Name: 표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 효모 염색체의 표면 확산 및 면역 염색 기법을 통해 염색체 결합 단백질을 형광 현미경으로 시각화하는 방법을. 이 기법은 세포벽 제거와 삼투압 충격을 활용하여 유전학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 NIH 보조금 GM50936 DKB의 지원을 받았습니다.

참고 : 프로토콜의 일부 단계 아래 깨끗한 흄 후드에서 작업이 필요합니다. 또한, 상기 방법은 spheroplasting을 모니터링 10X 작동 거리가 긴 대물 렌즈를 구비 한 효모 테트라 해부 현미경을 필요로한다. 현미경은 미리 후드에 설치해야합니다. 범위에서 미세 조작기의 팔과 판 홀더를 제거하고 멀리 작업 영역에서 안전한 장소에 이러한 항목을 배치합니다. Spheroplasts 1. 준비 <ol><li> 원하는 조건 하에서 효모 성장. OD600 = 1.4 5 × 107 세포 / ㎖에서 각각의 샘플에 대해 2 × 108 세포, 즉 배양 4㎖를 사용. 샘플의 즉각적인 처리가 어떤 경우에는 바람직 할 수 있지만, 대부분의 애플리케이션에 대해, 세포 분취 액 처리되기 전 최대 8 시간 동안 얼음 상에 저장 될 수있다. </li><li> 세포 펠렛 3 분 5 (2345 RPM / 857.5 XG)를 설정에서 임상 원심 분리기에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. </lI&gt; <li> 펠렛에서 세포를 잃지 않도록 매체 복용 치료를 가만히 따르다. 부드럽게 1 ML의 ZK 버퍼에있는 세포를 재현 탁하고 40 μL 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. 부드러운 혼합 2 분을 품어. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). </li><li> 1 ML의 ZK 버퍼에 재현 탁 펠렛. 완전히 혼합 된 zymolyase 100T의 새로 제조 액 5 μl를 추가합니다. 세포벽을 제거한 spheroplasts을 제조 30 ℃에서 20-30 분 동안 인큐베이션. </li><li> spheroplasting가 완료되었는지를 결정하기 위해 현미경 슬라이드에 세포 현탁액 10 μL 액적 분석. 커버 슬립없이 해부 현미경으로 본 세포. 세포가 부풀어 둥근보다는 약간 타원형 표시해야하며, 물 20 ㎕를 첨가 한 다음 용균한다. 세포 용균하지 않으면 물에 의한 분해가 쉽게 관찰 될 때까지 매 10 분, 30 ℃로 샘플을 반환하고 다시 분석. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). </li><li> 부드럽게 재현 탁 세포 펠렛 내가 씻어N 2.5 ml의 차가운 MES / 소르비톨 버퍼입니다. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). 부드럽게 300-400 μL 감기 MES / 소르비톨 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. 세포를 수 시간 동안이 단계에서 얼음에 보관 될 수있다. </li></ol> 확산 2. 염색체 참고 : 염색체 - 확산 중 슬라이드 나 될 때 유리 표면 된 커버는-한다 미리 준비하십시오. 각 슬라이드 또는 커버 슬립이 물에 잠긴해야하고 EtOH로는, 다음 건조시키고, 렌즈 페이퍼로 연마. 염색체가 된 커버에 확산 될 경우, 커버 슬립은 스카치 테이프 나 고무 시멘트와 슬라이드에 부착해야한다. 특별히 언급하지 않는 한, 프로토콜의 나머지 부분은 하나의 슬라이드 나 커버 슬립 확산 설명한다 <ol><li> 깨끗한 슬라이드의 표면에 P20의 피펫, 피펫 세포 현탁액 20 μL를 사용. </li><li> P200에 피펫을 사용하여, 3 % PFA / 수크로오스 용액 40 μL를 추가하고 부드럽게 혼합 solutio슐 리렌 라인이 사라질 때까지 손으로 슬라이드를 &quot;소용돌이&quot;에 의해 N. 현미경 슬라이드를 놓고 세포에 초점이 있음을 확인합니다. PFA 솔루션은 사용 당일 흄 후드에서 갓 준비를해야합니다. 주 : 관심의 단백질이 이전의 방법에 의해 조사되지 않은 경우, 그 단백질의 보존이 정착 조건에 민감인지 확인 (2) 및 4 % PFA를 포함하는 용액을 사용하여 추가 슬라이드를 준비하는 것이 바람직하다. 4 % PFA / 수크로오스 용액은 미세 소관 연관 튜 불린을 시각화 바람직한 경우에 사용된다. 