ol></li><li> 칼슘 화상 취득. <ol><li> 365 nm의 빛과 조직을 조명 510 nm의 위에 형광을 캡처하는 동안 전기 0.2 Hz에서 (각 자극 한 2 밀리 초 펄스로 구성)를 다섯 번 조직을 자극하면서 25 초 동안 (20X 물 침지 목표를 사용) 10 Hz에서 이미지를 수집합니다. </lI&gt; <li> MATLAB과 보충 자료에서 사용할 수있는 사용자 작성 프로그램을 사용하여 내보내기 이미지는 0.2 Hz에서 이미지의 스펙트럼 전력을 분석합니다. 결과 이미지는 활성 셀을 보여줍니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li>
<li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+%28barrel%29+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+thalamocortical+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li>
<li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li>
<li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li>
<li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li>
<li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li>
<li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Paradigm+for+Optical+Imaging%3A+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li>
<li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li>
<li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse%3A+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 청각 시스템1의 정보 흐름을 연구하기 위해 p12-20 마우스에서 이전에 기술된 구상-시상 피질 뇌 절편에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 단일 슬라이스에서 더 많은 뇌 영역 간의 연결을 유지함으로써 다른 유사한 뇌 슬라이스 준비에 비해 많은 이점이 있으며, 이는 연구자에게 전뇌의 청각 핵 간의 상호 작용과 상호 작용을 이해할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다. 이 프로토콜에는 이전 작업1과 비교하여 연결된 슬라이스의 수율을 증가시키는 몇 가지 주요 수정 사항이 있었습니다. 이러한 수정에는 20o에 비해 수평면 17o에서 약간 다른 절단 각도, 관상 평면에서 60o 증가 및 IC 아래의 2 mm 1.5mm 더 작은 범프가 포함됩니다. 작지만 이러한 수정은 방법의 수율과 신뢰성을 크게 향상시키며, 연습을 통해 슬라이스는 80-100%의 시간 동안 얻어야 합니다. 구상-시상 피질 절편을 얻는 것과 함께 프로토콜은 추가...

감각 주연부와 열등한 둔덕 간의 정보의 실질적인 처리가 있지만 그것이 청각 피질에 도달하기 전에 청각 시스템에서, 상당한 추가 처리가있다. 우리는 처리가 수행하고 변환 뇌가 들어오는 감각 정보를 해석 할 수 있습니다 방법에 대한 때문에 작은 방법에 대해 거의 알고있다. 후각을 제외한 각각의 감각은 초기 신호가 피질 상승으로 감소 높은 충실도로 중계되는 신호에 주연 매우 유사한 조직을 갖는다. 피질은 더 들어오는 정보를 조절하는 하부 구조에 대한 전망을 보냅니다. 이 복잡한 시스템은 생체 내뿐만 아니라 시험관 제제의 수가 다양한 방식으로 연구되어왔다. 전, 모든 연결은 감각 입력을 제어하고 측정하면서, 연결의 집합을 조사하기 위해 연구를 가능하게 그대로주어진 영역에서 출력. 이 방법을, 강렬 복잡한 출력 상승을주고, 다른 감각 입력, 각성,주의를 포함하여 다른 입력의 큰 다양성없이 제어에 거의 없다. 시험관, 뇌 조각이 하나의 세트를 캡처 잘라왔다 연구자들은 자극과 구 심성 또는 뇌 영역의 다양한 평가를 할 수 있도록 예측, 또는 두 개의 연결된 뇌 영역의. 이들은 종종 시상에 입력 또는 시상과 대뇌 피질에 출력 하나가 2-5 보존 thalamocortical 또는 tectothalamic 중 하나 조각입니다. 이러한 제제는, 약물, 전기 및 optogenetic 조작 다양한 허용한다. 그러나 두 개의 뇌 영역으로, 이들은 주로 정보의 전송을 평가하고 시상 통과함에 따라 정보의 변화를 평가하는 기능이 부족하다. 또한 주목 변조 역할을 세망 시상 투영은 6-9 인 PR이 조각에 ESENT. 여기에서 우리는 어떻게 시상 게이트 및 필터 정보의 독특한 관점을 제공하기 위해 시상에 다양한 입력의 연구자를 제어 할 수 있습니다 이전 준비 1시에 개선을 보여줍니다. 우리 커플 단일 세포 수준에서 다양한 입력의 영향을 측정하기 위해 슬라이스 연결 및 대규모 활성화 분석 뉴런 집단 분석 시상 칼슘 이미징 및 단일 세포 기록을 평가하기위한 flavoprotein 자기 형광 영상이 신규 슬라이스 제제. 이러한 광범위한 연결을 유지하는 데 도움을주기 위해 우리는 또한 강화 된 관류에 대한 슬라이스를 상승시키는 대신에 뇌 조각과 다리를 유지하는 일반 슬라이스 앵커 (일명 &quot;하프&quot;)의 수정을 개발했다. 하프는 슬라이스를 둘러싸고 하프 문자열에 대한 사용자 지정 부착 점 수 있도록 수정 된 말굽 모양으로 설계되어 있습니다. 세 개의 문자열은첨부 ⅰ) 하나 ⅱ) 하나가 AC의 꼬리 가장자리 IC의 꼬리 에지로부터 연장 ⅲ) 하나의 영역에 슬라이스의 내측 가장자리로부터 비스듬하게 연장되어, 슬라이스의 내측 가장자리를 따라 가로로 놓여 지도록 AC에 주동이 (도 1a 참조). 문자열 슬라이스 무결성을 유지할 수 있도록 슬라이스 압력 저하 량을 허용 하프 (시아 노 아크릴 레이트 접착제)을 붙이는 프레임에 작은 요철이 (도 1b 참조). 입체 인쇄를 사용하여, 우리는 조직의 상하 인공 뇌척수액 (ACSF)의 이상적인 흐름 수 있도록 우리 고유의 사양뿐만 아니라 다리에 사용자 정의 디자인 수금 할 수 있습니다. 이것은 또한 패치 클램프 전기 생리학의 조직에 침투하는 빛이 넓은 영역을 유지합니다.

