Name: 방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 NTBC 처리로 세균의 피오멜라닌 생성을 억제하고 산화 스트레스 민감도를 증가시키는 방법을. 이 기법은 항생제 MIC에 영향을 주지 않으면서 세균 감염 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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저자는 다라 프랭크(Dara Frank)와 캐리 하우드(Carrie Harwood)에게 균주에 대한 관대한 기여에 감사를 표합니다. 위스콘신 대학교 밀워키 연구 재단은 특허 번호 8,354,451을 보유하고 있습니다. 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)과 같은 4-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 억제 화합물을 투여하여 환자에서 미생물의 감염 진행을 치료하거나 억제하는 것에 대한 청구가 광범위하게 이루어졌습니다. 발명자는 Graham Moran과 Pang He입니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R00-GM083147)의 지원을 받았습니다. University of Washington P. aeruginosa transposon 돌연변이 라이브러리는 NIH P30 DK089507의 지원을 받습니다.

배양기 항생제 1. 제조, 및 2- [2- 니트로 -4- (트리 플루오로 메틸) 벤조일] -1,3- 시클로 헥산 디온 (NTBC) <ol><li> 적절한 볼륨으로 LB 액체 배지 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 %의 NaCl의 H 2 O)과 분취 액을 만든다. 오토 클레이브 소독. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 100 ㎖ LB 한천 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 % 염화나트륨, H 2 O 1.5 % 한천) 250 mL의 플라스크를 만든다. 실온에서 오토 클레이브 및 저장에 의해 소독. 한천 플레이트에 쏟아져 전에 용융되어 있는지 확인합니다. 주 : 4 판을 수득한다 LB 한천 100 ㎖을 함유하는 플라스크. LB 한천의 양이 분석에 필요한 플레이트의 수에 대응하도록 변경 될 수있다. </li><li> (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 mM의 KH 2 PO 4) (16) PBS를 확인합니다. 실온에서 오토 클레이브 또는 여과 및 저장에 의해 소독. </li><li> 겐타 마이신에 대한 항생제 재고 솔루션을 준비, 카나마이신,D 토 브라 마이신. <ol><li> 피에 대한 적절한 항생제 재고 농도를 준비 100 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신 30 ㎎ / ㎖의 카나마이신 및 10 ㎎ / ㎖의 토 브라 마이신을 함유 루기 노자 균주. 4 ° C에서 물 필터 소독 (0.2 μm의)와 저장소에 항생제를 녹인다. 연구 박테리아에 따라 항생제 농도를 변경합니다. </li></ol></li><li> NTBC 재고 솔루션을 준비합니다. DMSO 400 μL에 NTBC 10 mg을 녹이고. 이것은 75.9 mM의 NTBC의 농도를 산출한다. -20 ° C에서 보관 NTBC 스톡 솔루션을 제공합니다. 실온에서 해동 용액은 필요에 따라. 참고 : NTBC의 다른 소스는 용해도의 차이가 있습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 NTBC을 용해 단계 1.5 따라서를 조정하는 적절한 차량을 결정합니다. </li></ol> 2. 세균 균주의 NTBC 적정의를 <ol><li> 균주의 설정 하룻밤 문화를 테스트합니다. 2 ㎖의 LB 배지에 16 × 150mm 시험관 추가S (주 당 하나) 및 각 변형에서 1 절연 식민지 접종. 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기에 통기로 37 ℃에서 밤새 배양한다. </li><li> 다음 날, LB 배지에 NTBC의 적정을 준비합니다. 다른 균주 NTBC에 대한 민감도에 차이가 있기 때문에 0 ~ 900 μm의 NTBC에 초기 범위를 사용합니다. <ol><li> 변형 당 4 ~ 5 시험관 (16 × 150mm)에 1 ㎖의 LB 배지를 추가합니다. </li><li> 농도 범위에서 시험관 (16 × 150mm)에 NTBC 스톡 용액 (75.9 mm)를 추가한다. LB 액체 배지 1 ㎖에 추가 NTBC 농도 및 해당 재고 수량은 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 하룻밤 문화의 OD 600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin 제거하기 위해 OD 600 판독을 복용하기 전에 문화를 씻으십시오. <ol><li> 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. 뜨는 및 느슨하게 펠렛 세포를 제거micropipettor 및 1 ml의 (LB)에 고체 세포 펠렛을 재현 탁 </li></ol></li><li> OD 600 0.05 적정 튜브를 접종. 튜브에 접종하는 데 필요한 세척하고 배양의 양을 계산한다. 참고 : 존재하지 않아야 pyomelanin 때문에 예방 접종에 대한 세척 문화를 사용합니다. </li><li> 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 약 24 시간 동안 적정 튜브 부화. </li><li> 적정 튜브 사진 및 MIC 및 산화 스트레스 분석에 사용할 NTBC의 양을 결정하기 위해 내부 및 균주간에 색소 생산을 비교한다. 무 세포 배양 상층 액에서 pyomelanin의 양을 결정하고 세포 밀도를 결정하기 위해 600 OD 판독을 사용한다. 주 : 세포 배양 상청액에서 pyomelanin OD 600의 비율로 처리 후 NTBC pyomelanin 생산에서의 차이를 정량화하기 위해 계산 될 수있다. </li></ol> 3. 항생제 최소 Inhibi96 웰 플레이트에 토리 농도 (MIC) 분석 <ol><li> 균주의 설정 하룻밤 문화와 NTBC없이 LB에서 시험한다. 주 :이 프로토콜은 300 μM NTBC의 대표적인 레벨을 사용하여 설명한다. 사용될 NTBC의 적절한 수준은 단계 260에서 결정된다. <ol><li> 2 ml의 (LB) 300 μm의 NTBC 추가 더 NTBC 조건에 대해 2 ml의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 멸균 이쑤시개를 사용하여 박테리아의 하나 고립 된 식민지와 튜브를 접종. NTBC 하나의 문화와 각 변형에 대한 NTBC없이 하나의 문화가 될 것입니다. 