Name: Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Öğrenin fare kolon mukozasının mikrodisseksiyonu için kriyoseksiyon yöntemini. Bu teknik, kript baz ve yüzey epitel hücrelerini izole ederek gen ve protein ekspresyon analizlerini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK55679 tarafından desteklenir ve A.N.'ye DK59888). Winship Kanser Enstitüsü kapsamlı kanser merkezi hibesi, P30CA138292 Emory Üniversitesi Entegre Hücresel Görüntüleme Mikroskobu Çekirdeği ve Amerika Crohn ve Kolit Vakfı Kariyer Geliştirme ödülü CTC'ye ve AEF'ye Burs Ödülü.

Deneyler, yaşlan 10 ile 12 hafta arasında, C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Hayvanları kullanan tüm prosedürleri gözden ve Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Sağlık kriterlerine National Institutes göre gerçekleştirilmiştir bulundu. 1. Deney Düzeneği <ol><li> Cryostat Kurma <ol><li> Mikrotom bıçak ve mandreller dahil, -20 ° C&#39;ye Kriyostat dengelenmesi (bıçak etrafında aşırı dikkatli!). </li><li> Ekim boş bir cryomold (Optimal Kesme Sıcaklık bileşik) doldurun ve -20 ° C (~ 30 dk) dengelenmesi. Kalıptan dondurulmuş Ekim çıkarın ve sıvı OCT ile aynasının üzerinde sabitleyin. Mikrotom kolunda blok / mandreni yerleştirin ve Ekim 10 dakika için ayarlamanızı sağlar. </li><li> Bölüm başına 10 um Kriyostat ayarlayın ve düz olana kadar Ekim blok tıraş. Birkaç santimetre bıçaktan uzak mikrotom kolunu yedekleyin. Bu noktada exper kalanı için bıçak ya da Chuck ayarlamak yokşekli. </li></ol></li><li> Jilet hazırlayın: numune başına 2 Jilet hazırlayın. Metal dosyasını kullanarak, bıçakların sharped kenarı donuk. Sonra, forseps ile alüminyum flanşı çıkarın. </li><li> Kuru buz üzerinde bir Pyrex çanak veya diğer düz bir yüzeye önceden soğuk. </li><li> 10-15 diseksiyon pimleri ile diseksiyon çanak hazırlayın. Silikon ile dolu bir 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı% 50 yeterli olacaktır. Oda sıcaklığında Hanks tamponu içinde 5 ml. </li></ol> Distal Kolon Doku 2. Diseksiyon <ol><li> Izofluran inhalasyonu ve servikal dislokasyon ile yerleştirin yalıtılmış bir bölmede fareler ve euthanize fareler, daha sonra karın ve göğüs 12 üzerine% 70 etanol sprey. </li><li> Makas ile karın derisinde küçük bir kesi yapmak ve daha sonra bir kesi periton boşluğuna maruz olun. Benzer işlemler burada 12 tarif bulunabilir. </li><li> Anal eşiğinde kalın bağırsak kesin ve kolon serbest kalıncaya kadar mezenter ayrı kızdırmak. </li><li> Distal kolon tüketimanüsten 0 ve 6 cm arasında kademeli. Burada, kript derinliği ~ 150 mikron (Şekil 1B bakınız). Makas kullanarak boyuna kolon açın ve dışkı içeriğini kaldırmak kesmek. </li><li> Mukoza yüzeyi yukarı bakacak şekilde diseksiyon çanak doku pin. Hanks tamponu bir silikon çanak doku kullanılarak diseksiyon işaretçilerine gerin ve RT (Şekil 1C) 10 dakika dinlendirin. Bu doku kıvrımlar kaldırır ve kas tabakaları dinlenmek için izin verir. </li></ol> Kesit için Kriyostat 3. Montaj Doku <ol><li> Dokuda istenilen bölümünde bir jileti kaydırın ve ardından Hanks tampon dökünüz. Bir sandviç yapma, üstüne başka bir jilet ekleyin. Doku segmenti kesin ve işaretçilerine çıkarın. Kuru buz jilet / doku sandviç aktarın. (5-10 dk, Şekil 1D) doku dondurmak için izin verin. </li><li> Jilet / doku sandviç Pick up ve üst bl üzerinde bir parmak koyarak hafifçe ısınmaya bırakınade (mukozal tarafı yukarı. Bu bazal kas tabakaları ilk kesitli böylece doku yönlendirir.). Sandviç ayırın ve doku segmentinin kenarlarda kesti. Bir doku bir bölümü yaklaşık olarak 0.5 cm x 1 cm kesilir. Kenar bölgeleri seri bölümleri birçok doku katmanları içeren neden kıvrılmaya bir eğilim vardır. Aşırı kesme altında kesim daha iyi olduğunu unutmayın, bu yüzden dikkatli bir tarafında err. </li><li> Doku üstünde buz erimeye başlayana kadar doku ısınmasını bekleyin. Bu noktada hızlı ve dikkatli kriyostat OCT bloğa doku basın. </li><li> Numune üzerinde parmağınızı koyarak bıçağını çıkarın. Isı transferi doku aksatmadan bıçağı çıkarmak için izin verecektir. </li><li> Ceket Ekim doku ve 5 dakika için dengelenmeye. 