Name: 셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 초상자성 산화철 나노입자(SPION) 합성 및 PLGA 코팅을 통한 세포 라벨링 방법을 형광 현미경으로 확인하는 정밀 자기 타겟팅 기술입니다.

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저자는 유럽지역개발기금(European Regional Development Fund)인 FNUSA-ICRC의 자금 지원을 인정하고자 합니다. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), 미국심장협회 과학자 개발 보조금(AHA #06-35185N) 및 미국 국립보건원(NIH #T32HL007111).

자철광 젤 1. 합성 <ol><li> 에틸 알코올 다음에 탈 이온수 다음에 진한 염산을 사용하여 모든 유리 제품을 씻으십시오. 바람직하게는 건조 오븐에서, O / N을 건조하도록 허용합니다. 주의! 염산 유해 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용; 에틸 알코올은 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 탈 가스 탈 H 2 O의 500 mL로 부드럽게 30 분 동안 N 2 가스 버블 링에 의해 Dreschel 병을 사용합니다. </li><li> 셋업 화학 물질 흄 후드 내에서 자철광 합성 장치. <ol><li> isomantle 히터 내에 500㎖의 3 구 둥근 바닥 플라스크를 놓고 클램프를 사용하여 중심 목을 고정 및 스탠드. </li><li> 환저 플라스크의 목의 측면에 하나의 고무 격막 나머지 측 경부에 고무 격막과 환류 냉각기를 설치한다. 지속적으로 환류 냉각기를 통해 차가운​​ 물을 실행합니다. </li><li> 펑크 일E 환저 플라스크의 고무 N 2 가스 라인에 연결된 바늘을 격막과 기포에 실행 가스 라인에 연결된 바늘을 환류 응축기의 고무 격막을 천공 (즉, 물을 플라스크) 가스 유출을 시각화. </li><li> 패들 어댑터를 통해 둥근 바닥 플라스크의 중심 목에 블레이드 패를 설치합니다. 스탠드에 장착 된 오버 헤드 교반기에 블레이드 패의 샤프트를 연결합니다. </li></ol></li><li> N 2 가스로 둥근 바닥 플라스크를 제거하고 낮은하지만 검출 속도로 흐르는 N 2 가스를 둡니다. </li><li> 둥근 바닥 플라스크에서 환류 응축기를 제거하고, 철 (III) 클로라이드, 철 0.6125 g (II) 클로라이드 수화물 1.000 g을 추가하고, 탈기 H 2 O 50 ㎖ 주의! 철 (III) 클로라이드 및 철 (II) 클로라이드 테트라는 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 50 가열하면서 환류 냉각기를 교체하고 1,000 rpm에서 교반° C. 이러한 조건에서 교반은 10 나노 미터 직경의 마그네타이트 나노 입자를 생성합니다. </li><li> 일단 50 ℃에서 계속 교반 둥근 바닥 플라스크에 고무 격막을 통해 주입하여, 28 % 수산화 암모늄 용액 10 ㎖를 추가한다. 주의! 수산화 암모늄은 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오. 주 : 수산화 암모늄 용액 마그네타이트를 침전 사용되고 용액 검게한다. </li><li> 계속 교반하면서 암모니아 가스를 끓여 90 ℃로 둥근 바닥 플라스크 및 열에서 고무 격막 및 N 2 가스 라인을 제거합니다. 주 : 환류 응축기의 고무 격막을 천공하여 둥근 바닥 플라스크에 N (2)의 흐름을 유지하는 것이 선택적이다, 그러나, 마그 헤 마이트에 마그네타이트의 산화가이 단계에서 무시할 수있다. </li><li> 계속 교반하면서 한 번에 90 ℃에서, 둥근 바닥 플라스크에 올레산 1 ㎖를 추가한다. 올레산 노나 코팅 마그네타이트를 사용noparticles는 마그네타이트 겔을 형성한다. 주의! 올레산은 유해 - 개인 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 둥근 바닥 플라스크에 고무 격막 및 N 2 가스 라인을 교체하고 환류 냉각기를 제거합니다. </li><li> 2 시간 동안 500 rpm에서 열 및 교반을 끕니다. </li><li> isomantle 히터에서 둥근 바닥 플라스크를 꺼내고 마그네타이트 겔을 보유하는 형틀의 저부에 대해 유지 강력 자석을 사용하는 동안 남아있는 액체를 가만히 따르다. 주의! 손상이나 부상을 방지하기 위해 극도의주의 강한 자석을 처리합니다. </li><li> (선택 사항) / N은 ​​공기 건조 O에 자철광 젤을 허용합니다. </li></ol> 자철광 젤 2. 정제 <ol><li> 마그네타이트 겔을 용해시키기 위해 둥근 바닥 플라스크에 헥산 40 mL로 추가 주의! 