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 밤새 배양한다. </li></ol></li><li> 다음 날, MIC 분석을 설정하는 LB + NTBC 및 LB + DMSO 마스터 솔루션을합니다. 접종 물이 추가 될 때,이 600 μM의 농도로 추가하기 NTBC 300 μM의 최종 농도를 산출 두 배 희석한다. <ol><li> 하나 antibi을 테스트하려면하나의 변형, 2 ㎖의 LB 600 μm의 NTBC을 추가하고 NTBC 마스터 솔루션을 만들기 위해 혼합에 대한 귀의. 2 ㎖의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가하고 더 NTBC 마스터 솔루션을하지 않습니다 섞는다. 항생제 원액을 만들뿐만 아니라 96 웰 플레이트에서 희석 시리즈를 설정하는 이러한 솔루션을 사용한다. 참고 : 마스터 용액 제형은 피펫 오류를 설명하는 별도의 솔루션을 얻을 것입니다. 시험 균주의 항생제와 수에 따라서 필요에 따라 마스터 솔루션은 상하 또는 축소 될 수있다. </li></ol></li><li> LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션의 항생제 솔루션을 준비합니다. 참고 :이 솔루션의 항생제 농도가 두 배 최종 원하는 농도이어야한다. 충분한 용액을 96 웰 플레이트에 웰에 네 100 μl를 전송해야한다. <ol><li> 겐타 마이신 + 64 ㎍ / ml의에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 겐타 마이신 (450)의 콘텐츠 0.288 μL (100 ㎎ / ㎖)을 추가하고,이 용액을 만드는μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션입니다. 참고 : P.에 대한 겐타 마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1는 32 μg의 / ㎖이다. </li><li> 카나마이신 + 256 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 확인하십시오. 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션 카나마이신 주식의 3.84 μL (30 ㎎ / ㎖)를 추가,이 솔루션을 확인합니다. 참고 : P.에 대한 카나마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1 128 μg의 / ㎖이다. </li><li> 토 브라 마이신 + 8 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션에 토 브라 마이신 주식의 0.36 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 참고 : P. 들어 aeruginosa의 PAO1, 토 브라 마이신의 최대 농도는 4 μg의 / ㎖이다. 주 : 박테리아 시험되어야하는 항생제 농도가 조절 될 수있다. </li></ol></li><li> 96 웰 플레이트에서 네 개의 우물에 각각 2 배 항생제 용액 100 μl를 추가합니다. exampl에 대한 행 A의 이러한 솔루션을 배치즉, 젠타 A4 통해 A1에 배치해야 카나마이신을 통해 A8 A5에 배치되어야하고, 토 브라 마이신을 통해 A12 A9에 배치되어야한다. 설정 96 웰 플레이트의 그림에 대한 그림 1A를 참조하십시오. 주 : 다중 항생제 한 플레이트에서 시험 할 수 있지만, 단지 하나의 변형은 다른 균주에서 교차 오염의 가능성을 제거하기 위해 접시 당 테스트되어야한다. </li><li> 96 웰 플레이트의 H​​를 통해 행 B에 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액 50 μl를 추가합니다. 그 하나의 판을 확인 LB + NTBC이고 하나 플레이트 LB + DMSO입니다. 그림 1A를 참조하십시오. <ol><li> LB + NTBC에서 항생제에 대한 LB + NTBC을 사용합니다. LB + DMSO의 항생제에 대한 LB + DMSO를 사용합니다. </li></ol></li><li> micropipettor가 피펫 팁을 변경, B를 믹스에게 솔루션을 행하기 위해 행에서 용액 50 μl를 전송하여 항생제의 두 배 연속 희석을 수행하여, 및 행 (B)에서 용액 50 μl를 전송하기위한 C. 반복을 행합니다 remainiNG 행. 행 G 희석 한 후, 그 행과 폐기의 용액 50 μl를 제거합니다. 박테리아 성장을위한 항생제 컨트롤로 행 (H)를 사용합니다. 그림 1B를 참조하십시오. 참고 : G를 통해 각각의 잘 행은 지금 배에서 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 항생제의 50 μL 최종 원하는 농도가 포함되어 있습니다. 행 H없이 항생제로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO가 포함되어 있습니다. </li><li> 하룻밤 문화의 OD 600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin을 제거하기 위해 OD 600 판독을 복용하기 전에 모든 문화를 씻으십시오. <ol><li> 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. micropipettor으로 뜨는을 제거하고 1 ㎖의 (LB)에있는 세포 펠렛을 resuspend </li></ol></li><li> (LB)에서 2.75x10 5 CFU / ㎖로 하룻밤 문화를 희석 참고 : 하나의 OD 600 단위 (P)에 대한 1 × 9 CFU / ㎖의 상응이라고 가정 녹농균. CFU / ㎖ 변환에 OD는 거라고 할 수있다다른 박테리아에 ifferent. </li><li> 적절한 웰에 희석 세균 배양의 50 μl를 추가합니다. 주 : NTBC 성장 DMSO 배양에서 성장 및 배양 NTBC DMSO를 함유하는 웰에 첨가한다 함유 웰에 첨가한다. 그림 1B를 참조하십시오. <ol><li> 각 균주와 항생제 농도 세 우물에 세균을 추가합니다. 세균 오염에 대한 제어 역할을하는 네 번째 우물에 LB의 50 μl를 추가합니다. 그림 1B를 참조하십시오. </li><li> 웰 접종 멀티 채널 micropipettor를 사용한다. 이웃하는 웰의 오염을 방지하기 위해 추가 접종 할 때 팁을 웰의 바닥 근처에 있음을 보장 피펫. 참고 : 우물에 세균 배양을 추가하면 항생제와 NTBC 농도의 두 배를 희석합니다. </li></ol></li><li> 파라 필름으로 96 웰 플레이트를 덮고, 37 ℃에서 약 24 시간 배양한다. 