10 mikron (Şekil 1E, F) bölümleri kesin. Kriptler görülür kadar gözle bölümleri inceleyin. 1.5 ml tüpler içinde veya slaytlar yerleştirin bölümleri. </li><li> MRNA veya protein, bir yer t analizi için5 crypt-baz geçiş 5 ve tüp başına 5 yüzey bölümleri ile tüplerde o örnekleri. RNA toplanması için 1 ml ticari bir yalıtım reaktif ekleme ve 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, RNA saflaştırma gerçekleştirin. CDNA üretimi için toplam RNA 5-10 mikrogram kullanın. </li><li> Protein Saflaştırma için, soğuk RIPA 0.5 ml 5 bölümden başına tampon (artı proteaz inhibitörleri), liziz ekleyin. Buz üzerinde,% 70&#39;lik bir çevrim ile 3 kez sonikasyon. <ol><li> SDS-PAGE yükleme tamponu (Laemmli tamponu) numune ilave edin ve 10 dakika boyunca 100 ° C de inkübe edilir. SDS PAGE ve transfer tabi örnekleri, daha sonra 2 saat boyunca% 5 süt / PBS içinde bloke eder. (: 1: 500), 4 ° C&#39;de, O / N Klf4 antikorlar ile kuluçkalandı ve ardından Western blot analizini gerçekleştirir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
<li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li>
<li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+is+it+really+just+another+break+in+the+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li>
<li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li>
<li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192(2011).</li>
<li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li>
<li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li>
<li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li>
<li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li>
<li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Kolon epitel hücre çoğalması ve farklılaşması katılan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu kolon epitel kriptlerin dibinde kök hücre bölmesinin hücresel sinyal ortamında anlayışımızda boşlukları içerir. Enterosit farklılaşmasını altında yatan süreçlerin artan bir ilgi vardır. Örneğin, in vivo farklılaşma anlayışı in vitro primer intestinal sistemleri 16 üretmeyi amaçlayan çalışmalar için bir kriter olarak gerekli arttı. Yukarıdaki prosedür ekstra dikkat gerektiren çeşitli adımları içerir. Öncelikle, dondurulmuş doku segmentinde etrafında kenarları (bölüm 3.2&#39;de anlatıldığı gibi) kaldırarak diseksiyon ve donma sırasında kıvrılma doku kenarları olarak gereklidir. Bu kenarları sonuçları taşımak için başarısızlık yüzeyi ve kript baz hücrelerinin karışık nüfusu. Önceden soğutulmuş, tesviye Ekim blokta doku montaj da esastır. Tonun protokolü her bir havuz bölümlerin sayısını değiştirerek distal kolon diğer alanlarda adapte edilebilir. Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi Örneğin, mukozal kript uzunluğu 150-300 um arasında değişir. Anüsten 4 cm 6 cm arasında bölgeyi incelemek Bu nedenle, bölme sayısı Önemlisi 30&#39;a 15&#39;e yükselmiştir gerektiğini, bu protokol proksimal kolon için tavsiye edilmez (7 cm 9 cm) nedeniyle kıvrımları ile ( Seri kesit ile ayrı yüzeyi ve kript-baz hücrelerine imkansız hale lümenine uzanan plika obliquae). Seri kesit teknikleri kript-temel çalışma ve insanlarda epitel hücre popülasyonlarının yüzey kullanılmıştır. Ancak, bizim protokol nedeniyle fare doku küçük boyutu için gerekli olan ek adımlar ekler. Yukarıdaki protokol genetik uysal fare sistemlerinde kript tabanı ve yüzey epitel hücre popülasyonunun soruşturma sağlayacak öneriyorum. Gerçekten de, bir araya getirilmiş bölümler Yield yüksek kaliteli protein ve RNA uygun aşağı analizi. Gelecekteki uygulamalar, hücre sinyal yolları veya kromatin immunoprecipitation çalışma içerebilir. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen alternatif yöntemler birkaç gibi, elde edilen bölümler epitelial be interstitial lamina propriya hücrelerinin bir karışımını içeren, dikkat edilmelidir. Sonuç olarak, burada tarif edilen bir protokol murin kolon mukozası uzamsal olarak ayrı bölgelerde moleküler proseslerin analizi için hızlı, yüksek verimli bir yöntem temin etmektedir.