높은 정착 농도의 단점은 염색체가 될 것입니다 &quot;underspread,&quot;2 % PFA는 &quot;underspread&quot;염색체를 생성하는 경향이있다. </li><li> P200의 피펫을 사용하여, 완전히 가능한 한 솔루션을 혼합하기 전에 소용돌이, 타이머를 시작, 1 % Lipsol의 80 μl를 추가합니다. Lipsol를 사용할 수없는 경우, 80 μL 1 % NP40 80 μL의 DH 2 O가 될 수있다(그림 2를 대표 결과를 참조) 교체. </li><li> 슬라이드마다 15 초 소용돌이 조심스럽게 부드럽게 세포를보십시오. 세포의 약 80 %가 용해되면, 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거, 타이머를 중지 PFA / 자당 용액 80 μl를 추가하고, 소용돌이 혼합 (사라). 용해는 타이머를 시작한 후 30 사이에 90 초에서 발생한다. 주 : 여러 슬라이드 거의 동시에 용해를 보여 주면, 하나 결국 슬라이드의 나머지 현미경 모니터링을 생략하고 단순히 신중 lipsol 및 고착성의 최종 분취 량의 첨가의 첨가 기간을 사이에 시간이있다. 동일한 샘플에서 여러 슬라이드를 준비 할 때 그러나,이 지름길은 신뢰할 수있다. 다른 슬라이드가 서로 다른 시간에 촬영 한 샘플이나 다른 문화에서 준비 때 현미경으로 각 샘플의 용해를 모니터링하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 깨끗하고 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 전체 unfrosted SURFAC에 걸쳐 액체를 확산「웅덩이」의 메 니스 커스 아래에 있지만, 즉 슬라이드 자체의 표면 위에 유지 깨끗한 목장 일회용 피펫의 측면을 사용하여 슬라이드의 전자. 피펫과 슬라이드의 표면을 &quot;긁어&quot;하지 않습니다. 샘플의 오염을 방지하기 위해 다른 슬라이드에 피펫을 재사용하지 마십시오. </li><li> 흄 후드에서 하룻밤 건조 슬라이드를 남겨주세요. 불용 성분은 핵 슬라이드 표면에 정착하고 결합한다. 많은 실험에서, 건조 단계를위한 공간의 사용을 계획하는 것이 중요하다. </li><li> 건조 후에, 최적의 결과는 같은 날 면역 단계로 진행하여 획득된다. 그러나, 건조 수크로오스 용액을 동결 샘플을 허용 &quot;꿀&quot;의 확산 염색체를 내장 : 슬라이드는 슬라이드 플라스틱 상자로 옮기고 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 면역 염색 <ol><li> 30 초 동안 0.2 % 사진 - 플로의 딥​​ 슬라이드. 꿀을 제거합니다. 에 린 슬라이드모서리, 가장자리는 종이 타월에 쉬고, 잔류 포토 플로를 제거합니다. </li><li> 5 분 1X TBS에서 딥 슬라이드 씻어. 가장자리에 슬라이드를 기대어으로 물기를 제거하지만, 그들을 건조하게하지 않습니다. </li><li> 면을 위로, 피펫 300 μL TBS / BSA 슬라이드의 unfrosted 부분에서 슬라이드에 프로스트 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 15 분 동안 실온에서 습기 챔버에 품어. (포화 종이 타월로 천공 된 금속판 또는 플라스틱 슬라이드 상자에서 물 포화 종이 타올 늘어서 대형 플라스틱 용기). </li><li> 종이 타월에 슬라이드의 짧은 가장자리 휴식 (예 : 테스트 튜브 랙 등) 적절한 지원에 대한 슬라이드를 기대어으로 슬라이드를 배출합니다. 표면이 건조하지 않도록하십시오. </li><li> 즉시 차 항체의 적절한 희석을 포함하는 TBS / BSA 버퍼의 80 μl를 적용합니다. 항체가 제한되어있는 경우, 40 μL와 22 X 22mm의 coverslip에 사용합니다. 조 토끼 혈청의 경우, 이는 전형적으로 1/50 1/500 희석 사이이다. 노트:새로운 항체 제제에 적정을 수행합니다. 배경 위의 높은 신호를 산출 가장 묽은 준비가 선택됩니다. 사전 면역 혈청으로 염색해야한다 배경 염색의 레벨에 맞는 제어하기 위해, 핵은 해당 삭제 돌연변이 균주 및 / 또는 중복 슬라이드에서 준비를해야합니다. </li><li> 거품을 피하는 슬라이드에 광택 22 X 50mm의 coverslip에 배치합니다. 하나의 짧은 가장자리 근처에 위치에 긴 가장자리를 따라 엄지 손가락과 검지 손가락 사이의 커버 슬립을 개최하여이 작업을 수행합니다. 