공기 인큐베이터에서 정적으로 96 웰 플레이트를 품어. </li><li> 검사우물에 세균 성장​​을위한 판. MIC는 세균의 성장에는 각 균주의 복제에 대해 세 보지되는 항생제의 최소 농도이다. <ol><li> 시각적으로 성장 판을 검사하거나 (600) 중독에 플레이트 리더 세트를 사용하여 읽기. </li></ol></li></ol> 산화 스트레스 응답 4. 스팟 플레이트 분석 <ol><li> 3.1 단계에 설명 된대로 균주의 설정 하룻밤 문화 NTBC와 LB와없이 테스트 할 수 있습니다. </li><li> 다음날, 산화성 스트레스로 H 2 O 2를 함유하는 LB 아가 플레이트를 준비한다. 0 내지 1 mM의 H의 범위는 2 O 2 농도는 좋은 출발점이다. <ol><li> LB 한천 플라스크 용융. 실온에서 약 50 ° C로 냉각 매체. </li><li> 원하는 농도로 냉각 된 미디어에 직접 O 2 H 2를 추가합니다. 소용돌이 플라스크 혼합합니다. H의 농도는 표 2를 참조하십시오 2 O 2농축 H 2 O 2의 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 이러한 값은 LB 한천 100 ㎖에 기초한다. </li><li> 바로 거품을 제거하기 위해 H 2 O 2 불꽃을 표면을 추가 한 후 번호판을 붓고. 수율은 LB 한천의 100 ㎖ 당 4 판입니다. H 2 O 2 농도가 판을 표시합니다. </li><li> 플레이트에서 과도한 수분을 제거하는 30 분 동안 실행 팬 생물학적 흐름 후드에서 발견 판을 놓습니다. 참고 : 판들이 준비되어 같은 날을 사용합니다. 그렇게하지 ​​않으면 일치하지 않는 데이터가 발생할 수 있습니다. 참고 사항 : 파라쿼트 같은 산화 스트레스는이 분석에서 H 2 O 2를 대체 할 수 있습니다. 다른 산화성 스트레스에 사용 농도는 H 2 O 2에 사용되는 것과 다를 수있다. </li></ol></li><li> 세척 단계 3.7에 설명 된대로 외경에게 하룻밤 문화 (600)을 측정한다. </li><li> 모든 하룻밤 CU의 OD 600 정상화균주의 집합의 가장 낮은 값 ltures 테스트중인. P. 녹농균은 일반적으로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO에 하룻밤 성장 약 2.5의 OD 600이 있습니다. <ol><li> 1 ml의 총 부피에서 낮은 OD 600 문화를 희석하는 데 필요한 배양의 볼륨을 결정한다. 배양 OD (3)의 600 균주의 세트는 낮은 OD (600)가있는 경우, 예를 들면 2.5 인, 다음의 계산을 수행 (2.5) (1 ㎖)을 = (3) (X). X는 = 0.833 ml의. 문화의 0.833 mL의 미세 원심 분리 튜브에 배치됩니다. </li><li> 1 ml의 배양 부피를 가지고 필요 LB + NTBC (300 μM) 또는 DMSO LB +의 양을 계산한다. 단계 4.4.1에서 예를 들어, LB + NTBC 또는 LB + DMSO의 양이 0.167 ㎖ (- 0.833 ml의 문화 1 ml의 총 부피) 될 문화에 추가됩니다. LB + NTBC 및 LB + DMSO의 재고 솔루션은 모든 균주를 희석에 필요한 볼륨 근거로이 희석에 사용합니다. </li><li> 문화와 LB + N 믹스텍싱에 의해 TBC 또는 LB + DMSO. </li></ol></li><li> NTBC 또는 DMSO의 일정한 농도의 문화를 유지하기 위해, PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 정규화 하룻밤 문화의 열 배 연속 희석을 수행합니다. <ol><li> PBS + NTBC과 PBS + DMSO의 재고 솔루션을합니다. 하나의 균주에 대한 희석 한 세트의 경우, 720 ㎕의 총 부피를 수득 300 μM의 NTBC 또는 PBS와 DMSO의 동등한 양을 혼합한다. 테스트 얼마나 많은 균주에 따라 위 또는 아래로이 주식을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 10-7 연속 희석을 통해 10 -1에 대한 라벨의 microfuge 튜브. 적절한 튜브에 PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 90 μl를 추가합니다. LB + NTBC에서 재배 변종에 대한 PBS + NTBC를 사용하여 LB + DMSO에 성장 균주에 대한 PBS + DMSO를 사용합니다. </li><li> 해당 10-1 희석 관에 문화의 10 μl를 추가합니다. 텍싱하여 혼합하고 10 -2 희석 튜브에 10 -1 희석의 10 μl를 전송합니다. 모든 희석이 PERFO 때까지 반복rmed. 희석 사이에 피펫 팁을 변경합니다. </li></ol></li><li> 각 변형에 대한 중복에 LB + H 2 O 2 판에 10-7 희석을 통해 10 -3의 자리는 5 μL. 관광 명소 도금하는 경우 대부분은 적어도 희석 (10-7 -3 10) 희석에서 한 피펫 팁을 사용합니다. 팁 또는 액체가 플레이트에 건조 될 때까지 판을 기울이지 마십시오. </li><li> 변형에 따라 37 ° C (공기 인큐베이터)에서 24 ~ 48 시간 동안 접시를 품어. 참고 : P. 녹농균 PAO1는 배양 24 시간 후 LB에 좋은 크기의 식민지를해야합니다. 그들은 콜로니를 PAO1 대략 동일한 크기를 가질 때까지 균주를 배양한다. </li><li> transluminator 위의 CCD 카메라를 사용하여 번호판을 사진. 선택적으로, 같은 크기 대비 및 작물에 대한 사진을 편집 할 수 있습니다. 산화 스트레스에 대한 민감도에서의 변화를 결정하기 위해 각각의 스폿에서의 콜로니 수를 카운트. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에 설명된 NTBC 적정 방법을 통해 사용자는 NTBC가 박테리아에서 파이오멜라닌 생성을 감소시키거나 제거할 수 있는지 여부를 결정하고 필요한 NTBC의 농도를 결정할 수 있습니다. NTBC 적정 분석에서 가장 중요한 단계는 분석에 사용할 NTBC 농도 범위를 결정하는 것입니다. P. aeruginosa 의 다른 균주는 NTBC에 대한 민감도가 다르며, 실험실 균주는 임상 분리주보다 NTBC에 더 민감할 수 있습니다12 (그림 2). 따라서 분석 중인 각 균주에 대해 다양한 NTBC 농도를 테스트할 필요가 있습니다. 사용자가 특정 균주에서 피오멜라닌 생성을 억제하는 NTBC의 최저 농도를 결정하기를 원할 가능성이 높기 때문에 더 낮은 농도로 시작하여 필요에 따라 더 높은 농도로 늘리는 것이 좋습니다. 당사의 적정 분석은 색소 생성 억제를 결정하는 정성적 방법을 설명합니다. 연구 목적에 따라 농곡진 수치를 결정해야 할 수도 있습니다. 이는 샘플에서 파이오...

