차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 다발성 골수종 일차 세포의 다양한 화학요법제에 대한 화학 민감도를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 신선한 골수 흡인물에서 분리한 다발성 골수종 세포를 사전 배양된 환자 유래 기질 및 콜라겐과 혼합함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 CEL 혼합물을 멀티웰 플레이트에 분주합니다.

그 후 세포를 관심 있는 화학요법제로 처리하고, 96시간의 배양 기간 동안 세포를 순차적으로 이미지화하기 위해 플레이트를 전동 스테이지 현미경의 인큐베이터로 옮깁니다. 최종적으로 디지털 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 각 약물 및 농도에 대한 생존율 곡선을 생성할 수 있습니다. 기존의 종점 생존력 분석법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 환자 검체에 대해 여러 화학요법제를 테스트할 수 있다는 점과, 세포를 기질이나 매트릭스로부터 분리할 필요 없이 며칠 동안 환자 세포의 생존력을 종단적으로 측정할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 함의는 이론적으로 특정 화학요법 요법에 대한 임상적 반응을 예측하는 데 사용될 수 있어 조혈성 종양 치료로까지 확장됩니다. 저희는 원래의 미세유체 슬라이드를 멀티웰 플레이트로 교체하면 실험 완료에 필요한 비용과 시간을 크게 줄일 수 있다는 점을 깨닫고 이 프로토콜에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 일차 다발성 골수종과 골수 유래 중간엽 줄기세포 공배양을 준비하려면, 먼저 세포를 RPMI 1640에 최종 농도의 6배로 부유시켜 시작하십시오.

다음으로, 각 세포 유형 50 µL를 갓 준비한 1형 콜라겐과 섞어 최종 부피를 300 µL로 맞춥니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 384-웰 플레이트의 각 웰 중앙에 세포 매트릭스 혼합액 8 µL를 수동으로 분주하고, 플레이트를 원심분리하여 모든 세포가 동일한 초점 평면에 집중되도록 합니다.

원심 분리 후, 젤이 중합될 수 있도록 세포 배양 조건에서 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 보충된 성장 배지 80 µL를 첨가하고, 스트로마가 플레이트 바닥에 부착될 수 있도록 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 로봇 피펫터를 사용하여 다발성 골수종 스트로마 공배양을 준비하려면, 앞서 시연한 것과 같이 CD 1 38 양성 다발성 골수종 세포 300 µL와 스트로마 세포 300 µL를 최종 희망 밀도의 6배 농도로 RPMI 1640 배지에 부유시키는 것부터 시작하십시오.

그다음 CD 1 38 positive라고 표시된 1.5 milliliter 튜브에 두 세포 유형을 함께 혼합하고, 해당 튜브를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이어서, 최종 희망 밀도의 6배가 되도록 RPMI 1640 배지에 적절한 다발성 골수종 세포주 60 microliters와 기질 세포 60 microliters를 부유시킨 후, 이 두 세포 유형을 cell line이라고 표시된 두 번째 1.5 milliliter 튜브에 함께 혼합하여 마찬가지로 37 degrees Celsius에서 배양합니다. 로봇 피펫에 세포 파종 스크립트 파일을 로드합니다.

그런 다음 로봇의 스테이션 A에 200 µL 피펫 팁 박스를, 스테이션 B에 마이크로타이터 플레이트를, 스테이션 E에 멸균된 384-well 플레이트를 배치합니다. 이어서 CD 1 38 양성 세포 혼합물을 갓 준비한 CD 1 38 혼합 배지 튜브에 섞은 후, 결과물인 세포 용액 1.5 mL를 마이크로타이터 플레이트의 1번 well로 옮깁니다.

나머지 세포들을 얼음 위에 두고 프로그램을 시작하십시오. 로봇이 384-웰 플레이트의 처음 176개 웰에 세포를 분주한 후 일시 정지할 것입니다. 이 시간을 이용하여 남은 CD 1 38 양성 세포들을 마이크로타이터 플레이트의 2번 웰로 옮긴 후 프로그램을 재개하십시오.

로봇이 플레이트의 나머지 144개 웰을 인식하고 다시 일시 정지할 것입니다. 이제 세포주 튜브의 세포를 갓 준비한 세포주 프리믹스 튜브와 혼합하여 그 내용물을 마이크로타이터 플레이트의 3번 웰로 옮기십시오. 그런 다음 프로그램을 다시 재개하여 로봇이 384웰 플레이트의 나머지 64개 웰에 세포를 분주하도록 하십시오.

마지막 웰에 세포 분주가 완료되면, 세포를 원심 분리하고 공동 배양물을 콜라겐 중합을 위해 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 1시간 후, 로봇에 배지 층 스크립트를 로드하고 스테이션 A에 120 µL 피펫 팁 박스를, 스테이션 B에 태아 송아지 혈청, 환자 혈장 및 항생제가 첨가된 31 mL의 RPMI 1640 배지가 담긴 시약 리저버를, 그리고 스테이션 E에 CED 3 84-웰 플레이트를 배치합니다. 그런 다음 프로그램을 실행합니다. 로봇이 각 웰에 첨가된 배지 81 µL를 분주합니다.