헥산 유해한 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용하십시오. </li><li> 잔류 H 2 O를 제거하는 이리저리 탈기 H 2 O 40 mL를 분별 깔때기를 사용하여마그네타이트 용액 미터. <ol><li> 천천히 분리 깔때기 내의 H 상 자철광 솔루션 2 O을 부어 부드럽게 5 분 동안 2 상 액체 소용돌이 친다. </li><li> 밖으로 배출 및 하부 수성 부분을 폐기합니다. </li><li> 천천히 마그네타이트 용액 아래가 침전되도록 분별 깔때기로 탈기 H 2 O 40를 가하여 천천히 소용돌이 이전 드레인. </li><li> 세 번째 씻어 반복합니다. </li></ol></li><li> , 삼각 플라스크에 마그네타이트 용액을 전송 무수 황산나트륨 상당 몇 주걱을 추가 소용돌이 마그네타이트 용액에 남아있는 잔류 H 2 O를 제거 하였다. </li><li> 황산나트륨 및 잔류 H 2 O를 제거하는 필터 깔때기 1 ㎛ 여과지 마그네타이트 용액 필터 참고 : 진공 지원이 좋습니다. </li><li> 50 ㎖ 플라스크에 증발 마그네타이트 용액을 옮기고 용 헥산을 증발시켜, 회전 증발기를 사용하여다음의 조건으로 2 시간 : 중간 회전 속도, 진공을 50 ℃의 수욕을 증발 플라스크에, 도포하고, 24 ° C의 물을 순환하는 콘덴서. 참고 : 선택적으로, PLGA으로 코팅하기 전에 자철광 젤을 저장합니다. </li></ol> PLGA 셸 자철광 나노 입자의 코팅 (3) <ol><li> 1.5 % (m / v)의 용액을 만들고, 에틸 아세테이트 240 ㎖ 중의 3.60 g의 PLGA (75/25 블렌드)를 녹인다. 주의 : 에틸 아세테이트는 유해한 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용하십시오. </li><li> 5.0 % (m / v)의 용액을 만들기 위해 자석 교반기를 사용하여 탈기 H 2 O 500ml에 플루로 닉 F-127 25.00 g을 용해. 주 : 플루로 닉 F-127은 생체 적합성 계면 활성제로 작용 비이 온성 양친 성 블록 공중 합체이다. 이 단계 3.3.2 중유 에멀젼을 안정화하는데 도움. </li><li> microspatula를 사용하여 가중 유리 병 안에 여섯 0.040 g 씩에 자철광 젤를 수집합니다. 반환 한각 나누어지는에 대한 다음과 같은 코팅 및 세척 과정을 ORM. 참고 : 분취 액을 4 단계에서 분해 이전하는 동결 건조를 최소화하면서 순도와 수율을 극대화 효율적 처리 및 자기 경사를 보장하기 위해 필요하다. <ol><li> 10 분 동안 초음파 세척기에서 0.040 g의 마그네타이트 겔의 분취 량과 플라스틱 비이커 및 초음파 처리에 PLGA 용액 40 ml를 추가하기. </li><li> 플라스틱 비이커에 플루로 닉 용액 80 ml에 첨가하고 약 7 분은 수 중유 에멀젼으로서 마그네타이트 PLGA 나노 입자에 코팅을 형성하기 위해 즉시 높은 설정으로 실험실 혼합기 유화. </li><li> 즉시 에틸 아세테이트를 증발시켜 화학 퓸 후드에서 1 시간 동안 탈 H 2 O 및 초음파 처리의 1 L에 SPION 용액을 희석. </li><li> SPION 솔루션 옆에 강력한 자석을 놓고 부드럽게 자석에 갈색 SPIONs를 수집 저어. 참고 :이 간헐적으로 몇 시간 동안 교반 할 필요가있다솔루션 전에 s는 SPIONs의 대부분은 수집 된 것을 나타내는 하얗게 변합니다. </li><li> 자석 비이커 SPIONs을 유지하면서 수용액 따르다. </li><li> 다음과 같이 SPIONs 세 번 씻으십시오. <ol><li> 탈 H 2 O 1 L에 SPIONs 일시 중단 </li><li> 20 분의 SPION 솔루션을 sonicate하세요. </li><li> SPION 솔루션 옆에 강력한 자석을 놓고 부드럽게 자석에 갈색 SPIONs를 수집 저어. 이 용액 SPIONs 대부분 수집 된 것을 나타내는 명확한 꺼질 때까지 몇 시간 동안 간헐적으로 교반 할 필요가있다. </li><li> 자석 비이커 SPIONs을 유지하면서 수용액 따르다. </li></ol></li></ol></li><li> 수성 현탁액과 같은 단일 가중 된 유리 바이알에 여섯 마그네타이트 겔 분취 각각으로부터 합성 SPIONs 수집. 필요에 따라 선택적으로 자기 여분의 물을 가만히 따르다. </li></ol> 4. 동결SPIONs의 -drying <ol><li> SPION 솔루션을 동결. </li><li> 동결 건조 동결 건조기에서 SPION 솔루션 O / N을. </li><li> 동결 건조 SPIONs 무게. 셀 라벨에 사용 전까지 동결 건조 SPIONs은 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 참고 : -20 ° C 극적에 저장이 분해 반응 속도를 줄이고 수명을 증가시킨다. </li></ol> SPIONs와 세포의 5 라벨링 <ol><li> 40 mg / ml의 농도로 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 SPIONs의 분취 량을 중단하고 30 분 동안 초음파 처리. </li><li> 세포 배양 배지의 5 μL / ㎖의 농도에서 세포의 거의 합류 플라스크 SPION 용액을 추가한다. 조심스럽게 플라스크를 흔들어 균일 한 분포를 확인합니다. </li><li> 37 ° C에서 16 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 부드럽게 문화 매체를 대기음하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 자기 표지 세포를 수집하고 실험을 위해 사용합니다. </li><li> 미사용 SPION 용액을 4 ℃에서 저장 될 수 있고, 우리되어야몇 개월 이내에 에드. 각 사용하기 전에 30 분 동안 초음파 처리. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