30 °의 각도로 커버 슬립을 잡고 그냥 &quot;웅덩이&quot;슬라이드의 프로스트 지역에 가장 가까운 가장자리 안쪽 슬라이드에 닿을 때까지 손가락의 짧은 가장자리 먼이 저하되고, 슬라이드. 그런 다음 천천히 슬라이드 터치 벤치를 잡고 손가락까지 부드러운 동작으로 커버 슬립을 절감하고 놓습니다. 이 땅을 한 번 커버 슬립의 위치를​​ 조정하지 마십시오. 참고 : 염색체 스프레드가 준비 되었다면부착 된 커버 (보다는 직접에 슬라이드의 표면),이 샘플 커버 슬립은 염색 및 세척 단계에 걸쳐 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다. 추가 커버 슬립은 염색 후 폐기시 균일 항체 용액을 분배하는 샘플 커버 슬립 위에 배치 될 것이다. </li><li> 밀봉 된 습기 챔버에 넣어 슬라이드 및 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 유리 슬라이드 염색 랙에 프로스트 에지 전송에게 슬라이드를 잡고 TBS를 포함하는 염색 항아리에 잠수함. </li><li> 부드럽게 커버 슬립을 제거하기 위해 위 아래로 슬라이드를 찍어. 이 작업을 수행하기 위해 너무 많은 힘을 사용하지 않도록하십시오. TBS에서 침수에 의해 10 분 2 배 슬라이드를 씻으십시오. 랙에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 가장자리를 터치하여 초과 액체를 배출. 표면 건조하게하지 마십시오. </li><li> 부드러운 조명 아래에서 작업을 즉시 80 μL TBS / BSA는 형광 색소 결합 된 이차 항체 (또는 22 X 22mm의 coverslip에 40 μL)의 1 / 1,000 배 희석액을 포함하는 추가합니다. 광고그리고 이전과 개발 커버 슬립은 어둠 속에서 습한 챔버에서 2 시간 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 이전으로 된 커버를 제거 슬라이드를 배출하고, 어둠 속에서 1 ~ 2 시간 동안 자연 건조에 표면을 할 수 있습니다. 이전과 종이 타월에 엎드려서 슬라이드. 참고 : 확산하는 것은 장착 커버 슬립에 수행 된 경우, 건조하기 전에 슬라이드에서 커버 슬립을 분리합니다. 이전 단계에서 설명한 바와 같이 슬라이드의 커버 슬립을 건조한다. </li><li> 부드러운 조명 아래에서 작업, DAPI (세 10 μL 방울)를 포함하는 매체를 장착 약 30 μl를 추가 한 다음 조심스럽게 커버 슬립을 낮 춥니 다. 스프레드가 된 커버에있는 경우, 깨끗한 슬라이드에 장착 매체의 방울을 배치하고 슬라이드에, 아래로 커버 슬립, 염색체 측을 내립니다. </li><li> 여전히 부드러운 조명 아래, 정착 분명 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 coverslip에 대한 2 분을 기다립니다. 평면 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 참고 : STED 현미경, 연장 금으로 마운트합니다. 연장 금의 30 μl를 사용하여및 DAPI없이 하룻밤 치료 할 수 있습니다. 매니큐어로 밀봉하는 것은 불필요하다. </li><li> 40 100X 목적은 DAPI가 초점을위한 적절한 설정 필터를 사용하여와 위드 표면 형광 현미경으로보기 슬라이드. 선택적으로 몇 주 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다. 냉동하지 마십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

확산 핵의 모양은 고정과 용해/세제 처리 사이의 균형에 결정적으로 의존합니다. 위에서 논의한 바와 같이, 다양한 세포 구조를 보존하려면 다양한 PFA 농도를 사용해야 합니다. 대부분의 단백질에는 3% PFA가 최적입니다. 그러나 스핀들을 보존하려면 4% PFA를 사용해야 합니다. 단일 시약 세트를 사용하더라도 고정에 대한 용해 시기도 확산 핵의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 가장 일관된 결과를 얻으려면 광학 현미경으로 용해를 직접 관찰하여 각 스페로플라스트 샘플에 대한 용해 시간을 정규화해야 합니다. 훈련된 눈에는 둥근 구형체가 용해 전에 부풀어 오르면서 어두워집니다. 용해 후 세포 잔해는 떠다니는 "유령"으로 나타납니다. 실험적으로 최적화된 시약 농도와 타이밍의 샘플 간 표준화의 조합은 일관되게 잘 퍼진 핵을 산출합니다. 