Kolon epitel ikamet kök hücreleri birkaç günde 1 doku Yenileyici ile son derece rejeneratif doku vardır. Rejenerasyon Bu işlem, bir proliferatif kök hücre bölmesinin bakım gerektirir. Zamanla, yeni üretilen kızı hücrelerinin çoğalma potansiyeli kaybeder ve bağırsak lümen yüzeyine doğru göç ederler. Göç ile tesadüf, progenitör hücrelerin olgun bariyer oluşturan enterositlerin veya mukoza üreten goblet hücrelerine farklılaşır. Bu farklılaşma programlarının başarısızlığı, iltihabik barsak hastalığı ve kolon kanseri 2,3 gözlenmiştir gibi epitelyal bariyer tehlikeye katkı düşünülmektedir. Yukarıdaki işlemlerin detaylı bir çalışma kript-taban ve yüzey hücre popülasyonlarının izole edilmesi için metodolojileri gerektirecektir. Birden yöntemler benzersiz avantajlar ve dezavantajları, her biri mevcuttur. Intestinal epitelyal hücrelerin izolasyonu için güncel yöntemler, CHDeney koşulları, 4,5 göre, tüm kriptlerin, epitelyal levhalar, ya da tek hücreleri, izolasyonu ile sonuçlanarak elating maddeler ve mekanik ayrışma. Bu yüksek verim yöntemlerdir, fakat hücreler arası sinyal değişiklik doğal ortamından 6,7 temsil edebilir, bu koşullar altında rapor edilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyon mekansal farklı malzemenin toplanması için izin verir, ancak düşük molekül verim 8,9 ulaşır. İnsan kalın bağırsak dokusunda olarak, seri, yatay krio-bölümleme yöntemleri 10 geliştirilmiştir. Bununla birlikte, faregiller mukozal dokular, bu tekniğin, doğrudan dağıtımı ile ilgili bir engelleyici küçüktür. İnsanlarda, kolonda (kript-taban ve yüzey hücreleri arasındaki uzak) bağırsak crypt uzunlukları um 100-1000 ~ arasında 11 değişir. Farelerde, kript boyları um 50-300 ~ arasındaki (Şekil 1A bakınız). fare kript küçük boyutlu isola bir meydan okuma sunuyorMevcut protokolleri kullanarak, bu iki hücre popülasyonlarının yon. Artık, düşük maliyetli, kript-baz izolasyonu için yüksek verimli bir yöntem tarif ve murin kolon dokusunda epitel hücre popülasyonu, yüzey. Bu şekilde hasat Doku daha sonra immünofloresan boyama, RT-PCR (Anlık-Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve western blotting de dahil olmak üzere, standart bir sonraki uygulamada, bir dizi analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Almanya</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ gerçek zamanlı PCR dedektörü</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Doku-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>kriyo-kalıp</td><td>Doku-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Yüksek profilli mikrotom bıçağı</td><td>Leica Biosystems, Nussloch almanya</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM endüstriyel bıçaklar</td><td>Amerikan Güvenlik Tıraş Bıçakları</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silikon elastomer taban</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g iğne</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td>Diseksiyon için 305109 pimleri</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Antikor ZO-1</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Antikor KLF4</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Antikor mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Antikor İkincil Alexa konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-tavşan</td></tr><tr><td>Antikoru İkincil HRP konjugatı</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>tavşan / fare ve nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs dengeli tuz tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lizis tamponu</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl %1 NP40 %0.25 Na-deoksikolat</td></tr><tr><td>astar TBP</td> 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>astar TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>astar KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>astar KLF4</td> 5'ACAGTGTTAAGGTTTCTCGCCTGT <td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare kolon mukozanın mikrodisseksiyon için cryosectioning yöntemi