모든 나노 입자 합성 프로토콜로서, 화학 반응물의 순도는 최소한의 세포 독성 효과를 가질 것이다 고품질 SPIONs 달성을위한 중요하다. 이것은 올레산 (≥99 %), 철 (II) 클로라이드 수화물 (≥99.99 %), 철 (III) 클로라이드 (≥99.99 %), 에틸 아세테이트를 포함하여 매우 순수한 시약을 구입하는 것이 중요하다 (HPLC 등급, ≥99.9 % ), 헥산 (HPLC 등급, ≥97.0 %), 수산화 암모늄 (≥99.99 %) 및 ​​황산나트륨 (≥99.0 %). 그것은 상대적으로 비용이 많이들 수 있습니다 매우 순수하고 높은 품질의 PLGA를 구입 특히 중요하다. 또한, 모든 유리 제품은 완전히 염산, 탈 이온수, 및 에틸 알콜로 세척하고, 사용하기 전에 건조되도록해야한다. 마찬가지로, 프로토콜 내의 정화 및 세척 단계는 최종 SPIONs 높은 품질의 최소한의 세포 독성 영향을 미칠 것입니다 보장하기 위해 매우 중요합니다. 자철광 젤이 없어야합니다PLGA와...

신체 내 특정 부위로의 세포 표적 전달 및 포획은 다양한 생체 의학 응용 분야에 바람직합니다. MRI 유도 집속 초음파를 통해 신경 줄기세포를 뇌로 전달하는 것은 신경퇴행성 질환, 외상성 뇌 손상 및 뇌졸중에 대한 가능한 치료 옵션으로 제안되었습니다1. 중간엽 줄기세포는 자연적인 종양-트로픽 특성으로 인해 종양에 항암제를 전달하는 능력에 대해 연구되고 있습니다2,3. 심장 줄기세포는 심근경색의 가능한 치료법으로 심장에 전달되었습니다4,5. 혈관 스텐트는 순환하는 전구 세포를 포획하기 위해 CD34 항체와 함께 개발되었습니다6. 이러한 세포 표적화 접근법은 유망하지만 세포 특이성 부족, 일관되지 않은 세포 보유 및 비표적 세포 전달과 같은 단점이 있습니다.
현재 방법의 전반적인 목표는 다양한 세포 전달 및 분류 응용 분야에서 세포의 자기 유도 표적화를 가능하게 하는 것입니다. 자기 표적화는 최소한의 off-target effect로 특정 세포를 특정 표적 부위에 제어된 전달을 가능하게 합니다7. 자기장은 신체 내에서 자기적으로 표지된 세포의 움직임을 안전하게 지시하기 위해 이식된 장치 또는 외부 장치에 의해 생성될 수 있습니다8. 수많은 연구 노력은 재생 결과를 개선하기 위해 심장9-14, 망막15, 폐16, 피부17, 척수18, 19, 뼈20, 간21 및 근육22, 23과 같은 손상된 조직에 줄기 세포를 자기적으로 표적으로 삼는 데 중점을 두었습니다.
세포의 Magnetic targeting of cells는 이식형 심혈관 장치를 내피화하는 수단으로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 균일하고 완전한 내피는 혈전증과 염증을 완화하기 위해 장치와 순환 혈액 요소 사이에 장벽을 제공합니다. 내피 세포는 이식 전 또는 이식 후 혈관 시스템을 통해 장치로 전달될 수 있습니다. 두 경우 모두 자기장을 사용하여 세포를 장치 표면으로 포획하고 혈액 순환에 의해 생성된 전단 응력을 받을 때 세포를 유지합니다. 자기 혈관 스텐트(24-27) 및 혈관 이식편(28)은 모두 이러한 목적을 위해 제작 및 테스트되었습니다.
자기 세포 타겟팅에는 자기 운반체 입자로 세포를 라벨링하는 전략이 필요합니다. 이러한 입자는 항체 또는 리간드/수용체 쌍을 통해 세포 표면에 결합되거나 세포 내포작용(endocytosation)될 수 있습니다. 초상자성 산화철 나노입자(SPION)는 생분해성이고, 생체 적합성이 있으며, 다양한 세포 유형에 의해 쉽게 세포내이입됩니다29. 이러한 입자는 자기장에 반응하는 세포를 효과적으로 렌더링하고 시간이 지남에 따라 자연적으로 분해됩니다. SPION은 다양한 자기 표적화 및 분류 응용 분야를 위해 배양 중인 세포를 자기 라벨링하는 간단하고 안전한 수단을 제공합니다. SPION을 마그네타이트(Fe3,O4) 코어 및 폴리(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 쉘과 합성하는 방법이 제공됩니다. 또한 SPION으로 배양된 세포를 표지하는 방법이 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>수산화 암모늄 용액, H<>sub>2O, &ge에서 28% NH<sub3; 99.99% 트레이스 메탈 기반</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818-100ML&nbsp;</td><td>해로운 시약 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.</td></tr><tr><td>Dreschel 병, 500 ml</td><td>에이스 글라스</td><td>5516-16</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이트, CHROMASOLVR Plus, HPLC용, 99.9%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650528-1L</td><td>유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업</td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용</td></tr><tr><td>증발 플라스크, 50ml, 24/40 조인트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z515558</td><td>윤전 증발기와 함께 사용</td></tr><tr><td>여과지, 직경 3cm, 등급</td><td>1 Fisher</td><td>09-805P</td><td>유리 필터 퍼넬</td></tr><tr><td>유리 비커, 1 L</td><td>Fisher</td><td>FB-101-1000</td><td>SPIONs 세척용</td></tr><tr><td>유리 필터 퍼널, 진공 호스 어댑터, 24/40, 30 mL</td><td>Fisher</td><td>K954100-0344에</td> 