>jove_content<녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 박테리아로, 산화 스트레스1-4로부터 보호하는 데 도움이 되는 적갈색 색소인 피오멜라닌(pyomelanin)을 포함한 다양한 색소를 생성하고, 아미노글리코시드 항생제5-7을 포함한 다양한 화합물과 결합합니다. 피오멜라닌 생성은 호모겐티세이트 1,2-디옥시게나제(HmgA)1,9를 암호화하는 유전자의 결실 또는 돌연변이를 통해 또는 경로10의 다양한 효소의 불균형을 통해 티로신 이화작용 경로4,8의 결함으로 인해 발생합니다. Homogentisate는 HmgA의 불활성화로 인해 축적되고 분비 및 산화되어 pyomelanin11을 형성합니다. 피오멜라닌의 생산은 티로신 이화작용 경로에서 4-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(Hpd)를 억제하는 제초제 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)12 처리를 통해 용량 의존적 방식으로 폐지 또는 감소할 수 있습니다13. Hpd는 homogentisate의 형성에 필요하므로 pyomelanin11이 필요합니다. 
녹농균을 생산하는 녹농균의 NTBC 치료에 대한 연구에서 중요한 세 가지 기술을 자세히 설명합니다. 이러한 기술에는 실험실 및 임상 피오멜라닌 생성 균주에서 피오멜라닌 생성을 폐지하거나 감소시키는 농도를 결정하기 위한 NTBC 적정, 박테리아를 NTBC로 처리할 때 항생제의 최소 억제 농도(MIC) 측정, NTBC 처리로 인한 산화 스트레스에 대한 민감성 등이 포함됩니다.
우리가 개발한 적정 분석법은 두 가지 목적을 가지고 있습니다. 첫째, 이 분석을 통해 사용자는 NTBC가 연구 중인 박테리아에서 피오멜라닌 생성을 폐지하거나 감소시킬 수 있는지, 그리고 어떤 농도에서 발생하는지 결정할 수 있습니다. 이를 통해 사용자는 NTBC에 대한 민감도를 결정할 수 있는데, 이는 녹농균 12에서 관찰된 바와 같이 박테리아의 다른 균주가 이 화합물에 대해 다른 민감도를 가질 수 있기 때문입니다. 둘째, NTBC 적정 분석을 통해 사용자는 피오멜라닌 생성을 폐지 또는 감소시키고 색소 감소 효과를 결정하는 것이 목표인 경우 항생제 MIC 및 산화 스트레스 반응 분석과 같은 후속 분석에 사용할 NTBC의 적절한 농도를 결정할 수 있습니다. 
적정 분석법은 NTBC로 처리한 균주에서 피오멜라닌 생산의 가시적인 차이를 볼 수 있고 피오멜라닌 생산의 차이는 용량에 따라 다르기 때문에 효과가 있습니다12. 또한 이 기술은 박테리아의 색소 생성을 제거하거나 향상시킬 수 있는 다른 화합물의 연구에 적용할 수 있습니다.
항생제 MIC는 항생제에 대한 박테리아의 민감도를 결정하는 데 사용됩니다. MIC를 측정하는 방법에는 한천 희석 플레이트(hagar dilution plates)와 육수 희석액(broth dilutions)을 포함한 여러 가지가 있습니다14. 국물 희석은 작은 시험관 또는 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 수행할 수 있습니다. 본 명세서에 기술된 MIC 측정의 마이크로타이터 플레이트 방법은 사용자가 최소한의 자원을 사용하여 광범위한 항생제를 테스트할 수 있도록 합니다. 이 분석은 이 방법으로 테스트한 항생제 및 균주의 수에 대한 유연성과 재현성을 제공합니다. 또한 분석에 NTBC를 통합함으로써 사용자는 피오멜라닌 생산의 제거 또는 감소가 피오멜라닌을 생산하는 박테리아의 항생제 감수성을 변경하는지 여부를 결정할 수 있습니다.
산화 스트레스에 대한 박테리아 반응은 여러 가지 방법으로 테스트할 수 있습니다. 가장 일반적인 방법은 일정 기간 동안 산화 스트레스를 받은 박테리아의 생존 가능한 개수1 또는 산화 스트레스 디스크 확산 분석법(oxidative stress disc diffusion assay)15이다. 이러한 방법은 고농도의 산화 스트레스 요인을 사용하여 박테리아에 대한 산화 스트레스의 영향을 조사하는 경향이 있으며 결과는 생물학적 복제물 간에 매우 다를 수 있습니다. 생존 계수 분석은 또한 다른 방법보다 더 많은 한천 플레이트를 사용하는 경향이 있습니다. 우리가 설명하는 스폿 플레이트 분석은 낮은 농도의 H2O2를 사용하며 사용자는 최소한의 플레이트를 사용하여 여러 균주의 산화 스트레스 반응을 테스트 할 수 있습니다. 이 분석은 또한 기술적 복제물과 생물학적 복제물 간에 일관되게 재현 가능합니다. 피오멜라닌은 산화 스트레스에 대한 저항성에 관여하기 때문에 NTBC를 분석에 통합하면 사용자는 산화 스트레스 저항성에 대한 피오멜라닌 생성 제거의 효과를 결정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML0269-50mg</td><td>은 니티시논이라고도 합니다. DMSO에 용해됩니다.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. H2O.&nbsp; 안정.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>H2O.에 용해됨&nbsp; 필터는 살균합니다.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>H2O.&nbsp; 필터는 살균합니다.</td></tr><tr><td>토브라마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4014-100MG</td><td>H2O.&nbsp; 필터는 살균합니다.</td></tr></tbody></table>