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Kolon mukozal dokusu, luminal antijenlere karşı hayati bir bariyer sağlar. Bu bariyer, basit kolumnar epitel hücrelerinin tek tabakasından oluşur. Kolon epiteli dinamik olarak ters çevrilir ve Lieberkühn kriptlerini içeren kök hücrede epitel hücreleri üretilir. Kript bazlarında üretilen progenitör hücreler, bağırsak lümenine dökülmeden önce bir hücresel farklılaşma sürecinden geçerek luminal yüzeye doğru göç eder. Bu süreçleri moleküler düzeyde incelemek için, kolon mukozasının mekansal olarak farklı iki bölgesinin mikrodiseksiyonu için basit bir yöntem geliştirdik; proliferatif kript bölgesi ve farklılaşmış yüzey epitel hücreleri. Amacımız, RNA ve protein izolasyonu için fare kolon mukozasından spesifik kript ve yüzey epitel hücre popülasyonlarını izole etmektir.

Kolon doku kesitleri histolojik değerlendirme ve H &amp; E 13 boyamak için işlenmiştir. Mukoza geleneksel kesit görünüşüdür Şekil 2A&#39;da görülmektedir. Bazal alanlar ağırlıklı olarak dairesel muskularis oluşan muskularis eksterna, içerirler. Lümene doğru ilerleyerek, muscularis mukoza kript baz epitel hücreleri bitişik belirgindir, ara hücreleri doku ortasında, ve son olarak, yüzey hücre popülasyonları bağırsak lümenini karşı karşıyadır. Burada tarif edilen seri kesit yöntemi muscularis mukoza (Şekil 2C) ve ardından boyuna ve dairesel muscularis ilk (Şekil 2B) karşılaşılan şekilde bir yönlendirme korur. Görüntünün sol üst dışı kas interstisyel hücrelerin görünümünü unutmayın. Aşağı analiz aşağıda açıklanan için, kas bölümleri atılır. sonraki bölümlerde epitel hücreleri ve interstisyel doku içerirler (lamina propria), Kript baz hücreleri (Şekil 2D) ile başlanarak. Nedeniyle yakından paketlenmiş çekirdeklere koyu görünür kriptalarının, çoğunda merkezi lümenin olmadığına dikkat edin. Bu tabakalar, proliferatif bir bölme ihtiva etmektedir. geçiş hücreler sıkı belirgin santral lümen (Şekil 2E) ile bezlerini dolu görünür. Son olarak, yüzey hücre popülasyonları yüzü (Şekil 2F) tr inceledi epitel tek tabaka alanları ile, düzensiz bir yapıya sahiptir. (Burada 14 tarif edildiği gibi), yukarıda tarif edildiği gibi seri bölümler, aynı zamanda immüno-floresan etiketlemesini ve konfokal mikroskopi için işlemden geçirilebilir. Şekil 2G çekirdekleri (mavi) ve hücre-hücre birleşme kısmı proteini zonula için boyanmış, daha sonra sabit ve% 100 metanol geçirgenleştirildi ve izole crypts gösterir occludens 1 (ZO-1, yeşil). Geleneksel kesit yönde, crypt ve yüzey hücre (Şekil 2G aynı anda izlenebilir </strong&gt;). Not ZO-1 junctional leke hatları olduğunu kolon crypt lümen. Lümenin Bu Z0-1 kaplama, aynı zamanda, dairesel bezleri (Şekil 2G) merkezinde, bir geçiş hücre popülasyonlarının seri kesit örneklerde görülebilir. Gelişmiş ZO-1 leke yüzey hücre popülasyonlarının (Şekil 2I ve J) görülür. Çeşitli farklılaşma faktörleri kript-yüzey ekseni boyunca uzaysal bir şekilde ifade edilebilir olduğu bilinmektedir. Bu yüzey hücre popülasyonları açısından zenginleştirilmiş olduğu bilinen transkripsiyon faktörü Kruppel benzeri faktör 4 (Klf4) içerir. Geleneksel kesit yöntemleri kullanarak, Klf4 yüzeyi hücre