맞음;<td></td></tr><tr><td>유리 바이알 캡</td><td>Fisher</td><td>03-391-46</td><td>유리 바이알과 함께 사용</td></tr><tr><td>유리 바이알, 2ml</td><td>Fisher</td><td>03-391-44</td><td>자철광 젤 및 자철광 수집용 SPIONs</td></tr><tr><td>헥산, CHROMASOLVR, HPLC 용, &ge; 97.0% (GC)</td><td>시그마-알드리치</td><td>34859-1L&nbsp;</td><td>유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업</td></tr><tr><td>철(II) 염화물 사수화물, &ge; 99.99% 미량 금속 기준&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024-5G</td><td>유해 시약 - 개인 보호 장비</td></tr><tr><td>착용 염화철(III) 무수, 분말, &ge; 99.99% 미량 금속 기초</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451649-1G</td><td>유해 시약 - 개인 보호 장비 착용</td></tr><tr><td>이소맨틀 히터, 500mL</td><td>Voight Global</td><td>EM0500/CEX1</td><td></td></tr><tr><td>실험실 믹서</td><td>Silverson</td><td>L5M-A</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Microspatulas</td><td>Fisher</td><td>21-401-25A</td><td>자철광 이송용 젤</td></tr><tr><td>NdFeB 자석, 1 in x 1 in x 1 in</td><td>놀라운 자석</td><td>C1000H-M</td><td>매우 강한 자석, 조심스럽게 다루십시오</td></tr><tr><td>올레산, &ge; 99% (GC)</td><td>시그마-알드리치</td><td>O1008-5G&nbsp;</td><td>냉장고에 보관하십시오. 유해한 시약 - 개인 보호 장비를 착용하십시오</td></tr><tr><td>오버헤드 교반기</td><td>IKA</td><td>2572201</td><td></td></tr><tr><td>오버헤드 교반기 클램프</td><td>IKA</td><td>2664000</td><td>오버헤드 교반기와 함께 사용</td></tr><tr><td>오버헤드 교반기 H-stand</td><td>IKA</td><td>1412000</td><td>오버헤드 교반기와 함께 사용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 비커, 250ml</td><td>Fisher</td><td>02-591-28</td><td></td></tr><tr><td>PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend)</td><td>Purac</td><td>PDLG 7502</td><td>PDLG 7502A도 사용될 수 있습니다. 냉동고에 보관</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 분말, BioReagent, 세포 배양에 적합</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 확장 가능한 블레이드 패들, 8mm 직경</td><td>SciQuip</td><td>SP4018</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 용기 어댑터, 24/40, 8mm 직경 패들에 적합</td><td>Monmouth Scientific</td><td>PTFE 용기 어댑터 A480</td><td>PTFE 확장 블레이드 패들과 함께 사용</td></tr><tr><td>재순환 냉각기</td><td>Clarkson</td><td>696613</td><td>회전 증발기</td></tr><tr><td>역류 응축기와 함께 사용, 24/40, 250mm</td><td>Ace Glass</td><td>5997-133</td><td>에 적합</td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Clarkson</td><td>216949</td><td></td></tr><tr><td>고무 세프타, 24/40</td><td>Ace Glass</td><td>9096-56</td><td></td></tr><tr><td>분리 깔때기와 스토퍼, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>10-438E</td><td></td></tr><tr><td>황산나트륨 ACS 시약, &ge; 99.0%, 무수, 과립</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3 목 둥근 바닥 플라스크, 각진, 24/40 조인트, 500ml</td><td>Ace Glass</td><td>6948-16</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기 천공 팬</td><td>Fisher</td><td>15-335-20A</td><td>초음파 세척기와 함께 사용</td></tr><tr><td>초음파 세척기, 2.8L</td><td>Fisher</td><td>15-335-20</td><td></td></tr><tr><td>진공 컨트롤러</td><td>Clarkson</td><td>216639</td><td>rotoevaporator와 함께 사용 (옵션)</td></tr> <tr><td>진공 펌프</td><td>Clarkson</td><td>219959</td><td>회전증발기와 함께 사용</td></tr></tbody></table>