방법은 세균 pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin은 여러 박테리아 및 곰팡이 종에 의해 생성되는 세포 외 적갈색 색소입니다. 이 색소는 티로신 이화 경로에서 파생되며 산화 스트레스 저항성을 높이는 데 기여합니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 표멜라닌 생산은 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)으로 처리하여 용량 의존적 방식으로 감소합니다. 우리는 박테리아의 피오멜라닌 생성을 감소시키거나 폐지할 약물의 농도를 결정하기 위해 여러 농도의 NTBC를 사용하는 적정 방법을 설명합니다. 적정 방법은 쉽게 정량화할 수 있는 결과를 가지고 있으며, 약물 농도가 증가함에 따라 색소 생성이 눈에 띄게 감소합니다. 또한 박테리아의 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 분석하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 최소한의 리소스를 사용하며 하나의 마이크로타이터 플레이트에서 하나의 박테리아 균주에 대해 여러 항생제를 테스트하도록 쉽게 확장할 수 있습니다. MIC 분석은 특정 농도에서 박테리아 성장에 대한 비항생제 화합물의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 마지막으로, H2O2 를 한천 플레이트에 통합하고 플레이트에 여러 박테리아 희석을 발견하여 산화 스트레스에 대한 박테리아 민감도를 테스트하는 방법을 설명합니다. 산화 스트레스에 대한 민감도는H2O2 대조군이 없는 대조군과 비교하여H2O2를 함유하는 플레이트의 다양한 희석액에 대한 콜로니 수와 크기의 감소로 표시됩니다. 산화 응력 스폿 플레이트 분석은 최소한의 자원과 낮은 농도의 H2O2 를 사용합니다. 중요한 것은 재현성도 우수하다는 것입니다. 이 스폿 플레이트 분석은 한천 플레이트에 화합물을 통합하고 그에 따른 박테리아 성장을 특성화하여 다양한 화합물에 대한 박테리아 민감도를 테스트하도록 조정할 수 있습니다.