popülasyonlarının (Şekil 2K) bakan lümeninin çekirdeğinde bulunan. Bu nedenle, Klf4 mRNA&#39;nm temelde, yüzey hücresi popülasyonunda ifade edilir speküle etmişlerdir. Bunu test etmek için, seri kesitler toplanmış ve yüzey, geçiş ve kript-baz örneklerinin gruba ayrıldı. Subsequediğer yönden başkaları baskın, RNA, RNeasy kolonu ve DNAz muamelesi ile ek saflaştırma, standart Trizol ekstraksiyonu kullanılarak hasat edilmiştir. RNA örnek başına toplam RNA ug 5-10 arasındaki vermiştir 5 toplanmış ardışık kısmı, toplandı. Bu numuneler daha sonra Klf4 ve bir referans gen, TATA kutusu, bağlayıcı protein 1 (TBP-1) (Şekil 2 L) 14 hem de yarı-kantitatif gerçek zamanlı PCR tabi tutuldu. Şekil 2L gösterildiği gibi, TBP-1 normale döndükten sonra, yüzey hücreleri kript hücrelerde ifade edilir 8 kat Klf4 mRNA kadar ifade etmek için bulunmuştur. Benzer şekilde, Klf4 protein seviyeleri kript yüzeyi eksen boyunca mekansal düzenleme arzettiği bulunmuştur. 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle liziz tamponu içinde, yukarıda tarif edilen ve daha sonra kuluçkaya yatırılır olarak seri bölümler havuzlandı. Bu örnek başına protein 200-250 mikrogram arasında vermiştir. Numuneler daha sonra, SDS-PAGE (Şekil 2 M) 15 analizler tabi tutulmuştur. Şekil 2M gösterildiği gibi, Klf4 srotein seviyeleri önemli ölçüde yüzey hücre popülasyonlarının daha yüksektir. Yukarıdaki bulgular kemirgen kolon mukozasından yüzey ve kript epitel hücrelerinin büyük miktarda izole etmek, bu protokolün yeteneğini göstermek. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Şekil 1: (A) şematik gösteren fare kolon mukozası ve dış kas tabakaları. Bizim yöntemi seri cryosectioning (10 um her) tarafından ayrı yüzey hücre ve kript-baz hücre popülasyonlarının toplamayı hedefliyor. Dış kas tabakaları atılır. (B) kript yüksekliği kolon (kript-baz ve yüzey tabakalara arasındaki mesafe) uzunluğu boyunca değişir. Veri noktaları bireysel kript ölçümleri ve semboller biyolojik çoğaltır bildiren (n = 4). (C) Kolon bölümleri, toplanan ikiye, ve bir silikon diseksiyon çanak üzerine tutturulmuş. Se (d) bir dokuanüsten 3 cm kadar traş makinesi bıçaklara arasında sıkıştırılmış ve kuru buz üzerinde dondurulmuştur BÖLÜMLERE GÖRE R. (E) Doku daha sonra önceden tesviye Ekim blok üzerine monte edilir. (F) Cryosections kaldırıldı ve görsel denetlenir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Şekil 2:. Örnek veriler dairesel muscularis (cm) gösteren enine kesitte hematoksilin-eosin ile boyandı (A), kalın bağırsak dokusunda, muscularis mukoza (mm), kript-nokta hücreleri, geçici hücre ve yüzey hücreleri. (B - C) kolon kas tabakası. (D) Crypt-baz hücreleri. Merkezi bir lümen olmadığına dikkat edin. (E) Geçiş hücreleri. (F) Yüzey hücreleri. İzole kolon kript (G) İmmünfloresan boyama. ZO-1 (yeşil) ve çekirdek (mavi) kesit olarak görülmektedir. (HI) ZO-1 ve geçiş ve yüzey hücrelerinde nükleer boyanma. (J) ZO-1 boyama büyütülmüş görünümü. (K) Klf4 (yeşil) yüzey hücre popülasyonlarında zenginleştirilmiştir. (L) üç bölmeleri arasında Klf4 mRNA seviyelerinin real-time PCR değerlendirmesi. (E) bu hücre popülasyonunda Klf4 proteini düzeylerinin Western blot analizleri.

