Name: 전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 배우세요 전립선암 임상 조직에서 miRNA 식 분석을 위한 간소화된 워크플로우입니다. 레이저 포획 현미절단, 정량적 실시간 PCR, 원위 하이브리드화 기법을 활용하여 miRNA 발현을 정량화하고 위치를 특정합니다.

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우리는 원고의 준비와 자신의 지원과 도움 박사 로저 에릭슨 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 지원되었다 (허가 번호 RO1CA177984, RO1CA138642), 전립선 암 (BX001604)에 버지니아 프로그램 프로젝트.

포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 또는 냉동 전립선 암 샘플 SFVAMC로부터 수득 하였다. 샘플 SFVAMC에서 급진적 인 전립선 절제술을받은 전립선 암 환자에서 있었다. 서면 동의서는 모든 환자에서 얻어진 것으로,이 연구는 인간의 연구에 UCSF위원회에 의해 승인되었다. 또는, 전립선 암 조직 마이크로 어레이는 상업적인 출처의 조달과의 miRNA가 ISH하여 분석에 사용 하였다. 분석 된 전립선 암 환자의 임상 병리학 및 후속 정보를 수집 하였다. 1. 조직 샘플 <ol><li> H &amp; E는 제조 업체의 프로토콜을 다음과 마이크로톰 및 얼룩을 사용하여 10 μm의 섹션으로 전립선 암 조직 샘플을 잘라. </li><li> 전립선 암 병소의 식별을위한 스테인드 슬라이드뿐만 아니라 인접한 정상 선의 상피를 검토합니다. 참고 : 보드 인증 병리학 H &amp; E 염색 슬라이드와 엄마를 검토해야종양 및 정상 영역에 대한 RK. 의 miRNA에 대한 다음 섹션에서 가이드가 정상 영역 대 종양 분석으로 표시된 슬라이드를 사용합니다. </li></ol> 정량 실시간 PCR 2. miRNA의 식 ​​분석 참고 : 레이저 캡처 미세 절제, (의 miRNA와 mRNA를 포함) 총 RNA의 분리, 다음 절에서 설명하는대로의 TaqMan 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 성숙의 miRNAs의 시금 :이 워크 플로는 다음과 같은 단계를 포함한다. <ol><li> RNA 추출 <ol><li> 전립선 암 FFPE 조직에서의 miRNA의 분리 <ol><li> 레이저 캡처 미세 절제 (LCM) 참고 : 단계를 수행 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4을 화학 물질 흄 후드에서. <ol><li> LCM에 대한 조직 슬라이드 (10 μm의 섹션)을 준비합니다. 10 분마다, (2 배) 크실렌에 침지하여 Deparrafinize 조직 절편 후 증류 하였다 등급 에탄올 (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 각각 5 분간 슬라이드를 배양하여 조직을 재수 물(5 분). </li><li> 수분 보충에 이어, 30 초 동안 헤 마톡 실린과 얼룩 섹션은 물 하였다. </li><li> 플레이스 등급 조직 에탄올 (70 %, 95 % 90 %, 80 %, 70 %) (5 분마다), 크실렌 (5 분). </li><li> 다음 드라이 흄 후드 슬라이드 및 미세 절제에 대한 LCM 악기에 배치합니다. </li><li> 제조업체의 지침 (24)에 따라 LCM 시스템과 microdissections을 수행합니다. 사용 병리학 전립선 암 병소의 확인뿐만 아니라, 인접 정상 조직에 대한 가이드로 슬라이드를 표시했다. 70-90의 mW의 전력으로 10 내지 20 μm의 직경 펄스의 레이저 빔을 사용한다. </li><li> LCM 모자 위에 적외선 레이저 펄스와 관심의 캡처 영역. 샘플 당 miRNA의 추출을위한 2-5 캡에서 세포를 결합합니다. 즉시 RNA 추출의 무결성을 보장 miRNA의 추출을위한 세포를 캡쳐 방법에 관한 것이다. </li><li> 대안 적으로, miRNA의 추출 버퍼를 Lyse 세포 (제조사의 프로토콜에 따라)와 STO-80 ºC에서 해물을 다시. </li></ol></li><li> LCM Microdissected 조직에서 miRNA의 추출 및 분석 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 microdissected FFPE 조직에서 전체 RNA를 추출합니다. 참고 : 레이저 캡처 miscrodissection에서 RNA의 수율은 일반적으로 낮다. 