NTBC 적정 NTBC가 경찰에 pyomelanin 생산을 줄일 수 있다면 NTBC 적정을 결정하는 데 사용되었다 애 루기 노사, 또한 제거 또는 추가 분석에 사용하기 위해 생산을 감소 pyomelanin NTBC의 농도를 확인한다. 이 다른 복제에서 생성 pyomelanin의 수준에서 변화 될 수 있지만 일반적인 경향은 일정하게 유지 될 수 있습니다. NTBC 적정 분석은 다른 세균 안료 생산에 영향을 미칠 수있는 다른 화합물을 시험하기 위해 수정 될 수있다. 시각적으로 결정되거나 정량화 될 수 표현형 변화가있는 경우에만, 그러나 작동 할 것이다. P.의 pyomelanin 생산 균주의 치료 NTBC와 aeruginosa에 안료 생산 (12)의 농도 의존적 감소의 결과. 그림 2하여 보여줍니다 P.의</...

박테리아 피오멜라닌 생성은 산화 스트레스와 독성에 대한 저항력을 증가시킵니다. 우리는 pyomelanin 생성의 억제를 결정하고 박테리아의 산화 스트레스에 대한 민감도의 증가를 분석하며 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 데 사용할 수 있는 기술에 대해 보고합니다.

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

다음 실험들의 전반적인 목적은 NTBC가 P melanin 생성 및 산화적 스트레스 민감도에 미치는 영향과 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 배양액에 NTBC를 첨가하여 p melanin 생성을 감소시키는 농도를 결정함으로써 달성됩니다. 이후 박테리아 배양액을 NTBC와 항생제로 처리하여, NTBC 처리가 항생제 MIC에 영향을 미치는지 확인합니다.NTPC 처리된 배양액을 과산화수소에 노출시켜 NTPC 처리에 따른 산화적 스트레스 민감도를 결정한 결과, NTPC로 유전적 박테리아를 처리하면 색소 생성이 감소하고 산화적 스트레스에 대한 민감도가 증가하지만, 항생제 MIC에는 영향을 미치지 않는다는 점이 각각 산화적 스트레스 반응 스팟 플레이트와 마이크로타이터 MIC 분석을 통해 확인되었습니다. 생균수 측정 및 디스크 확산 분석과 같은 기존 방법과 비교하여 산화적 스트레스 스팟 플레이트 기법의 주요 장점은 다른 분석에서 사용하는 고농도의 과산화수소 대신 더 낮은 농도의 과산화수소를 사용할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 항생제 MIC를 결정하는 본 연구 방법이 처음인 사용자는 피펫팅 기술의 정밀도 부족으로 인해 반복 실험 간 변동성이 발생하여 어려움을 겪을 수 있습니다.이러한 가변성으로 인해 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 정확하게 결정하는 것이 어려울 수 있습니다. MIC 분석 하루 전에, LB 배지를 사용하여 테스트할 균주의 배양액을 첨가물 유무에 따라 준비하십시오.2,4,6-트리니트로페닐 1,3-사이클로헥산디온(2,4,6-trinitro-1,3-cyclohexanedione) 또는 NTBC입니다. 본 시연에서는 NTBC의 대표 농도인 300 µM을 사용합니다. 적절한 NTBC 농도를 결정하기 위한 적정 방법은 프로토콜 본문에 설명되어 있습니다. 배양액을 37 °C에서 통기하며 밤새 배양한 후 다음 날 진행하십시오.MIC 분석을 위해 LB 및 NTBC 마스터 용액과 LB 및 DMSO 마스터 용액을 조제합니다. 한 가지 균주에 대해 한 종류의 항생제를 테스트하기 위해, 2 mL의 LB에 600 µM 농도의 NTBC를 넣어 혼합합니다. NTBC 마스터 용액을 제조할 때 NTBC 농도를 600 µM로 설정하는 이유는 접종물을 추가할 때 2배로 희석되기 때문입니다.최종 농도가 300 µM이 되도록 2 mL의 LB에 동일한 부피의 용매 DMSO를 첨가하고 혼합하여 NO NTBC 마스터 용액을 만듭니다. 이 두 가지 마스터 용액은 항생제 스톡 용액을 제조하고 96-웰 플레이트에 희석 시리즈를 설정하는 데 사용됩니다. 다음으로, LB plus NTBC 또는 LB plus DMSO 마스터 용액에서 항생제 용액을 준비합니다.Gentamycin ± NTBC의 스톡 용액을 64 µg/mL 농도로 준비합니다. KANAMYCIN ± NTBC의 스톡 용액을 256 µg/mL 농도로 제조합니다. Tobramycin ± NTB의 스톡 용액을 8 µg/mL 농도로 준비합니다.두 배 농도의 항생제 용액을 제조한 후, 96웰 플레이트의 A열에 있는 4개 웰씩 각각 100 µL의 항생제 용액을 분주합니다. 예를 들어, gentamycin은 1번부터 4번 웰에, kanamycin은 5번부터 8번 웰에, tobramycin은 9번부터 12번 웰에 분주해야 합니다. 96웰 플레이트의 B열부터 H열까지 50 µL의 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액을 추가하며, 이때 하나의 플레이트는 LB + NTBC를, 다른 하나는 LB + DMSO를 사용하도록 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 A열의 용액 50 µL를 B열로 옮겨 항생제의 2배 연속 희석을 수행합니다. 용액을 섞은 후 피펫 팁을 교체하고, B열의 용액 50 µL를 C열로 옮깁니다. G열을 희석한 후 남은 행들에 대해 이 과정을 반복합니다. 해당 행에서 용액 50 µL를 제거하여 폐기합니다.H행을 박테리아 성장을 위한 항생제 무첨가 대조군으로 사용하십시오. 배지에 포함된 lanin을 제거하기 위해 모든 배양물을 세척한 후, 하룻밤 동안 배양한 배양물을 회수하십시오. 배양물의 OD 600을 측정하고, 멀티채널 마이크로 파이펫을 사용하여 lb에서 하룻밤 배양한 배양물을 희석하십시오.