방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 NTBC가 P멘 생산 및 산화 스트레스에 대한 민감도에 미치는 영향과 항생제 최소 억제 농도 또는 마이크를 결정하는 것입니다. 이는 박테리아 배양액에 NTBC를 첨가하여 두 번째 단계로 p 멜라닌 생성을 감소시키는 농도를 측정함으로써 달성됩니다. 박테리아 배양은 NTBC와 항생제로 처리되며, 이를 통해 사용자는 NTBC 처리가 항생제 M 마이크에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.

다음으로 NTPC 처리된 배양액은 산화 스트레스에 대한 민감도를 확인하기 위해 과산화수소에 노출되며, NTPC로 유전성 박테리아를 처리하면 색소 생성이 감소하고 산화 스트레스에 대한 민감도가 증가하면서 산화 스트레스 반응 스폿 플레이트와 마이크로타이터 MIC 분석을 각각 기반으로 항생제 마이크에 영향을 미치지 않는다는 결과가 얻어졌습니다. 생존 계수 및 디스크 확산 분석과 같은 기존 방법에 비해 산화 응력 스폿 플레이트 기술의 주요 장점은 다른 분석에서 사용되는 고농도의 과산화수소보다 낮은 농도의 과산화수소를 사용할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 항생제 마이크를 측정하는 당사의 방법을 처음 접하는 개인은 피펫팅 기술의 정밀도 부족으로 인해 복제 간에 변동성이 발생하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이러한 변동성으로 인해 항생제를 정확하게 결정하기 어려울 수 있습니다. MIC: MIC 분석 하루 전. LB와 함께 또는 LB를 사용하지 않고 테스트할 균주의 배양을 준비합니다.

2, 2, 니트로, 4, 트리오르, 에틸 벤조일, 1, 3, 시클로헥산, 디온 또는 NTBC. 이 데모는 NTBC의 대표 수준인 300마이크로몰을 사용합니다. NTBC의 적절한 농도를 결정하기 위한 적정 방법은 프로토콜 텍스트에 설명되어 있습니다: 섭씨 37도에서 밤새 배양물을 배양하고 다음 날 폭기합니다.

MIC 분석을 위한 LB plus NTBC 및 LB plus DMSO 마스터 솔루션을 만들어 NTBC 600마이크로몰에서 LB 2밀리리터로 한 균주에 대한 항생제 1개를 테스트하고 혼합합니다. NTBC 마스터 솔루션을 만들기 위해. NTBC는 접종물을 첨가할 때 2배로 희석되기 때문에 600마이크로몰의 농도로 첨가됩니다.

최종 농도가 300마이크로몰이 나오면 등가 부피의 차량 DMSO를 LB 2밀리리터에 추가하고 혼합하여 NO NTBC 마스터 용액을 만듭니다. 이 두 가지 마스터 솔루션은 항생제 스톡 용액을 만들고 96웰 플레이트에 희석 시리즈를 설정하는 데 사용됩니다. 다음으로, LB plus NTBC 또는 LB plus DMSO Master 용액에서 항생제 용액을 준비합니다.

Gentamycin plus or minus NTBC stock solution을 밀리리터당 64마이크로그램으로 준비합니다. KANAMYCIN 플러스 또는 마이너스 NTBC 재고 용액을 밀리리터 당 256 마이크로 그램으로 만드십시오. 토브라마이신 플러스 또는 마이너스 NTB 원액을 밀리리터당 8마이크로그램으로 준비합니다.

2개의 x 항생제 해결책이 각 항생제 해결책의 100 마이크로리터에 96 우물 A.E에 있는 4개의 우물에 한 후에 경우에, gentamycin는 1에서 4에 두어야 한다 kanamycin는 5에서 8에 두어야 하고, tobramycin는 9에서 12에 두어야 한다. 96 웰 플레이트의 로즈 B부터 H까지 LB 플러스 NTBC 또는 LB 플러스 DMSO 마스터 솔루션 50 마이크로리터를 추가하고, 한 플레이트가 LB 플러스 NTBC이고 한 플레이트가 LB 플러스 DMSO인지 확인합니다. 마이크로 피펫터를 사용하여 50마이크로리터의 용액을 A행에서 B행으로 옮겨 항생제의 2배 연속 희석을 수행합니다. 용액을 혼합하고 피펫 팁을 교체하고 B행에서 C행으로 용액 50마이크로리터를 옮깁니다. G행을 희석한 후 나머지 행에 대해 반복합니다. 해당 행에서 용액 50마이크로리터를 제거하고 폐기합니다.

H열을 박테리아 성장에 대한 무항생제 방제로 사용하십시오. 라닌을 제거하기 위해 모든 배양을 세척한 후 하룻밤 배양을 검색합니다.미디어에 존재하는 배양물의 OD 600을 측정하면 하룻밤 배양을 lb 단위로 희석합니다. 다중 채널 마이크로 피펫터 사용.

희석된 박테리아 배양액 50마이크로리터를 적절한 웰에 추가합니다. 각 균주 및 항생제 농도에 대해 3개의 웰에 박테리아를 추가합니다. 네 번째 웰에 50마이크로리터의 LB를 추가하여 박테리아 오염에 대한 제어 역할을 합니다.

96개의 웰 플레이트를 퍼필로 덮고 다음 날 섭씨 37도에서 약 24시간 동안 배양합니다. 우물에서 박테리아가 성장하는지 플레이트를 육안으로 검사합니다. MIC는 각 균주의 3가지 복제물 모두에 대해 박테리아 성장이 보이지 않는 가장 낮은 농도의 항생제입니다.