<table><tbody><tr><td>mM의 고 자당 절단 용액</td><td></td><td></td><td>: 206 자당, 10.0 MgCl2, 11.0 포도당, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>낮은 칼슘 aCSF</td><td></td><td></td><td>(mM): 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>(mM): 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>lot: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lot: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lot: 1499369</td></tr><tr><td>대형 배양 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>100 x 15 mm 배양 접시</td></tr><tr><td>소형 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm 배양 접시</td></tr><tr><td>제기 배양 멤브레인</td><td>밀리셀</td><td>PICMORG50</td><td>슬라이스의 양쪽에서 산소가 함유된 유체 관류를 유지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>플라보단백질 이미징 형광 큐브</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&ndash; 490nm 여기, 505nm 이색성, 515nm 방출 긴 패스.&nbsp; 우리는 거의 모든 녹색 형광 단백질 필터 큐브가 여기에서 작동한다는 것을 발견했습니다.</td></tr><tr><td>칼슘 이미징 형광 큐브</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm 방출</td></tr><tr><td>뇌</td><td></td><td></td> 차단용 한천 <td>물 무게의 3%</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

감각 정보를 처리하는 뇌의 능력은 오름차순과 내림차순 투영 세트에 의존합니다. 최근까지 이 두 가지 시스템과 이들이 어떻게 상호 작용하는지 연구할 수 있는 유일한 방법은 생체 내 제제를 사용하는 것이었습니다. 체성 감각계, 시각 및 청각 시스템에서 시상 피질 및 피질 시상 경로를 포함하는 급성 뇌 절편에 대한 주요 발전이 이루어졌습니다. 청각 시상피질 절편1의 최근 수정에 대한 주요 개선을 통해 대부분의 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조, 즉 하구(IC), 내측 외상체(MGB), 시상 망상핵(TRN) 및 청각 피질(AC) 사이의 투영을 보다 안정적으로 캡처할 수 있습니다. 이러한 모든 연결의 일부를 유지하면 in vivo 제제로 답변할 수 있는 질문을 보완하는 자세한 질문에 답할 수 있습니다. 플라보단백질 자가형광 이미징을 사용하면 주어진 슬라이스의 연결성을 신속하게 평가하고 후속 실험을 안내할 수 있습니다. 이 슬라이스를 기록 및 이미징 기술과 함께 사용하면 정보가 피질로 올라갈 때 청각 전뇌의 각 지점에서 정보 처리가 어떻게 발생하는지, 그리고 하행 피질 조절의 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다. 슬라이스 챔버 구성 요소를 구축하기 위한 3D 프린팅은 양면 관류와 슬라이스 내 네트워크에 대한 광범위한 액세스를 허용하고 이 준비를 최대한 활용하는 데 핵심적인 광범위한 연결을 유지합니다.