희석된 박테리아 배양액 50 µL를 적절한 웰에 추가합니다. 각 균주와 항생제 농도당 3개의 웰에 박테리아를 추가합니다. 박테리아 오염 대조군으로 사용하기 위해 네 번째 웰에 LB 50 µL를 추가합니다.96웰 플레이트를 파라필름으로 덮고 다음 날까지 37°C에서 약 24시간 동안 배양합니다. 플레이트를 육안으로 관찰하여 웰 내의 세균 성장 여부를 확인합니다. MIC는 각 균주의 세 번의 반복 실험 모두에서 세균 성장이 관찰되지 않은 항생제의 최저 농도입니다.본 절차를 시작하기 위해, 다음 날 안내된 바와 같이 NTBC 포함 여부에 따라 테스트할 균주들을 LB 배지에서 밤새 배양합니다. 산화 스트레스 요인으로 과산화수소가 포함된 LB APL을 준비합니다. 먼저 LB agro 플라스크를 녹인 후, 배지를 실온에서 약 50°C까지 식힙니다.다음으로, 원하는 농도의 과산화수소를 냉각된 배지에 직접 첨가합니다. 플라스크를 흔들어 과산화수소 농도가 0에서 1 mM 범위가 되도록 혼합합니다. 밀리몰(Millimolar) 농도가 적절한 시작점입니다.즉시 플레이트를 붓고 표면을 화염 멸균하여 기포를 제거하십시오. LB agar 100 milliliters당 4개의 플레이트를 제작할 수 있습니다. 플레이트에 과산화수소 농도를 표시하십시오.플레이트의 과도한 수분을 제거하기 위해, 팬을 가동 중인 생물학적 안전 작업대(biological flow hood) 안에 플레이트를 덮개 없이 30분 동안 둡니다. 플레이트는 당일에 사용해야 합니다. 플레이트가 건조되는 동안 세척 및 측정을 진행하며 준비합니다.하룻밤 배양한 배양액의 OD 600을 측정하여, 테스트하려는 균주 집합 중 가장 낮은 OD 600 값에 맞춰 모든 배양액의 OD 600을 정규화합니다. 이를 위해, 총 부피 1 mL에서 배양액을 가장 낮은 OD 600으로 희석하는 데 필요한 배양액의 부피를 결정합니다. 예를 들어, 특정 배양액의 OD 600이 3이고 균주 집합의 최저 OD 600이 2.5라면, 다음과 같이 계산하여 필요한 배양액의 부피인 0.833 mL를 구합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리 튜브에 0.833 mL의 배양액을 넣습니다.다음으로, 배양액 부피를 1mL로 맞추는 데 필요한 LB+NTBC 또는 LB+DMSO의 양을 계산하십시오. 본 예시에서는 그 양이 0.167mL입니다. NTBC 또는 DMSO의 농도를 일정하게 유지하며 배양하기 위해 볼텍싱으로 혼합하십시오. 정규화된 overnight 배양액을 PBS+NTBC 또는 PBS+DMSO에서 10배 연속 희석하십시오. 테스트하는 균주의 수에 따라 규모를 조정하여 PBS+NTBC 및 PBS+DMSO의 스톡 솔루션을 제조하십시오. 한 균주의 한 세트 희석을 위해 300µM의 NTBC 또는 이에 상응하는 부피의 DMSO를 PBS와 혼합하여 총 부피 720µL로 만듭니다. 10⁻¹부터 10⁻⁷까지의 연속 희석용으로 라벨이 부착된 적절한 마이크로 원심분리 튜브에 PBS+NTBC 또는 PBS+DMSO 90µL를 추가하십시오.배양액 10 µL를 적절한 10⁻¹ 희석 튜브에 넣고 볼텍싱으로 혼합한 후, 10⁻¹ 희석액 10 µL를 10⁻² 희석 튜브로 옮깁니다. 희석 단계마다 피펫 팁을 교체하며 모든 희석 과정이 완료될 때까지 반복합니다. 10⁻³부터 10⁻⁷까지의 희석액을 각각 5 µL씩 LV 및 과산화수소 플레이트에 중복으로 점적합니다.각 균주마다 하나의 피펫 팁을 사용하십시오. 가장 희석된 것부터 가장 덜 희석된 순서로 도말하는 경우, 액체가 플레이트에 완전히 마를 때까지 플레이트를 기울이거나 눕히지 마십시오. 균주에 따라 플레이트를 37 °C에서 24~48시간 동안 배양하십시오.적절한 크기의 콜로니가 생성되면, 트랜스루미네이터(transluminator) 위의 CCD 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다. NTBC 적정을 통해 NTBC가 p aerogen의 p melanin 생성을 감소시킬 수 있는지 확인하고, 본 실험에서 제시하는 추가 분석에 사용할 p melanin 생성을 제거하거나 감소시키는 NTBC 농도를 식별하였습니다. NTBC는 p melanin 생성 균주에서 농도 의존적으로 PY melanin 생성을 감소시켰으나, p melanin을 생성하지 않는 균주의 색소 생성에는 영향을 미치지 않았습니다.이 표는 NTBC 처리 여부 및 다양한 항생제 처리에 따른 서로 다른 p. aerogen 균주의 MIC 분석 결과를 보여줍니다. MIC는 세균 성장을 억제하는 항생제의 최저 농도로 기록되었습니다. NTBC 처리는 테스트한 균주들의 항생제 MIC에 영향을 미치지 않았습니다. NDBC 처리 여부에 따른 PIO 멜라닌 생성 및 비생성 균주의 산화 스트레스 반응에 대한 스팟 플레이트 분석이 수행되었습니다.0 mM 과산화수소 플레이트를 통해 모든 균주가 적절히 희석되었음을 확인하였으며, PIO 멜라닌 생성 박테리아를 NTBC로 처리했을 때 산화적 스트레스에 대한 민감도가 증가하는 것이 관찰되었습니다. PIO 멜라닌을 생성하지 않는 균주가 p 멜라닌을 생성하는 균주보다 산화적 스트레스에 더 민감했습니다. 이 영상을 시청한 후에는 산화적 스트레스 민감도 및 항생제 MIC 테스트를 통해 NTBC 처리가 PIO 멜라닌 생성에 미치는 영향을 결정하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 박테리아 균주의 산화 스트레스 반응을 평가하기 위해 맞춤화된 스폿 플레이트 분석을 보여줍니다. 일부 균주는 항산화 색소인 피오멜라닌(pyomelanin)을 생성합니다. 반대로, 시험제로 처리되어 피오멜라닌 생산이 감소한 균주는 산화 스트레스에 대한 민감성이 증가하여 피오멜라닌 생성 균주에 비해 세포 생존력이 감소합니다.