이 절차를 시작하려면 다음 날 이전에 표시된 것처럼 NTBC가 있거나 없는 LB에서 테스트할 균주의 야간 배양을 설정합니다. 산화 스트레스 인자로 과산화수소를 포함하는 LB APL을 준비합니다. 먼저 LB 농업 플라스크를 녹이고 매체를 실온에서 약 섭씨 50도로 냉각합니다.

다음으로, 원하는 농도로 냉각된 매체에 과산화수소를 직접 첨가합니다. 플라스크를 소용돌이쳐 0에서 1까지의 과산화수소 농도 범위를 혼합합니다. 밀리몰은 좋은 출발점입니다.

즉시 플레이트를 붓고 표면에 화염을 발라 기포를 제거합니다. 수율은 lb 한천 100ml당 4개의 플레이트입니다. 플레이트에 과산화수소 농도를 표시하십시오.

플레이트에서 과도한 수분을 제거하기 위해 팬을 30분 동안 작동시킨 상태에서 생물학적 흐름 후드에 덮이지 않은 플레이트를 놓습니다. 플레이트는 같은 날에 사용해야 합니다. 그들은 접시가 건조되고 세척되고 측정하는 동안 준비됩니다.

야간 배양의 OD 600은 모든 야간 배양의 OD 600을 테스트 중인 균주 세트에 대한 가장 낮은 값으로 정규화합니다. 이를 위해 배양물을 총 1밀리리터의 부피에서 가장 낮은 OD 600으로 희석하는 데 필요한 배양량을 결정합니다. 예를 들어, 배양액의 OD 600이 3이고 균주 세트에 대한 가장 낮은 OD 600이 2.5인 경우 다음 계산을 수행하면 마이크로 퍼지 튜브에 0.833ml의 배양이 필요하므로 0.833ml

다음으로, 배양 부피를 1밀리리터로 만드는 데 필요한 LB와 NTBC 또는 LB와 DMSO의 양을 계산합니다. 이 예에서, 양은 0.167 밀리리터 혼합을 통해 배양물을 일정한 농도로 유지하기 위해 NTBC 또는 DMSO의 일정한 농도로 배양물을 유지하고, PBS와 NTBC 또는 PBS와 DMSO에서 정규화된 야간 배양물의 10배 연속 희석을 수행하고, PBS와 NTBC 및 PBS와 DMSO를 더한 DMSO의 스톡 용액을 하나의 균주 혼합물에 대해 한 세트의 희석액에 대해 얼마나 많은 균주가 테스트되는지에 따라 확장 또는 축소를 수행하고, NTBC 300마이크로몰 또는 이에 상응하는 부피의 DMSO입니다. PBS 청록색의 경우, 총 720 마이크로 리터의 부피는 90 마이크로 리터의 PBS 플러스 NTBC 또는 PBS 플러스 DMSO를 10에서 마이너스 1에서 10에서 마이너스 7 연속 희석으로 표시된 적절한 마이크로 fuge 튜브에 추가합니다.

볼텍싱으로 혼합된 마이너스 1 희석 튜브에 적절한 10 마이크로리터의 배양액을 첨가하고 10 마이너스 1 희석액 중 10 마이크로리터를 마이너스 1 희석 튜브에 10 마이너스 2 희석 튜브로 옮깁니다. 희석 사이에 피펫 팁을 교체하고 모든 희석이 수행될 때까지 반복합니다. LV의 10에서 마이너스 3에서 10, 마이너스 7 희석의 5 마이크로 리터와 과산화수소 플레이트를 복제하여 발견하십시오.

각 변형에 대해 하나의 피펫 팁을 사용하십시오. 가장 희석된 것부터 가장 덜 희석된 것까지 얼룩이 도금된 경우 액체가 플레이트로 건조될 때까지 플레이트를 기울이거나 기울이지 마십시오. 변형률에 따라 섭씨 37도에서 24-48시간 동안 플레이트를 배양합니다.

적당한 크기의 군체가 나타나면 트랜스루미네이터 위의 CCD 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다. NTBC 적정을 사용하여 NTBC가 p 에어로겐에서 p 멜라닌 생성을 감소시킬 수 있는지 확인하고 여기에 표시된 바와 같이 추가 분석에 사용하기 위해 p 멜라닌 생성을 제거하거나 감소시키는 NTBC의 농도를 확인했습니다. NTBC는 p 멜라닌 생산자에서 용량 의존적 방식으로 PY 멜라닌 생성을 감소시켰지만, p 멜라닌을 생산하지 않는 균주에서는 색소 생성에 영향을 미치지 않았다.

이 표는 NTBC를 사용하거나 사용하지 않고 처리된 다양한 p 에어로겐 균주에 대한 MIC 분석 결과를 보여주며, 다양한 항생제 마이크는 박테리아 성장을 억제하는 가장 낮은 농도의 항생제로 기록되었습니다. NDBC 처리는 테스트된 균주에 대한 항생제 마이크에 영향을 미치지 않았습니다. 산화 스트레스 반응에 대한 스폿 플레이트 분석은 NDBC를 사용하거나 사용하지 않고 처리된 PIO 멜라닌 및 비멜라닌 생성 균주에 대해 수행되었습니다.

0 밀리몰 과산화수소 플레이트는 PIO 멜라닌 생성 박테리아를 NTBC로 처리했을 때 모든 균주가 적절하게 희석되고 산화 스트레스에 대한 민감도 증가가 관찰되었음을 보여주었습니다. PIO 멜라닌을 생성하지 않는 균주는 p 멜라닌을 생성하는 균주보다 산화 스트레스에 더 민감합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 산화 스트레스 및 항생제 마이크에 대한 민감도를 테스트하여 NTBC 치료가 PIO 멜라닌 생성에 미치는 영향을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.