에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델 결핵균 감염

이 절차의 전반적인 목표는 M 결핵 감염 연구를 위한 체외 폐 조직 모델을 구성하는 것입니다. 이는 먼저 섬유아세포 콜라겐 매트릭스를 세포 배양 플레이트 삽입물의 필터에 적층함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 감염된 면역 및 폐 상피 세포를 섬유아세포 콜라겐 층에 위치시킵니다.

그 결과 생성된 3D 조직 모델은 점액 분비와 상피의 성층화를 촉진하기 위해 공기에 노출됩니다. 마지막 단계에서는 조직을 수확하고 장착합니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사는 M 결핵 유발 조기 육아종의 형성을 분석하는 데 사용됩니다.

이 기술 또는 세포의 체외 단층과 같은 기존 방법의 주요 장점은 이 시스템의 세포가 3D 미세환경에 존재하여 인간 결핵과 유사한 악성 미생물 감염 시 육아종을 형성할 수 있다는 것입니다.콜라겐 내장 섬유아세포를 준비하기 위해 세포가 분리되면 섭씨 37도에서 10분 동안 트리핀으로 폐 섬유아세포 세포를 처리하고, 8ml의 완전한 DMEM으로 반응을 중단한 다음 세포를 스핀다운합니다. 펠릿을 230, 신선한 dmm에서 밀리리터당 000 세포로 재현탁시키고 세포를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 웰당 하나의 인서트를 6개에 추가합니다.

웰 플레이트를 만들고 새로 준비한 세포층 혼합물 1ml를 각 인서트에 분배하여 혼합물이 기포 없이 전체 인서트를 덮도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 2ml의 콜라겐과 615마이크로리터의 프리믹스를 얼음 위의 멸균 원뿔형 튜브에 혼합하여 삽입물당 콜라겐의 pH를 중화합니다.

그런 다음 삽입물당 58마이크로리터의 완전한 dmem과 327마이크로리터의 폐 섬유아세포를 콜라겐 혼합물에 추가합니다. 혼합물 전체에 세포를 고르게 분포시키기 위해 위아래로 피펫팅. 이제 각 삽입물의 측면에 있는 세포층의 3밀리리터를 각 무세포 콜라겐층에 빠르게 추가합니다.

기포를 피하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 2시간 더 넣도록 주의하십시오. 콜라겐이 중합된 후 각 웰의 바닥에 2밀리리터의 완전한 dmem을 추가하고 플레이트를 다시 24시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날, 한 쌍의 깨끗한 집게를 사용하여 한 번에 하나씩 삽입물을 조심스럽게 들어 올리고 각 바닥에서 배양 배지를 흡인합니다.

그런 다음 각 웰의 바닥에 2밀리리터의 완전한 DMM을 추가하고 각 인서트에 2밀리리터의 완전한 DMM을 추가합니다. 5-7일 동안 2일에 한 번씩 두 가지 배지 용량을 모두 변경합니다. 감염된 대식세포를 준비하려면 먼저 감염 빈도가 10인 악성 M 결핵이 있는 대식세포 배양을 4시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 PBS로 세포를 세 번 세척하여 세포외 박테리아를 제거하고 섭씨 37도에서 10분 동안 2밀리몰(A DTA)로 대식세포를 처리합니다. 세포가 소생을 분리하면 항생제가 없는 완전한 DMM에 현탁시킵니다. 그런 다음 섬유아세포 콜라겐 매트릭스 플레이트에서 모든 배지를 흡인하고 외부 챔버에 1.5ml의 새로운 항생제가 없는 완전 DMM을 추가합니다.

다음으로, 삽입물당 50마이크로리터의 항생제가 없는 완전한 DM EM에서 5:1의 비율로 형광 표지된 단핵구와 감염된 대식세포를 혼합합니다. 그런 다음 각 삽입물 내부에 50마이크로리터의 단핵구 대식세포 혼합물을 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 1시간 후 2ml의 배양액을 천천히 추가하고 세포가 빠지지 않도록 삽입물 벽을 아래로 중간에 넣고 24시간 동안 배양물을 더 배양합니다.