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

세포 치료제의 표적 전달이 오프 - 표적 부위에 악영향을 최소화하면서 목표 부위에 치료 효과를 집중하여 의치 광범위한 애플리케이션 혜택 것이다. 자기 세포 타겟팅, 효율적인 안전하고 간단 전달 기술이다. 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPION)은 생체 적합성, 생분해 성이며, 자기장에 응답들을 렌더링하기 위해 세포로 endocytosed 수있다. 합성 과정은 마그네타이트 FE (3 O 4)를 생성하는 것을 포함하는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 코팅을 형성하는 고속 유화 나노 입자. PLGA-마그네타이트 SPIONs는 약 10 nm의 직경을 포함 마그네타이트 코어 직경이 약 12​​0 나노 미터이다. 문화 매체에 배치 할 때, SPIONs 자연스럽게 세포에 의해 endocytosed 및 세포질 엔도 좀 내 작은 클러스터로 저장됩니다. 이들 입자는 세포에 충분한 질량을 부여 자성자기장 내에서 대상을 허용합니다. 수많은 세포 정렬 및 대상 응용 프로그램은 자기장에 반응하는 다양한 세포 유형을 렌더링하여 사용할 수 있습니다. SPIONs뿐만 아니라 종양 치료 또는 조직 솔더링 로컬 고열증의 의료 영상 조영제로 사용, 표적 유전자 또는 약물 전달, 진단 분석 및 생성을 포함하는 다른 생물 의학 다양한 애플리케이션을 갖는다.

마그네타이트 나노 입자는 50 ℃, 1000 rpm으로 (도 1) 및 철 (III) 클로라이드, 철 (II) 클로라이드 수화물 수용액을 교반 한 결과, 직경이 약 10 나노 미터이다. 이러한 결과는 마그네타이트 나노 입자가 성공적으로 합성을 보여준다. 이것은 처음으로 합성을 시도 할 때의 배치 작은 샘플로부터 취한 마그네타이트 나노 입자의 크기와 모양을 확인하는 것이 중요하다. 투과 전자 현미경 (TEM)이 입자를 시각화하는 바람직한 방법이다. 배치는 폐기되어야하고, 마그네타이트 나노 입자는 직경이 약 10 nm의하지 인 경우도 1에 나타낸 바와 같이 구면 합성을 다시 시도한다. 120 나노 미터 (도 2) 직경의 PLGA-마그네타이트 SPIONs에서 고속 유화제 결과를 사용하여 PLGA와 마그네타이트 나노 입자를 코팅. 이러한 결과는 성공적인 보여PLGA - 자철광 SPIONs의 합성...

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다. 이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

