방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

다음 실험들의 전반적인 목적은 NTBC가 P melanin 생성 및 산화적 스트레스 민감도에 미치는 영향과 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 배양액에 NTBC를 첨가하여 p melanin 생성을 감소시키는 농도를 결정함으로써 달성됩니다. 이후 박테리아 배양액을 NTBC와 항생제로 처리하여, NTBC 처리가 항생제 MIC에 영향을 미치는지 확인합니다.

NTPC 처리된 배양액을 과산화수소에 노출시켜 NTPC 처리에 따른 산화적 스트레스 민감도를 결정한 결과, NTPC로 유전적 박테리아를 처리하면 색소 생성이 감소하고 산화적 스트레스에 대한 민감도가 증가하지만, 항생제 MIC에는 영향을 미치지 않는다는 점이 각각 산화적 스트레스 반응 스팟 플레이트와 마이크로타이터 MIC 분석을 통해 확인되었습니다. 생균수 측정 및 디스크 확산 분석과 같은 기존 방법과 비교하여 산화적 스트레스 스팟 플레이트 기법의 주요 장점은 다른 분석에서 사용하는 고농도의 과산화수소 대신 더 낮은 농도의 과산화수소를 사용할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 항생제 MIC를 결정하는 본 연구 방법이 처음인 사용자는 피펫팅 기술의 정밀도 부족으로 인해 반복 실험 간 변동성이 발생하여 어려움을 겪을 수 있습니다.

이러한 가변성으로 인해 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 정확하게 결정하는 것이 어려울 수 있습니다. MIC 분석 하루 전에, LB 배지를 사용하여 테스트할 균주의 배양액을 첨가물 유무에 따라 준비하십시오.

2,4,6-트리니트로페닐 1,3-사이클로헥산디온(2,4,6-trinitro-1,3-cyclohexanedione) 또는 NTBC입니다. 본 시연에서는 NTBC의 대표 농도인 300 µM을 사용합니다. 적절한 NTBC 농도를 결정하기 위한 적정 방법은 프로토콜 본문에 설명되어 있습니다. 배양액을 37 °C에서 통기하며 밤새 배양한 후 다음 날 진행하십시오.

MIC 분석을 위해 LB 및 NTBC 마스터 용액과 LB 및 DMSO 마스터 용액을 조제합니다. 한 가지 균주에 대해 한 종류의 항생제를 테스트하기 위해, 2 mL의 LB에 600 µM 농도의 NTBC를 넣어 혼합합니다. NTBC 마스터 용액을 제조할 때 NTBC 농도를 600 µM로 설정하는 이유는 접종물을 추가할 때 2배로 희석되기 때문입니다.

최종 농도가 300 µM이 되도록 2 mL의 LB에 동일한 부피의 용매 DMSO를 첨가하고 혼합하여 NO NTBC 마스터 용액을 만듭니다. 이 두 가지 마스터 용액은 항생제 스톡 용액을 제조하고 96-웰 플레이트에 희석 시리즈를 설정하는 데 사용됩니다. 다음으로, LB plus NTBC 또는 LB plus DMSO 마스터 용액에서 항생제 용액을 준비합니다.

Gentamycin ± NTBC의 스톡 용액을 64 µg/mL 농도로 준비합니다. KANAMYCIN ± NTBC의 스톡 용액을 256 µg/mL 농도로 제조합니다. Tobramycin ± NTB의 스톡 용액을 8 µg/mL 농도로 준비합니다.

두 배 농도의 항생제 용액을 제조한 후, 96웰 플레이트의 A열에 있는 4개 웰씩 각각 100 µL의 항생제 용액을 분주합니다. 예를 들어, gentamycin은 1번부터 4번 웰에, kanamycin은 5번부터 8번 웰에, tobramycin은 9번부터 12번 웰에 분주해야 합니다. 96웰 플레이트의 B열부터 H열까지 50 µL의 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액을 추가하며, 이때 하나의 플레이트는 LB + NTBC를, 다른 하나는 LB + DMSO를 사용하도록 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 A열의 용액 50 µL를 B열로 옮겨 항생제의 2배 연속 희석을 수행합니다. 용액을 섞은 후 피펫 팁을 교체하고, B열의 용액 50 µL를 C열로 옮깁니다. G열을 희석한 후 남은 행들에 대해 이 과정을 반복합니다. 해당 행에서 용액 50 µL를 제거하여 폐기합니다.

H행을 박테리아 성장을 위한 항생제 무첨가 대조군으로 사용하십시오. 배지에 포함된 lanin을 제거하기 위해 모든 배양물을 세척한 후, 하룻밤 동안 배양한 배양물을 회수하십시오. 배양물의 OD 600을 측정하고, 멀티채널 마이크로 파이펫을 사용하여 lb에서 하룻밤 배양한 배양물을 희석하십시오.

희석된 박테리아 배양액 50 µL를 적절한 웰에 추가합니다. 각 균주와 항생제 농도당 3개의 웰에 박테리아를 추가합니다. 박테리아 오염 대조군으로 사용하기 위해 네 번째 웰에 LB 50 µL를 추가합니다.

96웰 플레이트를 파라필름으로 덮고 다음 날까지 37°C에서 약 24시간 동안 배양합니다. 플레이트를 육안으로 관찰하여 웰 내의 세균 성장 여부를 확인합니다. MIC는 각 균주의 세 번의 반복 실험 모두에서 세균 성장이 관찰되지 않은 항생제의 최저 농도입니다.