폐 상피 세포로 배양액을 시딩하려면 면역 세포 섬유아세포 콜라겐 매트릭스 위에 50마이크로리터의 완전 DMM에 밀리리터당 400만 개의 상피 세포를 추가합니다. 실온에서 2분 동안 세포를 배양한 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 2ml의 무항생제, 완전한 DMM을 삽입물에 부드럽게 첨가하고 3일 동안 더 세포를 배양합니다.

감염된 대식세포는 파종한 지 5일 후에 플레이트에서 모든 배양 배지를 흡인하고 1.8ml의 무항생제 완전 DMM을 외부 챔버에 추가합니다. 그런 다음 7일째에 인서트에 배지를 추가하지 않고 이틀 동안 인큐베이터의 3D 조직 모델을 공기로 노출시켰습니다. 파종 후.

플레이트에서 매체를 완전히 제거하고 조직 모델을 4% 파라알데히드와 혼합하여 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 사용합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 우물 삽입물에서 멤브레인을 분리합니다. 다음으로, 깨끗한 메스를 사용하여 조직 모델의 측면을 조심스럽게 제거하고 각 조직을 대략 같은 크기의 정사각형 조각 4개로 자릅니다.

조각을 슈퍼 프로스트 유리 슬라이드에 옮기고 5분 동안 말리십시오. 그런 다음 안티 페이드 및 dpi가 포함된 매체인 형광 마운팅을 사용하여 티슈를 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다. 슬라이드가 마를 때까지 실온의 어두운 곳에 두었다가 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하십시오.

래커가 건조되면 슬라이드를 70% 에탄올에 담가 BSL 3 시설 밖으로 옮깁니다. 조직을 시각화하기 위해 세포 클러스터의 3D 정량화를 위해 형광 컨포칼 현미경에서 스택 사이를 1-1.5미크론 간격으로 분리하여 최소 20미크론 두께를 덮는 Zack을 사용하여 전체 조직 조각을 포함하는 5-10개의 서로 다른 필드의 3D 이미지를 획득합니다. 3D 이미지 처리 소프트웨어를 열고 관심 있는 이미지를 로드합니다.

그런 다음 디스플레이 조정 도구를 사용하여 이미지, 대비, 밝기 및 블렌드 불투명도에 대한 각 채널을 조정하여 볼륨 렌더링을 최적화하고 노이즈 간섭을 최소화합니다. 그런 다음 조직 표면을 시각화하기 위해 적색 단핵구 채널을 선택하고 필터를 사용하여 적절한 임계값을 설정하여 적색 단핵구의 선택을 제한하거나 필요에 따라 배경을 제외합니다. 마지막으로, 추가 다운스트림 분석을 위해 데이터를 적절한 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다.

7일째, M 포스트 결핵 감염 세포 파딩 컨포칼 현미경 검사는 육아종 3D로 알려진 인간 결핵의 병변을 모방한 녹색 박테리아의 존재로 알 수 있듯이 감염 부위에 적색 단핵구의 군집을 보여줍니다. 시각화는 여러 기능을 상호 작용, 검사 및 정량화할 수 있는 유연성을 제공합니다. 예를 들어, 이러한 이미지에서 em, 결핵 부위에 있는 단핵구 클러스터를 묘사하는 3D 이미지.

녹색 박테리아와 적색 단핵구 클러스터의 공간적 배열은 정점, 회전 및 측면 보기에서 관찰할 수 있습니다. 예상대로, 이러한 클러스터는 감염되지 않은 조직에서 관찰되지 않았습니다. 단핵구, 세포 클러스터 및 M 결핵 감염 조직의 크기와 수를 정량화한 결과, 감염되지 않은 조직 모델에 비해 개별 단핵구의 수는 감소한 반면 세포 클러스터의 크기는 향상되는 것으로 나타났습니다.

이 폐 조직 모델의 잠재적 사용자로는 결핵에서 다양한 면역 세포와 조직 면역의 역할에 대한 연구, 마이코박테리아 표현형 연구 및 육아종 내에서 마이코박테리아를 죽이는 약물 후보 물질 테스트가 포함됩니다.