따라서, RNA는 낮은 볼륨 (20 ~ 30 μL)로 용출 및 제조업체의 지침에 따라 TAQMAN 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 발현 프로파일 링 (또한 2.2 절에 설명)에 사용됩니다. 성숙한 miRNAs의 실시간 PCR 검출을위한 입력의 RNA 최적화 용출 RNA의 5 μL 각 miRNA에 특이 적 역전사 반응을위한 최적 인 것을 의미한다. 내인성 대조군으로 RNU48 / RNU24가 사용됩니다. 제어 반응 들어, RNA의 용출 2 μL은 역전사 반응에 사용된다. </li></ol></li></ol></li><li> 전립선 암 냉동 조직에서의 miRNA의 분리 <ol><li> Homoge박격포와 유 봉을 사용하여 액체 질소에 조직을 분쇄하여 냉동 절제 전립선 조직을 nize. 냉각 된 주걱을 사용 microcentrifuge 관에 균질 조직을 전송합니다. 쉽게 전송할 수있는 액체 질소 때문에 균질 조직에 침지하여 동일한 온도에서 박격포 / 유 봉 주걱을 유지한다. </li><li> 균질화 된 조직 상용 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 - 페놀 시약 (1 ㎖ 조직 / 0.1 g)을 첨가하고 5 분 동안 실온에서 배양한다. 주 : 상용 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 - 페놀 시약 균질화 조직 수개월 -80 ºC에 저장 될 수있다. </li><li> 균질 (0.2 ml의 클로로포름 / ㎖)에 클로로포름을 추가하고 30 초 동안 격렬하게 흔들어. 4 ºC에서 20 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리 3-5 분 동안 실온에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 신선한 멸균 된 RNase가없는 1.5 ML 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> 이소 프로필 알코올의 동일한 볼륨을 추가합니다. 믹스 10 마일 부화N 실온에서 RNA 펠렛 4 ºC에서 20 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리 하였다. </li><li> 뜨는을 기음과 70 % 에탄올 1 mL로 RNA 펠렛을 씻는다. 4 ºC에서 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음. 5 ~ 10 분 동안 실온에서 건조 RNA 펠렛. 50 ~ 100 μL 뉴 클레아없는 물에서 RNA를 녹인다. </li><li> nanodrop 분광 광도계를 사용하여 RNA의 정량을 수행하고 bioanalyzer로 RNA의 무결성을 결정합니다. 10 NG / μL로 RNA 농도를 조정합니다. PCR 분석을 실시간 (2.2 절) 다음 miRNA- 특정 cDNA의 반응에 10 ~ 50 ng의 RNA를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> miRNA의 식 ​​분석을위한 정량 실시간 PCR 후술하는 바와 같이 두 단계 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 성숙한 miRNAs의 정량법 : 참고. <ol><li> 역전사 (RT) <ol><li> 역 제조업체의 지침에 따라 miRNA의 역전사 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를을 쓰다.마이크로 RNA 분석 실험 및 RT 키트에서 miRNA의 특정 프라이머 전체 RNA의 10 ~ 50 NG를 사용합니다. 컨트롤로 RNU48 / RNU24 / RNU6B을 사용합니다. (분석의 miRNA의 풍부에 따라 다름) 1:10 (5) 다음 단계에 설명 된대로 실시간 PCR 검출에 사용 된 cDNA 1을 희석. </li></ol></li><li> 성숙한 miRNA의 탐지를위한 실시간 PCR <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 빨리 유니버셜 마스터 믹스 마이크로 RNA 세이를 이용하여 cDNA의 샘플들로부터 PCR 증폭 제품. RNU48 / RNU24 / RNU6B 컨트롤에 샘플을 정상화. 빠른 실시간 PCR 시스템에서 유전자 발현의 상대적인 변화를 계산하는 비교 코네티컷 (임계 사이클) 방법을 사용합니다. 세중의 각 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 제자리 교잡에서 3.