본 절차의 전반적인 목적은 초상자성 산화철 나노입자를 합성하고, 해당 입자를 사용하여 자기 표적화 및 분류 응용 분야를 위한 세포 표지를 수행하는 것입니다. 이는 먼저 직경 10 nm의 자성 나노입자를 합성함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 자성 나노입자를 50 nm 두께의 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 쉘로 코팅하는 것입니다.다음으로, 자성 나노입자를 세척하고 동결 건조합니다. 마지막 단계는 세포 표적화 및 분리 응용을 위해 자성 나노입자로 세포를 라벨링하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 자기장 내에서 자성 나노입자로 라벨링된 세포의 표적화를 확인합니다.항체 매개 세포 표적화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 자기 세포 표적화가 매우 특이적이며 제어가 가능하다는 점입니다. 치료 세포를 표적 부위에 전달하는 동시에 표적 외 부위는 보존할 수 있기 때문에, 이 기술의 활용 가능성은 다양한 질환의 치료까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 순도 높고 고품질인 나노입자를 얻기 위해 세부 사항에 세심한 주의를 기울여야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.우리는 체내 생세포의 타겟팅과 국소화를 개선하고자 했습니다. 먼저 드레셀 병(dressel bottle)을 사용하여 질소 가스를 30분 동안 천천히 버블링함으로써 탈이온수 500 milliliters를 탈기하십시오. 반응 장치를 설정하려면 500 milliliter 3구 라운드 바닥 플라스크를 ISO 맨틀 히터 안에 배치하십시오.다음으로, 한쪽 측면 목을 고무 격막(rubber septum)으로 덮고 다른 쪽에 환류 냉각기를 설치합니다. 반응을 위한 불활성 분위기를 조성하기 위해 냉각기에 냉수를 지속적으로 흐르게 합니다. 먼저, 질소 가스 라인과 연결된 바늘로 플라스크의 고무 격막을 뚫습니다.그 다음, 가스 유출을 확인하기 위해 버블러가 연결된 바늘로 응축기 격막을 뚫습니다. 이어서 패들 어댑터를 사용하여 중심 목 부분에 블레이드 페달을 설치합니다. 반응 혼합물을 지속적으로 교반하기 위해 블레이드 샤프트를 스탠드에 장착된 오버헤드 교반기에 연결합니다.플라스크를 질소 가스로 퍼지하고, 질소가 낮지만 감지 가능한 속도로 플라스크에 계속 흐르도록 둡니다. 그런 다음 환류 냉각기를 제거하고 iron(III) chloride 1g, iron(II) chloride tetra 612.5mg, 그리고 탈기수 50mL를 첨가합니다. 냉각기를 다시 장착하고 50°C로 가열하면서 1000 RPM으로 반응물을 교반합니다.이렇게 하면 직경 10 nanometer의 자성 산화철 입자가 생성됩니다. 반응 온도가 50 °C에 도달하면, 주사기를 사용하여 플라스크 셉텀을 통해 28% ammonium hydroxide 10 milliliters를 주입하십시오. 자성 산화철이 침전되면서 용액의 색이 검은색으로 변해야 합니다.고무 격막과 가스 라인을 제거하고 반응물을 90 °C까지 가열합니다. 그 후, 나노입자를 코팅하고 자성체 겔을 형성하기 위해 올레산 1 mL를 플라스크에 첨가합니다. 다음으로, 플라스크의 격막과 가스 라인을 다시 장착하고 냉각기를 제거합니다.가열을 중단하고 500 RPM으로 2시간 동안 반응물을 교반합니다. 교반 후, 강력한 자석으로 나노입자를 플라스크 바닥에 고정시킨 상태에서 과잉 액체를 따라냅니다. 정제를 시작하려면 먼저 자성 젤을 40 milliliters의 hexanes에 용해시킵니다.이 용액을 Degas water 40 milliliters가 들어 있는 분별 깔때기에 천천히 붓고, 깔때기를 5분 동안 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 혼합 후 하층의 수성 분획을 따라내어 제거하고, 동일한 방식으로 Degas water를 사용하여 마그네타이트 용액을 두 번 더 세척합니다. 