Name: 차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 다발성 골수종 원발 세포의 약물 민감도를 정량화하는 고처리량 organotypic 분석법을 통해 골수 미세환경을 보존하며 세포 생존율을 장기적으로 측정하는 방법을 익히세요.

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이 연구는 플로리다의 BANKHEAD - 콜리 팀 과학 그랜트 (2BT03), 건강 / 국립 암 연구소 (1R21CA164322-01) 및 모 피트 암 센터의 팀 과학 부여의 국립 연구소의 국가가 투자되었다. 이 작품은 H. 리 모 피트 암 센터 연구원, NCI 지정 종합 암 센터 (P30-CA076292)에서 중개 연구 핵심 시설에 의해 부분적으로 지원하고있다. 일차 전지에 대한 액세스는 모 피트 암 센터에서 전체 암 관리 프로토콜을 통해 가능하게되었다.

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

요약하면, 이것은 골수 재건 차 MM 세포 및 약물의 생체 약력학의 감수성을 정량화하는 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 우물의 적절한 파종하고 적절한 (예상 결과에 대한 그림 2 참조) 초점 : MM과 기질 세포가 균일하게 분포되어 있는지 확인, 그 기질 세포는 우물의 바닥에 부착되어 MM 모든 세포는 MM 세포 어두운 링으로 둘러싸인 밝은 디스크의 형태가 동일한 초점 평면에서, 그이다. 시딩 부적절한 경우 실험을 계속하지 않는다 (도 5 참조)이 아니라 제 2 플레이트를 시드. 문제는 낮거나 높은 MM 또는 기질 세포 밀도, 세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 시드 과정 시드 및 정기적으로 재현 탁 전에 튜브에 세포 농도를 확인 하였다 감지되면미디어. 리피터 기능 또는 로봇 디스펜서를 멀티 채널 피펫을 사용하면이 문제를 현저히 감소시킬 수있다. 이 분석에 사용되는...