의 miRNA 발현 분석 (ISH) <ol><li> 조직의 사전 처리 <ol><li> 마이크로톰을 사용 FFPE 전립선 암 조직 블록 5 μm의 단면을 절단. </li><l난&gt; 1 시간 동안 56 ° C에서 슬라이드를 배양하여 조직 절편을 수정합니다. 주 : miRNA의 분석을 위해 슬라이드 몇 주 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 15 분마다, (배) 자일 렌으로 슬라이드를 담가 조직을 Deparrafinize. </li><li> 증류수 (5 분) 하였다 등급 에탄올 (100 % (2 배), 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 5 분 동안 각각의 슬라이드를 배양하여 조직을 재수. </li><li> 실온에서 20 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데하이드 슬라이드를 고정한다. </li><li> 각 5 분 동안 실온에서 PBS (2X)로 슬라이드를 세척한다. </li><li> 예열 테 K 버퍼에 10 분 (5 mM 트리스 - HCL 산도 7.4, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 NaCl을) 37 ºC에서 10 μg의 / ㎖ 테 K와 슬라이드를 치료. </li><li> 테-K 처리 후, 30 초 동안 PBS에서 0.2 % 글리신과 슬라이드를 헹군다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 PBS (1X)에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 슬라이드를 수정합니다. </li><li> 와 린스 슬라이드5 분 동안 PBS. </li></ol></li><li> 하이브리드 <ol><li> 가습 실에서 55 ºC에서 3-4 시간 동안 프리 하이브리드 솔루션으로 슬라이드를 사전 하이브리드. 챔버는 가습 유지하기 위해 50 % 포름 아미드 / 50 % 5 배 SSC에 배어 조직 실험실 물티슈를 사용합니다. </li><li> 혼성화 버퍼 20-50 nM의 농도로 5 &#39;제닌 표지 된 프로브를 사용한다. 4 분 90 ºC에서 miRNA의 특정 프로브 (20 ~ 50 ㎚)과 작은 핵 RNA U6 제어 프로브 (20 ㎚), 열을 희석 얼음에 배치, 차가운 하이브리드 버퍼를 얼음 추가 (2-4 NG / μL ). </li><li> 프로브 고유의 하이브리드 온도에서 12 ~ 16 시간 동안 배양, 하이브리드 솔루션 (프로브 + 하이브리드 버퍼, 슬라이드 당 100 μL)를 추가, 사전 하이브리드 솔루션을 제거 (하이브리드 온도 = Tm은 프로브-21 ° C). 가습 실 (50 % 포름 아미드 / 50 % 5 배 SSC)에서 혼성화를 수행합니다. </li></ol></li><li> 세척 단계 <ol><li> 45 ºC에서 10 분 동안 2 배 SSC와 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 워시 T그는 45 ºC에서 10 분 동안 1.5 배의 SSC와 슬라이드. </li><li> 20 분 각 37 ºC에서 0.2 배씩 SSC (2 배)와 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1-2 시간 동안 1X 차단 용액으로 슬라이드 부화 </li></ol></li><li> 검출 <ol><li> 1 슬라이드를 품어 : 100 PBS 1-4 시간 동안 또는 4 박 ºC에서 AP-복합 항 제닌 항체를 희석. </li><li> 10 분 각각 실온에서 PBS (배)와 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 각 5 분 동안 실온에서 알칼리성 포스파타제 완충액 (100 mM 트리스 pH를 9.5의 50 mM의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈 -20)으로 슬라이드 (2 배)를 세척한다. </li><li> 1-20 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 BM 보라색 AP 기판에 슬라이드를 품어. </li><li> PBS는 물에 0.1 %를 트윈-20 및 세척 (2 배)를 포함하여 슬라이드를 씻어. </li><li> 수성 설치 미디어를 사용하여 슬라이드를 장착하고 현미경으로 검사합니다. </li></ol></li></ol>