그 다음, 마그네타이트 용액을 삼각 플라스크로 옮깁니다.황산나트륨을 스패튤라로 여러 번 떠서 넣고 혼합물을 소용돌이치듯 섞어 용액을 건조합니다. 그 다음 진공 여과합니다. 혼합물을 1µm 필터지로 여과합니다.회전 증발기의 항온 수조 온도를 50 °C로 설정하고, 응축기에는 24 °C의 물이 순환하도록 합니다. 그다음 여과액을 50 mL 증발 플라스크로 옮기고, 진공 상태에서 적절한 회전 속도로 2시간 동안 헥산(hexanes)을 증발시킵니다. 유리 바이알에 마그네타이트 겔을 40 mg씩 6개의 분주량으로 나누어 수집하며, 각 분주량에 대해 코팅 및 세척 과정을 개별적으로 수행합니다. 플라스틱 비커에 겔 분주량 1개와 에틸 아세테이트에 녹인 40 mL의 PLGA를 함께 넣고, 혼합물을 10분 동안 초음파 처리합니다.다음으로, 비커에 onic F1 27 80 milliliters를 넣고, 즉시 믹서를 고속 설정으로 7분 동안 작동시켜 유화시킵니다. 이 나노입자들이 바로 초상자성 산화철 나노입자(super paramagnetic iron oxide nanoparticles, SPION)입니다. 용액을 탈이온수 1 liter로 희석하고 흄 후드 내에서 1시간 동안 초음파 처리합니다. 그 후 용액 옆에 강한 자석을 배치하고 용액을 부드럽게 저어 자석에 SPION을 수집합니다.S 접수(scion)를 비커에 남겨둔 채 수용액을 따라냅니다. S 접수를 물로 세 번 세척합니다. 총 6개의 분주액에 대해 코팅과 세척 과정을 모두 완료합니다.S 접수들을 단일 유리 바이알에 수집합니다. 세포 표지를 위해 동결건조기에서 spy on 용액을 하룻밤 동안 동결 건조합니다. 먼저 pyon을 40 mg/mL 농도의 PBS에 현탁하고 30분 동안 초음파 처리합니다.다음으로, 거의 컨플루언스(confluence) 상태에 도달한 세포가 담긴 플라스크에 세포 배양액 1 mL당 5 µL의 농도로 용액을 첨가합니다. 플라스크를 흔들어 용액이 고르게 분산되도록 합니다. 세포를 16시간 동안 배양합니다.37°C에서 진행합니다. 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 세포를 두 번 세척합니다. PBS로 세척하면 자성 표지된 세포를 실험에 사용할 수 있습니다.염화철(III)과 염화철(II) 사수화물의 수용액을 50 °C, 1000 RPM에서 교반하여 직경 10 nm의 자철광 나노입자를 일관되게 제조할 수 있습니다. 입자 크기를 결정하는 데에는 투과 전자 현미경(TEM)이 권장되는 방법입니다. 고속 유화기를 사용하여 자철광 나노입자를 PLGA로 코팅하면 직경 120 nm의 PLGA-자철광 복합체가 재현성 있게 생성됩니다. 이러한 입자들을 시각화하기 위해 주사 전자 현미경(SEM)이 사용됩니다. 혈관 내피 성장 세포를 16시간 동안 배양한 후 TEM으로 관찰하면 나노입자의 엔도사이토시스가 일어났음을 확인할 수 있습니다. PLGA-자철광 나노입자는 세포 내에서 시각화되거나 세포질의 엔도좀 내에 저장되어 있습니다.세포 내로 철을 로딩하는 양이 충분하여, 생존 세포를 강자성 이식형 의료 기기로 자기 포집할 수 있습니다. 자기적으로 표지된 혈관 내피 세포는 비자기성 스텐트보다 강자성 스텐트에 더 높은 비율로 끌립니다. 이 절차를 수행할 때, 나노입자의 순도와 안전성을 최대화하기 위해 모든 유리 기구와 장비를 철저히 세척하는 것이 중요합니다.어떤 의료 치료법이 세포의 특이적 및 조절된 전달을 통해 이득을 얻을 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 자기 세포 타겟팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 자기 타겟팅 기술은 다양한 생의학적 응용 분야를 위한 집중 세포 전달의 개발을 가능하게 할 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 초상자성 산화철 나노입자를 합성하는 방법과 이러한 입자를 사용하여 자기 타겟팅 응용을 위해 세포를 표지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