Burada, uzamsal olarak farklı murin kolonik epitel yüzey hücrelerinin alttaki kript bazlı hücrelerden izolasyonu için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bu prosedürün genel amacı, kolonun iki mekansal olarak farklı bölgesini, proliferatif K kript zonunu ve diferansiye yüzey epitel hücrelerini mikro diseke etmektir. Bu işlem, öncelikle fare kolonunun çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, dokunun iki metal plaka arasında dondurulmasıdır.Ardından, doku önceden düzeltilmiş bir OCT bloğuna yerleştirilir. Son adım, dokunun bir kriyostatta 10 mikron aralıklarla kesilmesidir. Nihayetinde, gen ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri göstermek için gerçek zamanlı PCR veya Western blot kullanılır.Tekniğimizin avantajı; hızlı, düşük maliyetli ve yüksek verim gösteriyor olmasıdır. Prosedürümüz, grubumuzdaki teknisyen Christian Garner Schmidt tarafından gerçekleştirilmiştir. Hayvanların kullanıldığı tüm prosedürler Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelenip onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kriterlerine uygun olarak yürütülmüştür.Kriyostat kurulumunu tamamladıktan sonra, her zamanki gibi, kriyostat bıçaklarını ve tutucuları -20 °C'ye kadar dengeleyin. Ardından, boş bir kriyo kalıbı optimal kesme sıcaklık bileşiği (OCT) ile doldurun ve -20 °C'ye kadar dengeleyin. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürecektir.Donmuş OCT'yi kalıptan çıkarın ve sıvı OCT kullanarak çaka sabitleyin. Çaka mikrotom koluna yerleştirin ve OCT'nin 10 dakika boyunca donmasını bekleyin. Kriyostatı kesit başına 10 mikron olarak ayarlayın ve OCT bloğu düzleşene kadar tıraşlayın, ardından mikrotom kolunu bıçaktan birkaç santimetre uzağa çekin.Ardından, her örnek için metal bir eğe kullanarak iki adet jilet hazırlayın ve jiletlerin keskin kenarlarını köreltin. Daha sonra alüminyum flanşı pensle çıkarın. 10 santimetrelik, %50'si silikonla dolu bir doku kültürü kabı ve 10 ila 15 adet diseksiyon iğnesi hazırlayın.Fareyi onaylanmış yöntemlere göre ötanize edip anüsten 0 ile 6 cm arasındaki distal kolon segmentini çıkardıktan sonra, kaba oda sıcaklığında 5 mL hanks tamponu ekleyin. Kesim işlemi için makas kullanın. Kolonu boylamasına açın ve fekal içeriği temizleyin.Dokuyu, mukozal yüzeyi yukarı bakacak şekilde, Hank's tamponu içeren silikon diseksiyon kabına iğneleyin. Dokuyu diseksiyon iğneleri kullanarak gerin. Ardından, dokudaki katlanmaları gidermek ve kas tabakalarının gevşemesini sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Doku dinlendikten sonra, uç pimler hariç tüm pimleri çıkarın. Dokunun istenen bölümünün altına bir jilet kaydırın ve ardından hanks tamponunu dökün. Üste, sandviç şeklinde olacak şekilde başka bir jilet ekleyin.Doku segmentini kesin ve uç pimlerini çıkarın. Jiletle sıkıştırılmış doku örneğini kuru buza aktarın. Dokunun beş ila 10 dakika boyunca donmasını bekleyin.Jiletle sıkıştırılmış doku örneğini alın ve üst bıçağın üzerine bir parmağınızı yerleştirerek hafifçe ısınmasını sağlayın. Sıkıştırmayı ayırın ve doku segmentinin kenarlarından kesin. Yaklaşık 0.5 santimetreye 1 santimetre boyutlarında bir doku segmenti kesin.Dokunun üzerindeki buz erimeye başlayana kadar ısınmasını bekleyin. Bu noktada, dokuyu hızlıca ve dikkatlice OCT bloğuna bastırın. Kriyostat içerisinde numunenin üzerine bir parmağınızı yerleştirin.Isı transferi, dokuyu bozmadan bıçağı çıkarmanıza olanak tanıyacaktır. Dokuyu OCT ile kaplayın ve beş dakika boyunca dengelenmeye bırakın. Ardından 10 mikron kalınlığında kesitler alın.Kesitleri bir lama yerleştirin ve kriptler görülene kadar kesitleri görsel olarak inceleyin. Kesitleri 1,5 milliliter tüplere veya lamlara yerleştirin. Bu görüntü, dairesel muscularis tabakasının cm olarak etiketlendiği, geleneksel enine kesit şeklinde hematoksilin eozin ile boyanmış kolon dokusunu göstermektedir.MM olarak etiketlenen muscularis mucosa, kript taban hücreleri, geçiş hücreleri ve yüzey hücreleri net bir şekilde görülmektedir. Bu görüntü, seri kesit alma işlemi sonrası sirküler muscularis tabakasını göstermektedir. Yüzey hücrelerine doğru ilerledikçe, muscularis mucosa görülür.Bu görüntü, daha yüksek büyütmede h ve D ile boyanmış kript taban hücrelerini göstermektedir. Merkezi bir lümenin yokluğuna dikkat edin. Burada geçiş hücreleri görülmekte olup bu görüntü yüzey hücrelerini göstermektedir.Aşağıdaki görüntüler, hücreler arası bağlantı proteini olan zonula occludins-1 veya ZO-1 için boyama yapılan izole kolon kriptlerinin immünofloresan boyamasını göstermektedir. ZO-1 yeşil renkte, çekirdekler ise mavi renkte görünmekte olup enine kesitte gözlemlenmektedir. Geçiş ve yüzey hücreleri, seri kesitler alındıktan sonra burada gösterilmiştir.Kript yüzey ekseni boyunca çeşitli farklılaşma faktörleri spasyotemporal bir biçimde eksprese edilir. Buna, enine kesitte bakıldığında yüzey hücre popülasyonlarında zenginleşmiş olan ve yeşil renkle gösterilen transkripsiyon faktörü cripple like factor four dahildir; seri kesit alma yöntemi, üç kompartman arasındaki KLF four mRNA seviyelerinin gerçek zamanlı PCR ile değerlendirilmesine olanak tanır. Son olarak, bu western blot, söz konusu hücre popülasyonlarındaki KLA four protein seviyelerini göstermektedir.Mikrotom bıçaklarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü uygularken ekstra dikkatli olun.