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이 글에서, 우리는 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암의 임상 조직에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 전립선 암, 몇몇 연구는 전립선 암의 개시, 진행 및 전이에서 마이크로 RNA의 중요한 역할을 시사한다. 그러나, 충돌 결과는 종종 miRNA의 추출 이후 특정 miRNA의 22에 얻은 방법은 크게 다르다 분석된다. 전립선 암의 예후, 진단 및 치료를위한 대안적인 전립선 암과 같은 바이오 마커의 miRNAs의 잠재적 애플리케이션을 지원하는 새로운 기록의 관점에서 정확하게 임상 조직에서의 miRNA 발현 프로파일을 정량 할 필요가있다. miRNA의 전립선 암 임상 검체 분석을 위해 우리는 정량 실시간 PCR 및 현장 하이브리드의 조합을 사용합니다. 이 워크 플로우 내에서, 우리는 miRNA의 추출을 위해 기존의 방법을 최적화, 표현은 DNA 형성 촉매에 의해 분석RT-PCR 및 ISH 기반 남자 프라이...

전립선 암은 남성의 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며 흔히 진단 남성 악성 종양이다. 미국의 경우는 220,800 새로운 사례를 추정하고 27,540 명이 사망 2015 년 1에보고됩니다. 전립선 암은 종양이 나태한 또는 매우 공격적이 될 수 코스 - 매우 다양 질환을 가진 이질적인 질환이다. 전립선 암의 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료 (2) 현재 사용되는 방법 / 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 현재 검사 방법은 전립선 특이 항원 (PSA) 테스트 및 전립선 생검 3이어서 직장 수지 검사 (DRE)을 포함한다. 전립선 특이 항원 (PSA)은 크게 개선 된 임상 관리 생존율 4 혁명에서 가장 널리 사용되는 전립선 암의 표지자이다. 그러나, PSA 포함 락의 본질적인 한계로특이도, PSA 기반 검사의 k는 진단을 통해 질병의 치료를 통해하게되었다. 이러한 관점에서 집중적 인 노력은 대체 전립선 암 바이오 마커에 ​​대한 검색 향해 공격성 질병을 예측하고 더 나은 치료 결정 4,5-를 구동 할 수있는 특히 지시되고있다. 지난 몇 년 동안, 마이크로 RNA (miRNA가)는 유망한 대체 전립선 암 바이오 마커로 등장했다. 마이크로 RNA (miRNA가)는 동족 mRNA의 대상의 3&#39;- 번역되지 않은 지역 (UTRs)와 서열 - 특이 적 상호 작용을 통해 후 전사적으로 유전자 발현을 억제하는 작은 비 코딩 RNA를의 진화 적으로 보존 된 클래스를 구성한다. 그것은의 mRNA의 60 %의 miRNAs 6의 목표를 ​​보존하고 있습니다&gt; 것으로 추정된다. miRNA의 유전자는 유전자 간 지역 또는 인트론 또는 유전자 (7)를 코딩하는 단백질 / 비 단백질의 엑손 내에 위치하고 있습니다. 이 유전자는 우선적으로 주역에 RNA 중합 효소 II에 의해 전사된다공예의 miRNAs (PRI-miRNA가 몇 킬로베이스) 그 형태의 머리 핀의 자형 모양의 줄기 루프 차 구조. 이 PRI-의 miRNAs는 세포질에 수출하고 추가로 8-10 (1,825 염기 길이) 성숙의 miRNAs로 처리되는 전구체의 miRNAs (60-75 염기 긴 사전의 miRNAs)로 처리됩니다. miRNA가 증식, 개발, 분화 및 세포 사멸 (11) 등 주요 세포 과정을 조절한다. 연구는 전립선 암 12 ~ 15 등 다양한 인간의 악성 종양에서의 miRNA 발현 프로파일의 광범위한 조절 곤란을 제안한다. miRNA의 발현 프로파일은 널리 기본 및 전이성 전립선 암에서 이상 조절되는 것으로보고되었다. 변경된 miRNA의 발현의 miRNAs 12,14,16-19의 예후 잠재력을 강조 전립선 암의 진행, 공격성과 재발과 연결되어있다. 증거의 성장 몸은 miRNA가 전립선 암 개시, 개발, 진행에 중요한 기계적인 역할을한다는 것을 나타냅니다이온과 전이. 전반적으로, miRNAs의 전립선 암 (12)의 계층화에 정상 및 암 조직과 원조를 구별 할 수 전립선 암 진단 및 예후 등 유망한 대체 바이오 마커를 부상하고있다. 또한, miRNAs의 전립선 암 (20)에 대한 효과적인 치료제의 개발을위한 중요한 표적이다. 내생의 RNase 활성에 작은 크기와 저항으로 인해, miRNAs의 용이 포르말린 고정 된 조직 (21) 및 전립선 생검 (22)에서 검출 될 수 안정한 바이오 마커이다. 더욱이의 miRNAs의 발현 양상은 고정 냉동과 포르말린 조직에 비해 한 강하게 될 21 개의 상관하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 임상 적 전립선 암 조직에서의 miRNA 발현 프로파일들은 전립선 암 등 심하게 RELI에게 효과적 생체 등의 miRNAs의 개발 종양 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염으로 인해 도전임상 조직에서 자신의 정확한 검출에 말이지. 여기에 우리가 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 우리의 실험실에서 사용되는 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 우리는 정량적 실시간 PCR의 조합을 채용하고 miRNA에 대한 계내 혼성화에 전 수득 더 정량적 정보와 조직의 어레이의 잠재적 miRNA의 바이오 마커의 발현 차이를 시각화 후자, 임상 검체 분석. 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE 및 냉동 전립선 조직에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법을 최적화, 표현은 프로브 (23)를 기반 잠금 핵산 (LNA)를 사용하여 miRNA의 RT-PCR 및 miRNA의 현장 하이브리드 기술에 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. LNA 기반 프로브는 DNA- 또는 RNA- 기초하여 프로브에 비해 증가 된 민감도 및 특이성을 제공하며, 자신의 GC 함량에 관계없이 모두의 miRNA 서열 강력한 검출을 가능하게하고 또한 discrimina 허용miRNA의 가족의 기. 우리의 최적화 된 miRNA ISH 프로토콜 miRNA의 바이오 마커 발견을 촉진시킬 가능성을 제공하고, 후자와, 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>마이크로톰</td><td>라이카 바이오시스템즈&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>또는 Life Technolgies의 Arcutus Xt 시스템을 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure 매크로 LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 고속 Real-time PCR 시스템&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA 역전사 키트&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG 라벨링 LNA 프로브, U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP 기질</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>사전 하이브리드화 솔루션&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 솔루션&nbsp;</td><td>바이오체인</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>차단 솔루션&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP 복합 항 디곡시제닌 항체</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>수성 장착 매체&nbsp;</td><td>벡터 연구소&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리졸(구아니딘 이소티오시아네이트-페놀 시약)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris 헤마톡실린</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>스타트랩</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