cell-labeling-targeting-with-superparamagnetic-iron-oxide

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.

Ferumoxytol, FDA 승인 철 산화물 Nanoparticle과 함께 줄기 세포를 라벨링

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

코발트 도핑된 마그네토페리틴의 합성 및 양이온화를 위한 프로토콜과 양이온화된 마그네토페리틴으로 줄기세포를 빠르게 자화하는 방법을 제시합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

결핵 균균에 대한 혈청학적 진단 테스트를 개선하기 위해 초파라마그네틱 산화철 나노프로브를 개발하여 폐결핵을 검출했습니다.

초초파라마그네틱 산화질소 나노프로브의 합성, 특성화 및 적용

여기에 제시된 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달 및 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 추적을 위한 프로토콜이 제시된다. 초파라마그네틱 산화물 나노입자는 실시간 MRI를 이용한 비강 내 전달 후 생체 내 추적 및 비침습적 MSC 라벨링을 위한 자기 공명 영상(MRI) 프로브로 사용된다.

외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.

자성 나노 물질의 생체 기능화

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

학습하세요 초상자성 산화철 나노입자(SPION) 합성 및 PLGA 코팅을 통한 세포 라벨링 방법을 형광 현미경으로 확인하는 정밀 자기 타겟팅 기술입니다.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

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