확산 염색체를 시각화하는 데 사용되는 형광단과 현미경의 선택은 원하는 구조에 따라 다릅니다. 일반적으로 퍼진 핵은 매우 얇고(약 200nm 이...

출아 효모 사카로 마이 세스 세레 비지 염색체 기능을 조절하는 단백질에 대한 연구를 포함한 생물학적 과정의 분자 메커니즘의 연구에 많은 이점을 제공한다. 유전 적 분자 및 생화학 적 연구를위한 효모 신진의 공지의 장점이 있지만, 세포의 핵 단백질의 분포의 세포 학적 연구는 작은 크기에 의해 복잡하게된다. 전형적인 효모 핵은 가시광의 단지 약 5 배의 해상도 한계 미만 1 미크론의 직경을 갖는다. 따라서, 종래의 면역 염색에서 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그를 사용함으로써 얻어 질 수 핵 단백질의 분포에 대한 정보의 양이 제한된다. 단백질 subnuclear 분포를 특성화하는 유용한 방법은 확산 염색체 표면이다. 이 접근법은, 세포벽을 제거하고 세포 핵막 및 중단을 포함llowing 핵의 불용 내용 현미경 슬라이드의 표면에 정착한다. 이 불용성 성분은 핵 매트릭스와 염색체를 포함한다. 염색질 결합 단백질을 감지하는 능력을 향상 가용성 핵 콘텐츠의 삭제를 가능하게하는 것 외에도, 이러한 확산 핵 주위이 3 μm 내지 5의 직경을 가지고 (이배체 감수 핵 대) 염색체의 실질적인 신장에있어서의 결과를 확산 염색체 2 배체 유사 분열 핵에 대한 μm의 3. 이 압축 해제는 그대로 핵에 해결할 상대적으로 어렵거나 불가능 핵 하부의 검출 할 수있다. 확산 염색체 명백한 단점은 확산 과정은 관심의 구조를 부분적으로 또는 완전히 중단 할 가능성이다. 특히 관심의 특정 염색체 결합 단백질 확산 과정의 결과로서 손실 될 수 있다는 것이다. 이 잠재적 인 합병증 수오데이터를 해석 할 때, LD는 명심. 확산 과정에 민감한 단백질의 하나의 예는 베타 - 튜 불린이다. 일부 조건 하에서, 주로 튜 불린 구성되는 스핀들, 3, 확산 중에 보존된다. 스핀들의 시각화는 종종 관심의 핵를 준비하는 데 유용합니다. 그러나, 튜 불린을 떠올리 고농도 정착액 치료를 필요로; 스핀들은 후술하는 표준 조건 하에서 손실된다. 이 예는 이전에 규명하지 않은 단백질의 분포를 분석 할 때, 그 단백질이 이러한 변화에 얼마나 민감한 결정 정착액의 농도를 변화시키는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 염색체 구조에 확산 조건의 영향에 대한 우려에도 불구하고, 확산 방법의 유용성 및 전원은 많은 콘텍스트에서 설명과 유사 분열의 특성화 및, 특히 4-7 감수 세포에 다양한 유틸리티가되었다. TWO 확산 방법이 널리 사용되어왔다. 드레서 및 지로 (8)에 의해 개발 된이 방법의 첫 번째, 세제의 사용을 회피하고, DNA 특이 적 염색을 위해 DAPI 염색 때 비교적 잘 보존 염색체 형태를 갖도록 표시 확산 제제를 수득 할 수있다. 그러나,이 방법은 완전 비교적 어렵고 하나의 슬라이드 영역이 다른 영역에 비교 될 때 확산 핵의 품질은 크게 달라진다. 이 문제는 데이터 수집 바이어스를 피하기 위해 하나의 슬라이드에서 다수의 선택되지 않은 핵 촬상 포함 정량적 방법을 복잡하게 할 수있다. Loidl과 클라인 (1)에 의해 개발 된 방법을 확산 번째 염색체는, 용해 및 세제에 의해 추진 염색질 압축 해제와 함께, 파라 포름 알데히드로 고정 균형을 포함한다. 제대로 수행되면,이 방법은 드레서와 지로 방법에 비해 적은 지역 간 지역 변화에 매우 재현 가능한 결과를 제공합니다. 이 프레젠테이션은 변형 된에 초점을 맞추고때문에 그것의 신뢰성과 단순성의 Loidl과 클라인의 방법의 D 버전. 염색체 확산은 복잡하거나 시간 소모적 아니다; 최대 100 슬라이드는 하루에 대한 면역 염색을 제조 할 수있다. 