전립선 암 임상 조직에서의 mirna 식 분석

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

전립선 암 (PCA) 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료를 위해 현재 사용되는 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 최근, 마이크로 RNA (miRNA에)은 전립선 암의 진단 및 예후에 대한 유망한 대체로서 생체 등장했다. 그러나, 전립선 암에 대한 효과적인 생체 등의 miRNAs의 개발은 주로 임상 조직에서의 정확한 검출에 의존한다. miRNA는 종종 종양의 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염 등의 miRNA가 조합을 사용하여 아카이브 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체의 분석은이 문서의 목적은 단순화 된 워크 플로우를 설명하는 것입니다 때문에 도전 전립선 암 임상 검체에서 분석 정량 실시간 PCR (RT-PCR) 및 현장 하이브리드에서 (ISH). 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법과 냉동 전립선 tissu을 최적화ES 및 표현은 m​​iRNA의 RT-PCR 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. 기반 프로브 - 또, ISH위한 최적화 방식이 고정 된 핵산 (LNA)를 이용하여 전립선 조직에서 formiRNA 검출 분석 기술한다. 우리의 miRNA ISH 최적화 프로토콜은 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.

RT-PCR에 의한 LCM 차 전립선 암 임상 검체 미르-203의 발현 프로파일 분석 (그림 1) RT-PCR은 LCM 차 전립선 암 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 분석 대조군으로 사용 하였다 Saini 외. RNU48 15에 기재된 바와 같이 유사한 인접하는 정상 영역을 행했다. 아래 표는 인접한 정상 조직에 대해 전립선 암 종양 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 요약 한 것이다. RT-PCR에 의한은 miR-383의 발현 비교 레이저 캡처 PCA 조직을 microdissected 대 microdissected에서 분석 (그림 2) 전립선 암 조직은 어느 현미경 microdissected 하였다 또는 RT-PCR 하였다 LCM을 실시 종양 조직에서 발현은 mi...

여기에서는 정량적 실시간 PCR(RT-PCR) 및 ISH(in situ hybridization)를 사용하여 보관된 포르말린 고정, 파라핀 내장(FFPE) 또는 신선 냉동 전립선암(PCa) 임상 조직에서 microRNA(miRNA) 발현 분석을 위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다.