P15 마우스에서 얻은 colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 예는 그림 2에 나타나있다. 이상적인 슬라이스 IC가 자극 될 때 모든 활성화 된 네 개의 주요 중뇌와 전뇌 청각 구조 IC, MGB, TRN, 및 AC를 포함합니다 (도 2A). 푸리에 분석을 사용하여, 상기 스펙트럼 전력은 주기적으로 자극 주파수 (10)에 혼입 인 활성을 나타내는 접속 뇌 영역과, 전기 자극의 주파수에서 측정된다. 이 프로토콜은 특히 중뇌와 대뇌 피질 사이의 넥서스와 시상에서 정보의 상승 흐름을 연구 할 수 있습니다. 포함 된이 프로토콜 접속 colliculo-thalamocortical 슬라이스의 생산을 보조뿐만 아니라 3D 인쇄의 혼입과 하드웨어의 더욱 쉽게 사용자 정의 세트를 제공은 피질 시상 (도 2B에서 연결되지 슬라이스의 예이지만 )<html> 시상은 flavoprotein의자가 형광 이미징 <str...

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

본 절차의 전반적인 목표는 하구(inferior colliculus), 청각 시상(auditory thalamus), 시상망상핵의 청각 부위(auditory portion of the thalamic reticular nucleus) 및 청각 피질(auditory cortex)이라는 네 가지 주요 청각 구조를 포함하는 Calot Thal 피질 절편을 준비하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생쥐로부터 뇌를 적출합니다. 두 번째 단계는 절편 제작 준비를 위해 뇌를 고정(block)하는 것입니다.다음으로, Calot 시상피질 연결이 포함된 절편을 얻기 위해 뇌를 절단합니다. 마지막 단계는 플라보단백질 이미징을 사용하여 연결성을 평가하는 것입니다. 궁극적으로 carotal 피질 연결이 포함된 뇌 절편은 중뇌와 전뇌의 청각 영역에서 정보 처리를 더 잘 이해하기 위한 다양한 실험에 사용될 수 있습니다. 뇌를 절단하기 전 블록 처리 단계는 온전한 투사 경로를 확보하는 데 핵심적인 복잡한 이중 각도 절단이 필요하여 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.이 기술의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 BJ Slater가 맡을 것입니다. 절단 단계를 준비하기 위해, 뇌의 백스톱으로 사용할 약 1세제곱센티미터 크기의 3% agar 조각과 하구(inferior colliculus)를 지지할 범프로 사용할 1.5cm x 1.5mm x 3mm 크기의 조각을 각각 자릅니다. 다음으로, 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 백스톱을 스테이지 위에 접착하고, 90도 각도의 두 선과 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단으로 17도 각도의 대각선이 표시된 슬라이드 위에서 백스톱의 오른쪽에 범프를 접착하여 두 부분이 80도 각도를 이루게 합니다. 뇌의 배측(dorsal side)이 위를 향하게 하여 두 선이 교차하는 지점에 놓습니다. 면도날을 사용하여 뇌의吻측(rostral end) 끝단에서 2~4mm를 제거하여 평평한 표면을 만듭니다.다음으로, 뇌의 꼬리 쪽이 위로 향하게 하여 새로 만든 평평한 표면 위에 놓습니다. 뇌의 등쪽 표면을 슬라이드에 표시된 수평선에 맞추고, 뇌의 정중선을 수직선에 맞춥니다. 그런 다음 면도날을 17도 선에 맞춥니다.면도날을 30도 각도로 기울여 우측 피질의 약 3mm를 이중 대각선 절개로 제거하여 뇌를 진동자 스테이지(vibratome stage)에 고정합니다. 필터 페이퍼 조각을 뇌의 복측에 놓되, 긴 쪽이 정중선과 수직이 되도록 합니다. 백스탑(backstop) 앞쪽과 돌출부 왼쪽에 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 조심스럽게 도포합니다.그 후, 뇌의 대각선 절단면이 접착제 쪽에 닿도록 놓아 뇌의 꼬리 부분과 후뇌가 돌출부에 지지되고, 뇌의 오른쪽 면이 백스톱(backstop)에 밀착되게 합니다. 이 과정에서 절단대를 진동 절편기(vibratome)에 빠르게 배치하고, 절단 용액으로 스테이지를 구성합니다. 다음으로, 칼날을 뇌의 상단에 맞춥니다.뇌 상단에서 1~1.5mm를 제거합니다. 그런 다음 더 깊은 곳으로 이동하며 300~500µm 두께로 추가 슬라이스를 절단하여 제거합니다. 하구(inferior colliculus), 내측 전뇌체(medial ate body) 및 외측 ICT 핵(lateral ICT nucleus)이 모두 보이면, 치상회(dentate gyrus)가 C자 모양으로 나타나야 하며 구조가 정렬된 상태여야 합니다.약 600 µm 두께의 절편을 두 개 정도 얻습니다. 이것들이 바로 carotid cortical slices입니다. 그 후, 이를 32 °C 유지 챔버로 옮깁니다.플라보단백질 자가형광(Flavoprotein Autofluorescence) 이미지를 얻으려면, 4Hz의 빈도로 105초 동안 이미지를 수집하십시오. 조직에 470~490nm의 청색광을 조사하고 515nm 이상의 파장에서 이미지를 캡처하되, 이미지가 너무 어둡거나 과노출되지 않도록 하십시오. 그 다음, 전기 자극을 사용하여 조직을 활성화함으로써 칼슘 이미지를 획득하십시오.10 Hz의 속도로 25초 동안 이미지를 수집하십시오. 365 nm 광원으로 조직을 조사하고 510 nm 이상의 형광을 캡처하십시오. 이때 이미지가 너무 어둡거나 과노출되지 않도록 다시 한번 확인하십시오.그런 다음 전기 자극을 사용하여 세포를 활성화합니다. 이 이미지는 플라보단백질 자가형광(Flavoprotein Autofluorescence)을 통해 뇌 절편 내의 경동맥 피질 연결이 확인되었음을 보여줍니다. 하구(inferior colliculus)에 0.05 Hz로 가해진 전기 자극을 4 Hz로 촬영하고 처리하여 해당 자극에서의 강도를 나타냈습니다.주파수, 청각 시상, 시상, 망상핵, 그리고 청각 피질이 시냅스적으로 활성화됩니다. 여기는 연결되지 않은 절편입니다. 하구(inferior colliculus)에 전기 자극을 가했을 때, 활성화는 청각 시상에서만 관찰되었습니다.절단면 중 하나가 약간 평면에서 벗어났기 때문에 전체 경로가 포착되지 않은 것으로 보입니다. 시상-피질 투사 영역과 함께, 이 이미지는 청각 피질의 비정형적 활성화를 보여줍니다.하둔구(inferior colliculus)의 전기 자극은 가시적인 신호 없이 청각 피질을 활성화했습니다. 청각 시상에서는 시상이 여전히 활성화되었을 가능성이 높으나, 영상 표면에 나타나지 않았습니다. 이 영상을 시청한 후에는 AAL 시상 피질 절편을 얻는 방법과 그 연결성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