또한, 확산 제로는 종래 면역 년 동안 냉장고에 저장 될 수 있고, 이에 따라 랩 새로운 생물학적 질문이 발생하거나 새로운 염색 시약이 제공 될 때 사용할 수있는 냉동 염색체 스프레드 저장소를 개발할 수있다. 염색체 확산 방법이 가장 일반적으로 면역 염색과 위드 형광 현미경과 조합하여 사용되지만, 그와 같은 유도 방출 고갈 (STED) 현미경 등의 수퍼 - 해상도 광 현미경 방법을위한 슬라이드를 제조하는 것도 가능하다.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>미국 생물학적&nbsp;</td><td>Z1004</td><td>20% 포도당이 보충된 50mM Tris pH 7.5에 2mg/mL 용액을 준비합니다. 신선한 각 실험을 준비하고 4°C에 보관하십시오. 사용할 준비가 될 때까지 C.</td></tr><tr><td>립솔&nbsp;</td><td>L.I.P. 주식회사&nbsp;</td><td>더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않습니다</td><td>.물에 1%(V/V) 용액을 준비합니다. 얼음에 보관하세요.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>물에 1%(v/v) 용액을 준비합니다. 얼음에 보관하세요.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>표준 커버슬립</td><td>Fisher</td><td>12-544-E 또는 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>고해상도 커버슬립</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 솔루션</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>물 속에 0.2% (v/v) 용액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>TBS에서 1 % (w / v) 용액을 준비합니다. 4 °C에 보관하십시오. C를 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1차 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>건조 스프레드가 들어있는 슬라이드를 -20°C의 슬롯에 보관하십시오. 또한 습식 챔버로 사용하십시오.</td></tr><tr><td>골판지 슬라이드 박스</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>스테인드/밀봉된 슬라이드를 편리하게 운반하거나 4°C에 보관하는 데 사용합니다.</td></tr><tr><td>코플린 항아리</td><td>피셔</td><td>08-816</td><td>슬라이드용 세면대로 사용하세요.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

싹트는 효모 Saccharomyces cerevisiae의 핵 크기가 작기 때문에 염색질 결합 단백질의 핵 미만 분포 분석을 위한 광학 현미경의 유용성이 제한됩니다. 효모 핵의 표면 퍼짐은 결합된 단백질의 손실 없이 염색질의 확장을 초래합니다. 표면 확산 방법은 세제 처리와 DNA 결합 단백질의 고정 균형을 맞춥니다. 시연된 방법은 Josef Loidl과 Franz Klein1,2에 의해 기술된 것에서 약간 수정되었다. 이 방법은 유사분열 세포주기의 다양한 단계에서 많은 염색질 결합 단백질의 국소화를 특성화하는 데 사용되었지만 감수분열 재조합솜 및 시냅톤말 복합체와 같은 감수분열 염색체 구조 연구에 특히 유용합니다. 우리는 또한 원래 절차에서 요구되었지만 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않은 독점 세제인 Lipsol의 사용을 필요로 하지 않는 변형에 대해 설명합니다. 염색체 확산 방법과 호환되는 면역염색 프로토콜도 설명합니다.