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

이 영상의 전체적인 목표는 잠금 핵산(locked nucleic acid)-기반 프로브를 적용하여, 정량적 실시간 PCR과 NC 두 가지 하이브리다이제이션의 조합을 통해 보관된 전립선암 임상 표본의 마이크로 RNA 분석을 위한 간소화된 워크플로우를 설명하는 것입니다. 이는 먼저 레이저 캡처 미세 절편법(laser capture microdissection)을 사용하여 전립선암 FFPE 절편에서 조직을 분리한 후, 마이크로 RNA 추출을 진행함으로써 이루어집니다. 다음으로, 2단계 R-T-P-C-R을 사용하여 조직 내 마이크로 RNA를 정량화하며, 디고옥시젠(digoxygen) 표지 LNA 프로브와 BM purple로 검출되는 AP 결합 항원 및 항체를 이용한 두 가지 하이브리다이제이션 분석을 통해 마이크로 RNA의 위치를 확인합니다.제시된 결과는 전립선암 임상 조직에서의 마이크로 RNA 발현을 보여줍니다. 이러한 기술들을 활용하여 최근 마이크로RNA는 전립선암의 유망한 대체 질환 바이오마커로 부상했습니다. 하지만 전립선 종양의 이질성과 기질 오염과 같은 혼란 변수로 인해, 전립선암 임상 검체의 마이크로RNA 발현 분석은 종종 어려움을 겪습니다.저희는 지난 10년 동안 마이크로RNA 및 비코딩 RNA 분야 연구를 수행해 왔습니다. 저희는 전립선암의 다양한 단계에서 마이크로RNA 발현을 위한 조건을 최적화했습니다. 마이크로RNA 발현은 전립선암의 임상 결과와 상관관계가 있으므로, 이를 진단 및 예후 바이오마커로 사용할 수 있을 것이라고 생각합니다.우리는 또한 나노입자 기술을 이용하여 microRNA가 전립선암 치료에 사용될 수 있다고 믿습니다. 전립선암에서의 정확한 발현 프로파일링은 병변의 이질성으로 인해 종종 방해를 받습니다. 이는 레이저 캡처 미세 절단술(LCM)을 사용하여 순수한 양성 또는 악성 상피 세포를 수집하고 기질 세포와의 혼합을 줄임으로써 부분적으로 극복할 수 있습니다.보관된 FFP 조직의 LCM 이후 microRNA 발현 프로파일링을 수행한 결과, C-두 하이브리다이제이션에서 최적화된 보완 기술로서 민감하고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적인 것으로 나타났으며, 이는 microRNA가 발현되는 위치를 보여줍니다. 조직을 수집하여 10 micron 두께의 절편으로 제작한 후, 흄 후드 내에서 파라핀을 제거하고 자일렌에 10분 동안 두 번 담급니다. 그 다음, 점진적인 수성 알코올 배스로 조직을 옮겨 재수화합니다. 다음으로, 헤마톡실린 염색을 30초 동안 수행하고 슬라이드를 물로 헹굽니다.재수화된 조직을 70%부터 시작하는 또 다른 단계별 알코올 시리즈로 옮깁니다. 그다음 절편을 자일렌에 5분 동안 담근 후 공기 중에서 건조시킵니다. 건조된 슬라이드를 레이저 캡처 미세해부 장치로 옮깁니다. 병리 의사가 표시한 슬라이드를 사용하여 전립선암 병소와 양성 또는 정상 부위를 식별합니다.레이저 캡처 미세해부(laser capture microdissection) 수행 시 제조사의 가이드라인을 따르십시오. 빔 폭은 10~20 microns로 설정하고 70~90 milliwatts로 펄스를 가합니다. 적외선 펄스를 사용하여 관심 영역을 레이저 캡처 미세해부 캡에 포집하십시오.각 샘플에 대해, 캡의 내용물을 수집 튜브에 넣고 즉시 세포를 처리하여 micro RNA를 추출하십시오. 제조사의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하십시오. RNA를 20~30 µL의 nuclease free water로 용출시킨 후 신속하게 진행하십시오.다음으로, 마이크로 RNA 특이적 프라이머를 사용하여 역전사 효소 반응 키트로 cDNA를 합성합니다. 각 반응당 10 ~ 100 ng의 총 RNA를 사용하여 반응을 준비합니다. 수집된 cDNA는 5 ~ 10배로 희석하여 약 1 ~ 20 ng의 농도가 되도록 합니다.이제 대조군으로 fast universal master mix를 사용하여 CD NA의 micro RNA 분석을 위한 PCR 반응을 설정하고 3회 반복 실험을 수행합니다. 유전자 발현의 상대적 변화를 계산하기 위해 RNU 48을 템플릿으로 사용하십시오. 비교 CT 방법을 사용하여 5 µm 두께의 조직 절편을 전처리하기 시작하십시오.슬라이드를 56°C에서 1시간 동안 고정합니다. 그 후, 상온으로 설정된 자일렌 용액에 15분씩 두 번 담가 탈파라핀화하고, 단계별 에탄올 시리즈를 통해 조직을 재수화합니다. 그런 다음 조직을 물에 5분 동안 담급니다.다음으로, 실온에서 4% PFA가 포함된 PBS로 조직을 20분 동안 고정합니다. PBS로 5분씩 두 번 세척하여 고정액을 제거합니다. 