로봇 작업이 완료되면, 기질에 스트로마가 밤새 부착될 수 있도록 세포를 인큐베이터로 옮깁니다. 파종된 세포에 관심 약물을 처리하려면, 먼저 로봇 피펫터 사용자 인터페이스에 배지 층 약물 플레이트 스크립트를 로드하십시오. 그런 다음 스테이션 A에 120 µL 피펫 팁 박스를, 스테이션 B에 FPS 환자 혈장과 항생제가 첨가된 RPMI 1640 21 mL가 담긴 리저보어를, 스테이션 E에 빈 3 84-well 플레이트를 배치하고 프로그램을 실행하면, 로봇 피펫터가 모든 웰에 배지 30 µL를 추가합니다.

3개의 84-well 플레이트를 준비합니다. 그 후 템플릿에 따라 각 마이크로타이터 플레이트의 웰에 최대 농도의 20배 농도로 희석된 약물 200 µL를 대조군 웰까지 첨가합니다. FBS, 환자 혈장 및 항생제가 보충된 배지를 추가합니다.

그 다음 A 스테이션에 120 µL 피펫 팁 박스를, B 스테이션에 약물이 담긴 마이크로타이터 플레이트를, C 스테이션에 배지가 담긴 384-웰 플레이트를 배치하고 약물 플레이트 프로그램을 로드합니다. 로봇 피펫터가 이 그림에 표시된 것과 같이 1:3 연속 희석을 수행합니다. 이제 A 스테이션에 새 120 µL 피펫 팁 박스를, B 스테이션에 희석된 약물이 담긴 384-웰 플레이트를, C 스테이션에 세포가 분주된 384-웰 플레이트를 배치하고 약물 첨가 프로그램을 실행합니다.

로봇 피펫터가 약물 플레이트의 각 웰에서 8 µL의 약물을 세포 플레이트의 대응하는 웰로 옮깁니다. 마지막 웰까지 처리가 완료되면 즉시 세포 플레이트를 디지털 현미경의 인큐베이터로 옮기십시오. 그 다음 세포를 이미징하기 위해, 에탄올 젖은 물티슈로 벤치탑 인큐베이터 내부를 닦아내고 플레이트의 덮개를 인큐베이터의 덮개와 조심스럽게 교체하십시오.

다음으로, 실험 중에 순차적으로 촬영할 관심 영역의 랜드마크를 추가하는 소프트웨어 단계를 수행하십시오. 마지막으로, 5배 또는 10배 배율의 대물렌즈를 사용하여 다발성 골수종 세포가 어두운 고리로 둘러싸인 밝은 원반 형태로 보이고 기질 세포는 거의 보이지 않을 때까지 초점을 맞추십시오. 본 실험에서 살아있는 다발성 골수종 세포는 녹색으로 가색 처리되었으며, 모든 다발성 골수종 세포가 사멸한 최고 약물 농도에서의 실험 종료 시점에는 기질 세포와 인간 제대 정맥 내피 세포에서 녹색 신호가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았습니다.

그 다음 로봇 소프트웨어를 사용하여 시간이 경과함에 따라 서로 다른 약물 농도에 노출되어 발생하는 점진적인 생존율 저하를 측정했습니다. 이미지 분석 소프트웨어가 아티팩트로 인해 잘못된 판단을 내려 부정확한 결과가 도출될 수 있으므로, 이미징 프로세스를 시작하기 전 모든 세포 파종 웰을 주의 깊게 관찰하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 여기서는 기질 세포의 밀도가 너무 높거나 트립신 처리와 파종 사이의 시간이 너무 길어 이 이미지에서 보는 것처럼 세포 뭉침 현상이 형성된 결과가 나타나 있습니다.

세포주를 너무 높은 밀도로 분주하면 복제 과정에서 콜로니가 형성되어, 개별 세포를 구분하기가 점점 어려워지므로 디지털 이미지 분석 알고리즘의 정확도가 떨어지게 됩니다. 골수 흡인물에서 얻은 다발성 골수종 세포 수가 500,000개 미만인 경우, 다발성 골수종 세포를 너무 적게 분주한 것입니다. 세포를 분주하기 전에 사용하는 튜브의 사용량(dead volume)을 결정하고 이를 희석 계산에 포함시켜야 합니다. 이 기술에 숙달되면 2~3시간 내에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 세포가 준비되기 전에 중합 반응이 일어나는 것을 방지하기 위해 콜라겐이 포함된 혼합 배지를 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 또한, 이는 종양 부담의 화학요법 민감도 이질성이 환자 반응의 깊이와 지속 기간을 어떻게 결정하는지 탐구하는 데 도움이 되었습니다.