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir farenin ince bağırsağından tüm kriptoları izole etmek için bir teknik gösteriyoruz. İzole edilmiş bütün kriptler, in vitro olarak uzun ömürlü ve kendi kendini yenileyen 3D organoidleri çoğaltmak için kullanılabilir.

Bağırsak Kriptleri İzolasyonu: Murin Modelinin İnce Bağırsağından Tüm Kriptleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Tüm montaj preparatlarını hızlı bir şekilde hazırlamak için fare bağırsaklarını kesmek ve 'yuvarlamak' için basit bir cihazın kullanımı açıklanmaktadır.

Basit Aygıt Hızla Fare Bağırsak Tüm Mounts Hazırlanır

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Enterochromaffin (EC) hücreleri küçük bir alt gastrointestinal epitel hücrelerinin oluşturmaktadır. EC hücreleri elektriksel olarak heyecanlı ve kültür ve EC hücreleri tanımlayan zorlukları fizyolojik çalışmalar sınırlı henüz serotonin, bırakın. Burada sunulan yöntem bir birincil kültür model tek EC hücrelerin incelenmesi için mükellef tarafından Elektrofizyoloji kurar.

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Belirli fare doku işleme için fare histopatolojik analiz insan numuneler ile karşılaştırıldığında kalitesini azaltır. Burada, robot sistemleri işleme ve insan örnekleri katıştırma için rutin olarak kullanılan fizibilite göstermek için fare iltihaplı ve uninflamed kolon dokularında histopatolojik incelenmesi gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır

Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsilerini indüklemek ve yara kapanışını gerçek zamanlı olarak izlemek için prosedürün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Ayrıca yara yatağının histolojik, immünohistokimyasal ve moleküler analizleri için dokuların hazırlanması için yöntemler sağlanmaktadır.

Farelerde Kolonoskopik Güdümlü Çimdik Biyopsilerinin Yapılması ve Sonraki Doku Değişikliklerinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Öğrenin fare kolon mukozasının mikrodisseksiyonu için kriyoseksiyon yöntemini. Bu teknik, kript baz ve yüzey epitel hücrelerini izole ederek gen ve protein ekspresyon analizlerini kolaylaştırır.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

Daha fazla video keşfet