이제 미리 데워둔 proteinase K 버퍼에 proteinase K를 10 µg/mL 농도로 첨가하고, 조직을 37°C에서 10분 동안 배양합니다.처리를 마친 후, 슬라이드를 0.2% glycine/PBS로 30초 동안 헹구고 상온의 PBS에서 5분 동안 세척합니다. 그 다음 4% PFA에 15분 동안 다시 담급니다. 다시 한번 5분 간격으로 PBS로 두 번 세척하여 고정액을 제거합니다.이제 조직을 하이브리드화할 준비가 되었습니다. 먼저, 이후 단계의 용액이 조직 절편 위에 유지되도록 패스 펜을 사용하여 조직 주변에 소수성 원을 그립니다. 조직을 55 °C에서 3~4시간 동안 전-하이브리드화 완충액에 배양합니다.50% formamide와 50% 5X SSC 용액에 적신 수건으로 가습된 챔버 내에서 이 작업을 수행하십시오. 이제 digen 및 표지된 micro RNA 특이적 프로브와 대조군 프로브를 준비합니다. 20~50 nM 희석액을 만드는 것을 계획하되, 우선 최종 희석에 필요한 양보다 25 µL 적은 양의 하이브리다이제이션 버퍼로 프로브를 희석하십시오. 다음으로, 프로브를 90 °C에서 약 4분 동안 가열하십시오.그런 다음 프로브를 얼음 위에 둡니다. 마지막으로, 얼음처럼 차가운 하이브리다이제이션 버퍼를 사용하여 프로브를 최종 농도인 20에서 50 nanomolar가 되도록 추가로 희석합니다. 이제 각 슬라이드에 100에서 400 microliters의 프로브 용액을 도포합니다.그 후 적절한 하이브리다이제이션 온도에서 12~16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세척 단계에 따라 SSC 용액으로 여러 차례 세척을 수행합니다. 블로킹 후에는 슬라이드를 블로킹 용액에 넣고 상온에서 1~2시간 동안 배양합니다.조직을 PBS 내의 1:100 AP 접합 항원닌(antigenin)에 담급니다. 실온에서 1~4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 그 후, PBS로 10분씩 3회 세척하여 과량의 항체를 제거합니다.실온에서 PBS 버퍼로 5분씩 두 번 세척합니다. 그 다음, 슬라이드를 BM purple, AP substrate에 담가 실온의 암소에서 1시간에서 20시간 동안 반응시킵니다. 다음 날, 0.1% Tween 20/PBS로 헹구어 BM purple을 제거합니다.그 후 물로 2회 세척하고, microRNA 추출 및 R-T-P-C-R의 기재된 프로토콜을 사용하여 수성 봉입제로 봉입합니다. 전립선암 조직과 인접 정상 조직에서 microRNA 2 0 3을 분석하였습니다. 상대적 발현량은 상당수의 조직에서 다양하게 나타났습니다.RNU 48을 대조군으로 사용하였다. 전립선암 조직을 현미경 하에서 미세 절제하거나 LCM을 수행한 후, microRNA 3 83의 상대적 발현량을 분석하였다. 종양 조직에서의 발현량을 매칭된 정상 대조군과 비교하였다.LCM으로 준비된 조직에서 micro RNA 발현이 더 안정적으로 검출되었습니다. C에서는 정상 조직과 뼈 전이성 전립선암 조직을 대상으로 microRNA 2 0 3의 이중 hybridization을 수행하였습니다. U six's.염색 강도를 바탕으로 RNA 검출을 대조군으로 사용하였습니다. 각 조직의 세포에서 microRNA 2 0 3 발현 정도를 1점에서 4점까지 점수화하였습니다. 그 결과, 골 전이 조직에서 발현 수치가 통계적으로 더 낮게 나타났습니다.이 영상을 시청한 후, 전 과정에 걸쳐 전립선암 임상 검체에서 microRNA 발현을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 전체 워크플로우 동안 RNA가 없는 환경을 유지하는 것이 무엇보다 중요합니다. 또한 파라포름알데히드와 염화물을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 흄 후드 내에서 작업하고 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.이 절차 이후, 미세 발현 패턴이 질병의 임상 병리학적 변수와 상관관계가 있는지 평가하기 위해 통계 분석을 수행하며, 이는 특정 micro RNA의 발현이 예후 또는 진단 가능성과 관련이 있는지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 최적화된 C two 하이브리다이제이션 microRNA 프로토콜은 전립선암 조직 슬라이드 또는 전립선암 조직 마이크로어레이에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최적화를 통해 다른 조직 유형에도 적용 가능합니다.