박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay

이 동영상은 박테리아에 대한 테스트 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 마이크로타이터 플레이트 기반 방법을 보여줍니다. 시험용 항생제의 연속 희석액이 들어 있는 마이크로타이터 플레이트에 세균성 병원균 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 현탁액과 박테리아에 의한 피오멜라닌 생성 억제제를 첨가한 후, 웰의 광학 밀도를 측정하여 항생제의 최소 억제 농도와 피오멜라닌 생산 억제제의 영향이 박테리아의 항생제 감수성에 미치는 영향을 계산합니다.

항생제의 최소 억제 농도를 평가하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

체 외 화학 물질의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 세 가지 실험 방법 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동과 2) 멜 라 닌 콘텐츠, 및 3) 멜 라 닌 세포의 멜 라 닌 얼룩 및 이미지 분석에 의해 측정의 정량화.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

이 프로토콜의 목적은 마우스 피부에서 치명적이지 않은 수준의 활성 산소 종(ROS)의 일시적인 생체 내 생산을 유도하여 조직의 생리적 반응을 더욱 촉진하는 것입니다.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

여기에서는 낮은 강도의 청색 및 보라색 광 조사 하에서 플라 빈 모노 뉴클레오티드 (FMN)의 광분해 중에 생성 된 활성 산소 종으로 병원성 박테리아를 비활성화하는 프로토콜을 제시합니다. FMN 광분해는 위생 공정을위한 간단하고 안전한 방법으로 입증되었습니다.

리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 불활성화

tBHP를 이용한 HNM 조기 노화 유도 표준화 프로토콜, 성장 정지, SA-β-갈락토시다제 활성, SASP 인자 등 주요 노화 지표 분석의 표준화 프로토콜.

테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드를 이용한 스트레스 유발 조기 노화 유도 프로토콜

배우세요 NTBC 처리로 세균의 피오멜라닌 생성을 억제하고 산화 스트레스 민감도를 증가시키는 방법을. 이 기법은 항생제 MIC에 영향을 주지 않으면서 세균 감염 치료 전략 개발에 활용됩니다.

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

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