이 방법의 목적은 이들 결과 chemoresistant 서브 식별 할 수있는 충분한 정밀도로, 생리 학적 조건에 가능한 한 가깝게, 생체 에이전트 패널 일차 전지를 다발성 골수종 (MM)의 약물 감수성을 특성화하는 것이다 종양 부담하고, 집단 내의 궁극적 임상 응답을 추정하기위한 계산 모델 파라미터 화. 전산 모델은 암 호스트 치료의 상호 작용과 같은 복잡한 시스템을 분석 할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나 모델은 데이터를 매개 변수화하는 데 사용되는만큼 좋다. 불행하게도, 문헌에서 사용할 수있는 대부분의 데이터는 종종 상호 배타적 실험 조건에서 수득 된 바와 같은 모델을 파라미터 화하는 현재의 형태로 사용될 수 없다. 따라서, 새로운 실험은 종종 필요한 실험 파라미터 세트를 얻는 것을 목표로해야한다. 대부분의 생존 분석은, 그러나, 파괴적이고 일이다우리는 시간 지점 소수 종종 단지 하나에 제한. 이것은 크게 이러한 실험은 시스템의 시간적 동역학에 관한 정보를 제공하지 못한다 감수성 때문에 분석의 사용은, 계산 모델을 매개 변수화 장애. 이것은 종종 따라서 가능한 실험 조건의 수를 제한하는, 샘플 당 몇 백만에 한정 생검 후 짧은 수명을 갖는다 일차 암세포, 특히 사실이다. 또한 대부분의 생존력 분석법은 상기 세포를 교란하고 행할 수 실험의 수를 제한하는, 프로토콜의 추가 작업을 추가 정량의 시간에 비 - 암 (기질) 세포에서 암의 분리를 필요 . 전에 40 년, 연어와 공동 작업자 1은 종양 세포의 감수성의 평가에 대한 시험 관내 콜로니 형성 분석에서 그 유명을 제안했다. 불행하게도,이 분석은 여러 MYE 인해 소수로 혼합 성공을제어 조건에서 콜로니를 형성 할 수 있었다 로마 (MM) 환자 샘플 : 그것은, MM 세포의 0.1 %로 0.001 %의 작은 서브 그룹은 복제 할 수 있다고 추정은 다발성 골수종 줄기 세포를 2로 지칭된다. 이로 인해, 심지어 더 최근의 모델 3에서, 분석의 성공률과 동시에 시험 할 수있는 약물의 수를 제한. (표준 또는 실험) MM 에이전트 사 년 전보다 더 많은 경우이 문제가 훨씬 더 중요하다. 두 환자는 특정 약물에 대한 &quot;민감한&quot;또는 &quot;내성&quot;이다 : 이러한 초기 분석의 주요 한계는 이분법 출력된다. 어떤 정보는 종양 인구의 감도와 이질성의 정도에 대한 제공되지 않습니다. 따라서, 빠르게 성장하는 내성 세포의 작은 하위 집단 환자가 치료에 &quot;민감한&quot;로 분류 될 수 있지만, 곧 재발 것입니다, 따라서하지 벤치료의 혜택을 받고 있습니다. 암 환자의 생존율 4,5- (OS)에서의 응답 시간의 중요성을 감안할 때, 이러한 분석이 올바르게 일관 OS를 추정 할 수 없었다 얼마나 명확하다. 순서 이러한 한계를 회피하고, 약물의 패널 맞춤 임상 응답을 추정 할 환자 별 계산 모델을 생성 할 수 있도록, 우리는 다발성 골수종 (MM) 세포 라인의 비파괴 시험 약물 민감성 방법을 개발 및 세포 외 기질과 기질 6 포함한 골수 미세 환경의 생체 재건 일차 MM 세포. 이 분석은, 그러나, 그 크기 및 비용 장비의 특정 부분에서 한 번에 수행 될 수있는 실험이나 약물의 수를 제한 특히 상업용 마이크로 유체 슬라이드에 의존하는 한계가 있었다. 여기에 설명 된 시스템은 높은으로이 원래의 분석을 확장비파괴 세포 생존율을 정량화하는 디지털 이미지 분석 알고리즘에 기초하여 약물의 시험 관내 스크리닝의 Organotypic 용량 반응 플랫폼, -throughput. 도 384 또는 1536 웰 플레이트의 각 차 MM 세포 외 기질 및 간질 환자 유래 성장 인자를 포함하여 골수 미세 환경의 3D 재구성이다. 라이브 현미경과 디지털 영상 분석은 용량 - 반응 표면을 생성하는 데 사용되는 다른 약물 농도에서 세포 사멸 이벤트를 검출하기 위해 사용된다. 시험 관내 데이터로부터 수학적 모델은 환자의 종양 부담 내의 크기 및 하위 집단의 감수성을 식별하고, 종양 (임상 처방 6에서 생리 학적 조건에 약물 (들)에 반응하는 방법을 시뮬레이션하기 위해 사용될 수있다 그림 1). 이 플랫폼의 주요 혁신은 다음과 같습니다 약물 승낙 당 필요한 암 세포의 () 작은 수 (1,000 ~ 10,000배급); (b) 약물 효능의 생리적 조건 (세포 외 매트릭스, 간질 환자 유래 성장 인자)의 평가; (c) 만 명 시야 촬상 보낸 생존 마커 (7)로부터는 독성, 생물 발광 형광 8 또는 9 세포를 형질 감염시키는 것이 필요도 사용되지 않는다; (d)는 연속 화상 농도 및 노출 시간 (약물 동력학)의 함수로서 약물의 효과를 제공한다; 및 (e) 시험 관내 및 전산 진화 모델과의 통합, 임상 적 결과 (6) (실바 외., 준비)를 추정한다. 디지털 이미지 분석 알고리즘이 간질 세포에서 암을 분별할 수 있도록 핵심 요소 중 바닥에 서로 다른 친 화성이다 웰 : MM 세포 부착, 및 간질 세포의 바닥에 부착하면서, 매트릭스에 현탁 유지하지 잘하고 스트레칭. 이러한 분리는 MM 및 심지어 기질에도 발생동시에 접종 및 배양 O / N 프로세스 중에 발생 재. 플레이트의 원심 분리기에서 스핀 다운 시딩 다음은이 과정을 더욱 가속. 기질이 낮은 프로파일과 어두운 그늘 (그림 2)을 유지하면서 결과적으로, MM 세포는 어두운 링으로 둘러싸인 원형 밝은 디스크와 같은 이미지에 나타납니다. 알고리즘의 조정 등의 크기 및 형상과 같은 다른 형태 적 특징에 기초하여 별도의 암과 기질로 할 수 있지만 이와 같이, 현재의 형태에서의 분석은, 비 - 부착 암세포에 가장 적합하다. 이 프로토콜에서 우리는 (골수 유래 중간 엽 줄기 세포) BMSC와 HUVEC를, 골수 간질 및 혈관 주위의 틈새를 대표로, 세포 외 기질 (콜라겐 및 기저막 매트릭스)의 두 종류뿐만 아니라 공동 배양 두 가지 유형을 서술 각각. 384- 웰 플레이트를 사용하여 약물 농도 및 당 5 개의 복제, 우리는 TES 수 있었다단일 환자의 샘플 (31) 다른 약물에 T 최대. 기업도 1은 로봇을 이용한 피펫 최적 분포를 나타낸다 1536 웰 플레이트에서이 수는, 3은 수동 세포 시딩 사용되는 레이아웃 (127)을 도시도이다. 그림 3에서 디자인, 각 384 웰 플레이트 (21) 약물 테스트 (7) 다른 약물, 또는 한 환자 샘플 3 환자 샘플을 수행 할 수 있습니다. 각각의 약물 농도는 5로 표시되고, 각각의 상태는 중복 접종된다. 4 제어 우물은 (어떤 약물이 추가되지 않습니다) (7) 약물 (예, 우물 36-39, 126-129 및 200-203)의 각 세트에 대한 씨앗을 품고있다. 사용되는 약물의 효능을 확인하기 위해 인간 골수종 세포주 (예, H929 또는 MM1.S)도 시딩하고 (웰 76-89)를 사용 약제의 각각의 가장 높은 농도에서 중복 마취이다. 양 세포주 제어는 투여 량 반응 곡선을 비교 AC 때문에 사용 약물, 충분한 효능을 가질 수 있습니다로스 실험. 두 개의 웰 (75 웰, 90) 촬상시 벤치 탑 인큐베이터에서 발생할 수있는 문제를 검출하는, 즉, 환경 조건에 대한 제어와 같은 골수종 세포주로 접종된다. 웰 열거 획득 시간을 감소시키고, 장비의 마모를 감소 현미경 동력 스테이지에 의해 덮여 거리를 감소시키기 위하여 지그재그 패턴을 따른다.