이 문서에서는, 우리는 수행하기 쉽고 이미지가 성인 마우스 뇌의 혈관 트리를 활용할 수 뇌혈관 캐스팅에 대한 간단한 실용적인 기술을 제시한다.

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

이 비디오는 쥐 새끼의 뇌에서 콜리큘로-시상 피질 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 고립된 뇌는 표시된 슬라이드에 정렬되고 청각 중뇌와 전뇌를 같은 평면에 정렬하기 위해 비스듬히 절단됩니다. 그런 다음 비브라톰을 사용하여 뇌를 절편화하고, 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조를 포함하는 절편을 보존을 위해 보관실로 옮깁니다.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain(쥐 강아지 뇌의 Colliculo-Thalamocortical Slices)

이 비디오는 형질전환 마우스의 광학 창을 통해 뇌의 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 쥐는 신경 활동을 감지할 수 있는 형광 단백질을 발현합니다. 두개골의 작은 부분을 조심스럽게 제거하여 광학 창을 설치하고, 두개골을 검은색 시멘트로 덮어 이미징 전에 빛을 차단합니다.

신경 활동을 이미지화하기 위해 형질전환 마우스의 뇌에 광학 창 설치

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

MRI 스캔(인간), 3D 이미징 소프트웨어 및 면역조직학적 분석을 사용하여 뇌의 외측심실의 변화를 문서화합니다. 그런 다음 노화 또는 질병으로 인해 인간 뇌에서 발생하는 외심실 부피 변화의 종단 3D 매핑과 뇌실 주위 세포 변화의 특성화를 마우스에서 모델링합니다.

인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

학습하세요 마우스 뇌에서 상세각 절단법을 이용한 청각 구조 뇌절편 제작 방법을. 플라보단백질 이미징으로 연결성을 평가하여 청각 정보 처리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

더 많은 동영상 탐색