확산 핵의 모양은 매우 염색체 고정 및 드 압축 사이의 균형에 따라 달라집니다. 시약이 적절하게 균형 때에도 염색체 디 응집도의 변동 및 / 또는 다른 슬라이드 간 동일한 슬라이드의 상이한 영역에서 발생할 수있다. 화상 해석되기 전에 따라서, 슬라이드의 소정 영역에 확산의 품질을 평가한다. &#39;전면 도포&#39;와 &#39;underspreading &quot;의 효과는 감수 분열 재조합 단백질에 대한 항체를 사용하여 설명 될 수있다. 그림 1에서 감수 핵은 DAPI와 DNA에 대한 염색이 진핵 가닥 교환 단백질 RAD51 및 Dmc1 및 카운터에 대한 면역 염색 더블 있습니다. 최적 확산 핵의 두 가지 예는도 1a에 도시되어있다.도 1b는 두 underspread 핵에 퍼지 핵도 1C 예의 예를 도시한다. 노트RAD51 및 Dmc1의 적은 초점이 제대로 핵 확산에 비해 이상과 u...

싹트는 효모에서 염색체를 표면으로 퍼뜨리는 방법이 제시됩니다. 이 방법은 이전에 Loidl과 Klein이 설명한 방법에서 파생되었습니다. 또한, 퍼진 염색체의 면역 염색 절차를 시연합니다.

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

본 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경을 통해 염색체 결합 단백질을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 효소 처리를 통해 세포벽을 제거함으로써 달성됩니다. I'm olis.두 번째 단계는 일반적으로 계면활성제를 사용하여 삼투압 충격으로 세포를 용해하여 핵막 상태로 만드는 것입니다. 이는 단백질 구조를 보존하기 위해 저농도의 고정액이 있는 상태에서 수행됩니다. 세포 용해 후에는 단백질 구조를 더욱 안정화하기 위해 고정액의 농도를 높입니다.그 후 용해된 세포를 현미경 슬라이드 위에 올리고 핵이 슬라이드 표면에 가라앉도록 둡니다. 마지막 단계는 시료를 면역 염색하는 것입니다. 여기서 시연하는 간접 면역 염색법은 표적 단백질에 결합하는 1차 항체와 1차 항체에 결합하는 형광 표지 2차 항체를 사용합니다.최종적으로, 염색체 결합 단백질의 분포를 조사하기 위해 면역형광 현미경법이 사용됩니다. 이 대표 이미지들은 재조합 단백질인 DMC1 및 RAD51에 대해 면역 염색된 분산된 유사분열 핵의 모습입니다. Mike Dresser와 Craig Deru가 소개한 다른 일반적인 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 슬라이드의 표면 대부분에 최적으로 분산된 핵들이 포함되어 있어, 하나의 슬라이드에서 다수의 분산된 핵 이미지를 쉽게 얻을 수 있다는 점입니다.이 방법은 두 단백질이 동일한 위치에 존재하는지, 또는 특정 핵 하부 구조의 형성이 특정 관심 유전자의 기능에 의존하는지와 같은 핵 하부 구조 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 방법은 원래 Franz Klein과 Yosef Lole에 의해 개발되었음을 밝힙니다. 이 영상이 다른 연구자들이 저희가 개선한 기술을 익히는 데 도움이 되기를 바랍니다.원하는 조건에서 배양한 효모 세포를 사용하여 스플랫(splat)을 준비합니다. 각 시료당 약 2 × 10⁸개의 세포를 사용하십시오. 세포 현탁액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.임상용 원심분리기를 5단계로 설정하여 3분간 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 펠렛의 세포가 손실되지 않도록 주의하며 배지를 제거합니다. ZK buffer 1 mL에 세포를 부드럽게 재부유시킨 후, 1 M dihi 40 µL를 첨가합니다.실온에서 가볍게 섞으며 2분 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 세포를 펠렛화한 후 재현탁합니다. 각 펠렛을 1 mL의 ZK 버퍼에 현탁합니다.충분히 혼합하여 갓 준비한 zy liase 100 T 용액 5 µL를 첨가합니다. 30 °C에서 20~30분 동안 배양하여 세포벽을 제거하고 Sphero plats를 생성합니다. 현미경으로 세포 현탁액 10 µL를 분석하여 sphero plating이 완료되었는지 확인합니다.