<table><tbody><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td><td>AMAFD1000 + AMC1000</td><td>전동 스테이지와 벤치 탑 인큐베이터가 장착된 디지털 현미경.</td></tr><tr><td>384웰 플레이트 CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3683 SIGMA</td><td>Corning CellBIND 384웰 플레이트 384웰 플레이트, 폴리스티렌, CellBIND 표면, 멸균, 투명 평면 바닥, 검정색, 뚜껑 포함</td></tr><tr><td>1,536웰 플레이트 CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3832 ALDRICH</td><td>Corning 1,536웰 플레이트, 저기, 표면 처리 CellBIND, 멸균</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE17-1440-02 시그마</td><td>인간 말초 혈액에서 림프구의 in vitro 분리를 위해.</td></tr><tr><td>CD138 자석 구슬</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>CD138+ 세포 선택을 위한 항체 접합 마그네틱 비드.</td></tr><tr><td>LS 칼럼</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>&nbsp; 130-042-401</td><td>세포 분리용 컬럼</td></tr><tr><td>MidiMACS 분리기</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>분리기둥용 자석.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>ECM 젤 Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 Medium + L-글루타민 + 페놀 레드</td></tr><tr><td>FBS 열 비활성화</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, 미국 원산지</td></tr><tr><td>3.1 mg/ml 소 콜라겐 유형 I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td>소 콜라겐 솔루션, 유형 I, 3 mg/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Precision XS</td><td>BIOTEK</td><td>PRC3841</td><td>로봇 피펫터 시스템</td></tr></tbody></table>

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 organotypic 높은 처리량 시스템

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

본 연구에서 우리는 환자 유래 다발성 골수종 (MM) 세포의 감수성 및 이질성을 추정 생체 약물 민감성 분석 및 디지털 이미지 분석을 결합한 새로운 접근법을 설명한다. 이 방법은 환자 - 갓 외 기질 (콜라겐 또는 기저막 매트릭스)과 간질 (각각 포함하는 골수 미세 환경의 재구성 구성된 멀티 웰 플레이트에서 구현 미세 유체 챔버 내로 골수 흡 인물에서 추출 일차 MM 세포를 시드로 이루어져 유래 중간 엽 줄기 세포) 또는 인간 유래 혈관 내피 세포 (HUVEC를). 챔버는 다른 에이전트 및 농도로 마취하고, 디지털 카메라가 장착 된 전동식 현미경, 명 시야 현미경을 통해 96 시간 동안 순차적으로 촬상된다. 디지털 영상 분석 소프트웨어가 존재 또는 멤브레인의 움직임의 유무를 라이브 및 사균을 검출하고, 함수 O로 생존의 변화 곡선을 생성F 약물 농도와 노출 시간. 우리가 각각의 약물에 대한 종양의 감수성 인구의 파라미터뿐만 아니라 종양 이종 척도로서 본 하위 집단의 수를 결정하는 연산 모델을 사용한다. 이러한 환자 맞춤형 모델은 치료법을 시뮬레이트 및 임상 응답을 추정하는데 사용될 수있다.