본 절차를 시작하기 위해, 다음 날 안내된 바와 같이 NTBC 포함 여부에 따라 테스트할 균주들을 LB 배지에서 밤새 배양합니다. 산화 스트레스 요인으로 과산화수소가 포함된 LB APL을 준비합니다. 먼저 LB agro 플라스크를 녹인 후, 배지를 실온에서 약 50°C까지 식힙니다.

다음으로, 원하는 농도의 과산화수소를 냉각된 배지에 직접 첨가합니다. 플라스크를 흔들어 과산화수소 농도가 0에서 1 mM 범위가 되도록 혼합합니다. 밀리몰(Millimolar) 농도가 적절한 시작점입니다.

즉시 플레이트를 붓고 표면을 화염 멸균하여 기포를 제거하십시오. LB agar 100 milliliters당 4개의 플레이트를 제작할 수 있습니다. 플레이트에 과산화수소 농도를 표시하십시오.

플레이트의 과도한 수분을 제거하기 위해, 팬을 가동 중인 생물학적 안전 작업대(biological flow hood) 안에 플레이트를 덮개 없이 30분 동안 둡니다. 플레이트는 당일에 사용해야 합니다. 플레이트가 건조되는 동안 세척 및 측정을 진행하며 준비합니다.

하룻밤 배양한 배양액의 OD 600을 측정하여, 테스트하려는 균주 집합 중 가장 낮은 OD 600 값에 맞춰 모든 배양액의 OD 600을 정규화합니다. 이를 위해, 총 부피 1 mL에서 배양액을 가장 낮은 OD 600으로 희석하는 데 필요한 배양액의 부피를 결정합니다. 예를 들어, 특정 배양액의 OD 600이 3이고 균주 집합의 최저 OD 600이 2.5라면, 다음과 같이 계산하여 필요한 배양액의 부피인 0.833 mL를 구합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리 튜브에 0.833 mL의 배양액을 넣습니다.

다음으로, 배양액 부피를 1mL로 맞추는 데 필요한 LB+NTBC 또는 LB+DMSO의 양을 계산하십시오. 본 예시에서는 그 양이 0.167mL입니다. NTBC 또는 DMSO의 농도를 일정하게 유지하며 배양하기 위해 볼텍싱으로 혼합하십시오. 정규화된 overnight 배양액을 PBS+NTBC 또는 PBS+DMSO에서 10배 연속 희석하십시오. 테스트하는 균주의 수에 따라 규모를 조정하여 PBS+NTBC 및 PBS+DMSO의 스톡 솔루션을 제조하십시오. 한 균주의 한 세트 희석을 위해 300µM의 NTBC 또는 이에 상응하는 부피의 DMSO를 PBS와 혼합하여 총 부피 720µL로 만듭니다. 10⁻¹부터 10⁻⁷까지의 연속 희석용으로 라벨이 부착된 적절한 마이크로 원심분리 튜브에 PBS+NTBC 또는 PBS+DMSO 90µL를 추가하십시오.

배양액 10 µL를 적절한 10⁻¹ 희석 튜브에 넣고 볼텍싱으로 혼합한 후, 10⁻¹ 희석액 10 µL를 10⁻² 희석 튜브로 옮깁니다. 희석 단계마다 피펫 팁을 교체하며 모든 희석 과정이 완료될 때까지 반복합니다. 10⁻³부터 10⁻⁷까지의 희석액을 각각 5 µL씩 LV 및 과산화수소 플레이트에 중복으로 점적합니다.

각 균주마다 하나의 피펫 팁을 사용하십시오. 가장 희석된 것부터 가장 덜 희석된 순서로 도말하는 경우, 액체가 플레이트에 완전히 마를 때까지 플레이트를 기울이거나 눕히지 마십시오. 균주에 따라 플레이트를 37 °C에서 24~48시간 동안 배양하십시오.

적절한 크기의 콜로니가 생성되면, 트랜스루미네이터(transluminator) 위의 CCD 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다. NTBC 적정을 통해 NTBC가 p aerogen의 p melanin 생성을 감소시킬 수 있는지 확인하고, 본 실험에서 제시하는 추가 분석에 사용할 p melanin 생성을 제거하거나 감소시키는 NTBC 농도를 식별하였습니다. NTBC는 p melanin 생성 균주에서 농도 의존적으로 PY melanin 생성을 감소시켰으나, p melanin을 생성하지 않는 균주의 색소 생성에는 영향을 미치지 않았습니다.

이 표는 NTBC 처리 여부 및 다양한 항생제 처리에 따른 서로 다른 p. aerogen 균주의 MIC 분석 결과를 보여줍니다. MIC는 세균 성장을 억제하는 항생제의 최저 농도로 기록되었습니다. NTBC 처리는 테스트한 균주들의 항생제 MIC에 영향을 미치지 않았습니다. NDBC 처리 여부에 따른 PIO 멜라닌 생성 및 비생성 균주의 산화 스트레스 반응에 대한 스팟 플레이트 분석이 수행되었습니다.

0 mM 과산화수소 플레이트를 통해 모든 균주가 적절히 희석되었음을 확인하였으며, PIO 멜라닌 생성 박테리아를 NTBC로 처리했을 때 산화적 스트레스에 대한 민감도가 증가하는 것이 관찰되었습니다. PIO 멜라닌을 생성하지 않는 균주가 p 멜라닌을 생성하는 균주보다 산화적 스트레스에 더 민감했습니다. 이 영상을 시청한 후에는 산화적 스트레스 민감도 및 항생제 MIC 테스트를 통해 NTBC 처리가 PIO 멜라닌 생성에 미치는 영향을 결정하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.