세포벽 제거 전의 효모 세포는 약간 길쭉한 모양이지만, 구형화(spheroplast)된 세포는 팽창하여 둥근 모양으로 보여야 합니다. 물을 첨가한 후, 구형화된 세포는 부드럽게 재부유되어야 하며, 2.5 mL의 차가운 MES 오비탈 완충액으로 세포 펠릿을 세척합니다. 원심 분리 후, 세포 펠릿을 300 내지 400 µL의 차가운 MES 오비탈 완충액에 다시 부드럽게 재부유합니다. 이 단계에서 세포를 수 시간 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다.이 절차에는 흄 후드 내에 설치된 10 x 장작동거리 대물렌즈가 장착된 효모 tetra 해부 현미경이 필요하며, 미세해부 바늘은 제거해야 합니다. 염색체를 펼칠 유리 표면 또한 미리 준비해야 합니다. P 20 피펫을 사용하여 깨끗한 슬라이드 표면에 세포 현탁액 20 µL를 분주합니다. P 200 피펫을 사용하여 갓 조제한 3% paraformaldehyde 3.4% sucrose 용액 40 µL를 추가하고, 슐라인 라인(schlein lines)이 사라질 때까지 손으로 슬라이드를 부드럽게 돌려 용액을 혼합합니다. 슬라이드를 현미경 아래에 놓고 세포의 초점이 맞는지 확인합니다.P 200 피펫을 사용하여 1% Lip Sal 80 µL를 첨가하고, 이전과 같이 용액이 최대한 완전히 섞이도록 부드럽게 회전시킨 후 타이머를 시작합니다. Lip Sal을 사용할 수 없는 경우, 동일한 부피의 1% MP 40 또는 증류수를 사용할 수 있습니다. 대신 세포를 주의 깊게 관찰하며 15초마다 슬라이드를 부드럽게 회전시킵니다.이 비디오 클립은 세포의 약 80에서 90%가 용해되었을 때 관찰되는 모습을 보여줍니다. 타이머를 멈추고 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거하십시오. 용해는 30초에서 90초 사이에 일어나야 합니다.타이머를 시작한 후, 파라포름알데히드 수크로스 용액 80 µL를 첨가하고 가볍게 돌려 섞습니다. 슬라이드를 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다. 깨끗한 일회용 파스퇴르 피펫의 측면을 액체 웅덩이의 메니스커스 아래, 슬라이드 표면보다는 위에 위치시킨 상태로 사용하여 액체를 슬라이드의 프로스티드 처리되지 않은 표면 전체에 펼칩니다.피펫으로 슬라이드 표면을 긁지 마십시오. 시료의 오염을 방지하기 위해 각 슬라이드마다 새로운 피펫을 사용하십시오. 슬라이드를 흄후드 내에서 하룻밤 동안 건조시키면 염색체를 포함한 불용성 핵 성분들이 슬라이드 표면에 가라앉아 슬라이드가 마르면서 결합하게 됩니다.동일한 날에 면역 염색 단계로 진행해야 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 슬라이드를 0.2% Photo flow에 30초 동안 담급니다. 건조된 sucrose 용액을 제거하기 위해, 슬라이드 가장자리를 종이 타월 위에 기대어 남은 photo flow를 제거합니다.슬라이드를 세척하기 위해 XTBS에 5분 동안 담급니다. 슬라이드를 가장자리에 세워 과잉 액체를 제거하되, 완전히 마르지 않게 합니다. 다음으로, 슬라이드의 불투명한 면이 위로 향하게 놓은 뒤, 불투명하지 않은 부분에 T-B-S-B-S-A 300 µL를 각각 피펫으로 분주합니다.슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 상온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 각 슬라이드의 짧은 모서리를 종이 타월 위에 걸치고 시험관 랙과 같은 적절한 지지대에 슬라이드를 기대어 액체를 제거합니다. 표면이 즉시 마르지 않도록 주의하십시오.토끼 혈청(crude rabbit serum)에 맞게 적절히 희석된 1차 항체를 포함하는 T-B-S-B-S-A 버퍼 80 µL를 도포합니다. 희석 배율은 일반적으로 1:50에서 1:500 사이입니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 22 x 50 mm 크기의 연마된 커버슬립을 슬라이드 위에 덮습니다.커버 슬립의 긴 가장자리 중 한쪽 짧은 가장자리 근처의 위치를 엄지와 검지로 잡고 수행하십시오. 커버 슬립을 슬라이드에 대해 30도 각도로 유지하면서, 손가락에서 가장 먼 짧은 가장자리를 슬라이드 위의 액적 가장자리 중 서리 낀 영역(frosted region)에 가장 가까운 지점에 닿을 때까지 내리십시오.