실험의 흐름은 간단히도 1에서 설명하는 모든 단계가 성공적으로 완료되는 경우, 현미경에 의해 얻어지는 화상이도 2와 동등해야한다 :. MM 세포 명확 밝은 디스크 및 BMSCs 또는 HUVEC를 거의 볼 수 있어야 보지되어야 라이브 잘 배경 분포. 도 2a에 도시 된 바와 같이, MM 세포는 한 환자로부터 다른 크기가 다양하지만, 일반적으로 그들은 세포주보다 작다. 그들이 실질적 실험 간격 동안 생체 외에서 복제하지 않기 때문에 (96 시간)은 그들이 더 높은 농도 (1-3000000 세포 / ml)에 접종 할 수있다. BMSC가 낮은 프로파일을 제시, 잘 스트레치의 바닥에 부착 기질로는 거의 감지 할 수 있어야합니다. 인간 골수종 세포주 H929 환자 유래 MM 세포 (도 2B)보다 상당히 크고, 24 시간 내에 복제. 화상의 군집을 방지하기 위해, MM 세포주 참조되고낮은 밀도, 0,30...

원발성 다발성 골수종 세포에 대한 고처리량 약물 감수성 분석을 설명합니다. 이는 멀티웰 플레이트에서 골수 미세환경(세포외 기질 및 기질 포함)을 재구성하는 것과 세포 생존율의 종적 정량화를 위한 비침습적 방법으로 구성됩니다.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

이 절차의 전반적인 목표는 다발성 골수종 일차 세포의 다양한 화학요법제에 대한 화학 민감도를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 신선한 골수 흡인물에서 분리한 다발성 골수종 세포를 사전 배양된 환자 유래 기질 및 콜라겐과 혼합함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 CEL 혼합물을 멀티웰 플레이트에 분주합니다.그 후 세포를 관심 있는 화학요법제로 처리하고, 96시간의 배양 기간 동안 세포를 순차적으로 이미지화하기 위해 플레이트를 전동 스테이지 현미경의 인큐베이터로 옮깁니다. 최종적으로 디지털 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 각 약물 및 농도에 대한 생존율 곡선을 생성할 수 있습니다. 기존의 종점 생존력 분석법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 환자 검체에 대해 여러 화학요법제를 테스트할 수 있다는 점과, 세포를 기질이나 매트릭스로부터 분리할 필요 없이 며칠 동안 환자 세포의 생존력을 종단적으로 측정할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 이론적으로 특정 화학요법 요법에 대한 임상적 반응을 예측하는 데 사용될 수 있어 조혈성 종양 치료로까지 확장됩니다. 저희는 원래의 미세유체 슬라이드를 멀티웰 플레이트로 교체하면 실험 완료에 필요한 비용과 시간을 크게 줄일 수 있다는 점을 깨닫고 이 프로토콜에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 일차 다발성 골수종과 골수 유래 중간엽 줄기세포 공배양을 준비하려면, 먼저 세포를 RPMI 1640에 최종 농도의 6배로 부유시켜 시작하십시오.다음으로, 각 세포 유형 50 µL를 갓 준비한 1형 콜라겐과 섞어 최종 부피를 300 µL로 맞춥니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 384-웰 플레이트의 각 웰 중앙에 세포 매트릭스 혼합액 8 µL를 수동으로 분주하고, 플레이트를 원심분리하여 모든 세포가 동일한 초점 평면에 집중되도록 합니다.원심 분리 후, 젤이 중합될 수 있도록 세포 배양 조건에서 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 보충된 성장 배지 80 µL를 첨가하고, 스트로마가 플레이트 바닥에 부착될 수 있도록 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 로봇 피펫터를 사용하여 다발성 골수종 스트로마 공배양을 준비하려면, 앞서 시연한 것과 같이 CD 1 38 양성 다발성 골수종 세포 300 µL와 스트로마 세포 300 µL를 최종 희망 밀도의 6배 농도로 RPMI 1640 배지에 부유시키는 것부터 시작하십시오.그다음 CD 1 38 posit

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우리는 organotypic 종양 조직 조각에 있는 실시간 약 반응을 측정하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 여기에 설명된 실험 전략은 생체 내 조건에서 임상 또는 마우스 종양에서 유래한 조직 조각에 중고 처리량 약물 스크린을 수행하는 플랫폼을 제공한다.

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

이 프로토콜은 NSCLC 환자 유래 오가노이드 모델에서 표적화된 신호전달 억제제에 대한 약물 민감성의 표준화된 평가를 기술한다.

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

여기에서는 인류 세포 분석 기반 방법을 사용하여 마우스에 이종 이식하고 골수 흡인에서 얻은 급성 인간 골수성 백혈병 세포에서 mTORC1, JAK/STAT5 및 MAPK 경로의 다운스트림 신호를 분석합니다. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 및 p-ERK1/2 수준은 고감도의 차세대 스펙트럼 유세포 분석기를 사용하여 동시에 측정됩니다.

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

학습하세요 다발성 골수종 원발 세포의 약물 민감도를 정량화하는 고처리량 organotypic 분석법을 통해 골수 미세환경을 보존하며 세포 생존율을 장기적으로 측정하는 방법을 익히세요.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

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