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

양적 실시간 중합 효소 사슬 반응 (qPCR)는 종양 샘플에서 여러 microRNA의 표현 수준 (miRNA) 분자를 조사하기 위해 신속하고 민감한 방법입니다. 다른 miRNA 분자의 수백이 메서드 표현식을 사용하면, 증폭 계량, 같은 cDNA 템플릿에서 분석할 수 있습니다.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

에스트로겐과 마이크로 RNA 모두를 통해 신호 분자는 유방암의 발전과 성장에 중요하다. 에스트로겐은 전사 인자이다 에스트로겐 수용체를 활성화합니다. 많은 전사 인자는 마이크로 RNA의 발현을 조절할 수 있으며, 에스트로겐 조절 마이크로 RNA는 다른 대규모 기법을 사용하여 프로파일 링 할 수있다.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

여기에서는 miRNA in situ hybridization을 사용하여 유방암 환자 샘플에서 miRNA 발현을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

miRNA의를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현의 임상 병리학 적 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

이 수정 추출 프로토콜은 조직 병리학 적 조직 블록에 대한 관심이 더 정확하게 대상 지역의 RNA 및 DNA 수율을 향상시킨다.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 이 원고 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 하 여 유방암을 분류 하는 마커의 패널의 최적화를 설명 합니다.

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

배우세요 전립선암 임상 조직에서 miRNA 식 분석을 위한 간소화된 워크플로우입니다. 레이저 포획 현미절단, 정량적 실시간 PCR, 원위 하이브리드화 기법을 활용하여 miRNA 발현을 정량화하고 위치를 특정합니다.

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

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