커버슬립을 부드럽게 천천히 내려 손가락이 슬라이드에 닿을 때까지 내린 후 놓습니다. 커버슬립이 안착된 후에는 위치를 조정하려고 하지 마십시오. 슬라이드를 밀폐된 습윤 챔버에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 슬라이드의 불투명한 가장자리를 잡고 TBS가 담긴 염색병에 각각 담급니다.침전된 슬라이드를 부드럽게 위아래로 움직여 커버슬립을 제거하십시오. 이때 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 TBS에 10분씩 두 번 담가 세척하십시오.첫 번째 세척 후 버퍼를 교체하십시오. 랙에서 슬라이드를 꺼내 가장자리를 페이퍼 타월에 닿게 하여 과잉 액체를 제거하십시오. 표면이 즉시 마르지 않도록 주의하십시오.각 슬라이드에 형광색소 결합 2차 항체를 1:1000로 희석한 T-B-S-B-S-A 80 µL를 추가합니다. 이전과 동일하게 커버슬립을 덮고, 습윤 챔버 내 4 °C 암실에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 커버슬립을 제거하고 이전과 동일하게 세척한 다음 슬라이드의 액체를 제거합니다.종이 타월 위에 올려둡니다. 약 30 µL의 dbi가 포함된 마운팅 매질을 사용하여, 어두운 곳에서 약한 조명 아래 1~2시간 동안 표면을 자연 건조시킵니다. 그 후 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다.커버슬립이 안착될 수 있도록 약한 빛 아래에서 2분 동안 기다린 후, 투명 매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 슬라이드를 평평한 슬라이드 보관함에 넣습니다. 슬라이드는 관찰 전까지 4°C의 암소에 보관할 수 있습니다.냉동하지 마십시오. 이 단계에서 보여주는 슬라이드는 두 개의 진핵생물 가닥 교환 단백질인 RAD 51과 DMC1에 대해 이중 면역염색을 하고 DPI로 DNA를 대조염색하여 최적으로 도말된 이배체 세포의 감수분열 핵의 두 가지 예시입니다. 최적으로 도말된 감수분열 핵의 직경은 약 5 µm입니다. 과소 도말된 핵에서는 RAD 51과 DMC1의 포커스가 적게 관찰되며, 샘플이 충분히 평평하지 않기 때문에 모든 구조를 단일 초점 평면에서 볼 수 없습니다. 과도하게 도말된 핵에서도 마찬가지입니다.고정 시간이 부족하거나 세제가 과도하여 RAD 51 및 DMC1의 foci가 적게 남아 있습니다. 더 이상 시판되지 않는 lip sal 대신 MP 40으로 대체하여 처리 실험을 수행했으며, 시나프토네말 복합체(synaptonemal complex) 중앙 영역의 구성 요소인 RAD 51 및 zip 1의 분산된 분열기 핵 염색 결과에서 알 수 있듯이 만족스러운 결과를 얻었습니다. lip sal을 증류수로 대체했을 때도 만족스러운 결과가 나타났습니다.두 경우 모두, 세포가 leptin NEA에서 PAA로 전환될 때 발생하는 염색체 응축이 대부분 유지되었습니다. 이 도말 방법은 초고해상도 현미경 기법과 같은 방식에 사용하기에 적합합니다. 이 Synap Neal Complex 이미지에서, Paki INE 핵은 zip one과 red one에 대해 유지되었습니다.자극 방출 고갈(stimulated emission depletion) 현미경으로 관찰한 Synap Neal Complex의 구성 요소입니다. 여기서 녹색으로 표시된 zip one 항체는 평행한 선형 염색 패턴에서 알 수 있듯이 외측 요소(lateral elements) 근처에 결합합니다. 외측 요소 사이의 거리는 약 100 nanometers이며, 이는 일반적인 현미경으로는 분해능이 부족하여 구분할 수 없습니다.숙달되면 샘플 수에 따라 2~4시간 내에 도말 및 도포 기법을 완료할 수 있으며, 연습을 통해 이 방법으로 최대 100장의 슬라이드를 준비할 수 있습니다. 각 샘플당 하나 이상의 중복 슬라이드를 준비하는 것이 권장됩니다. 중복 슬라이드는 하룻밤 동안의 건조 단계 후 -20 °C에서 보관하여 향후에 사용할 수 있습니다.슬라이드는 보관 시 보통 수년간 유지됩니다. 다음과 같은 방법으로 보관하십시오.

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