인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

이 절차의 전반적인 목표는 내이의 정원창 니치(round window niche)에 이독성 약물을 전략적으로 직접 투여하여 마우스 와우 손상 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 피하 지방층을 절개하고 근육 조직을 조심스럽게 젖혀 고실포 골막을 노출시킵니다. 두 번째 단계는 정원창 니치가 드러날 때까지 골 파편을 점진적으로 제거하여 고실포의 덮개를 여는 것입니다.

다음으로, 중이와 정원창 니치의 가시적인 액체를 완전히 건조시켜 정원창 니치를 최적으로 시각화할 수 있게 합니다. 마지막 단계는 STA 경동맥을 손상시키지 않으면서 정원창 니치에 선택한 이독성 약물을 채우는 것이며, 이후 약물의 사양에 따라 적절히 반복합니다. 최종적으로, 청성 뇌간 반응 및 형태학적 평가를 포함한 기능적 절차를 통해 와우 미세 구조의 선택적 보존 또는 퇴행을 입증합니다.

기존 측정 방식인 이 기술의 주요 장점은, 이 절차를 통해 원형창 니치(round window niche)를 탁월하게 노출시켜 선택적 자가 독성 노화(auto Toxic aging)를 직접적으로 적용할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 장점으로는 내이의 미세 구조 보존, 전신 독성 회피, 빠른 효과 발현, 특정 와우 세포 유형의 선택적 퇴행 및 재현 가능한 결과 등이 있습니다. 이 기술은 약간의 수정을 거쳐 랫드, 기니피그, 저빌을 포함한 다른 설치류 종에도 적용될 수 있습니다.

이제 제 실험실에서 해당 절차를 시연하겠습니다. 동물 연구의 모든 측면은 해당 기관의 동물 실험 윤리 위원회 가이드라인에 따라 수행되었습니다. 여기서 설명하는 모든 척추 실험 절차는 사우스캐롤라이나 의과대학(Medical University of South Carolina)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and use Committee)의 가이드라인에 따라 승인되었습니다.

승인된 절차에 따라 동물에게 마취를 실시한 후, 수술 전 진통제 0.1 mg/kg을 투여합니다. 여기서는 Buprenorphine이 사용되었습니다. 동물이 수술 가능한 마취 수준에 도달했는지 확인하십시오.

여기에 보이는 것처럼, 발가락 꼬집기에 반응이 없어야 하며 생쥐의 쓰기 반사가 나타나지 않아야 합니다. 선택한 이독성 약물이 포함된 수용액 0.2 milliliters를 28 gauge 0.5인치 뭉툭한 바늘이 장착된 1 milliliter 투베르쿨린 주사기에 미리 채우고, 주사기 내부의 공기를 모두 제거하십시오. 기포가 생기면 약물이 제대로 투여되지 않을 수 있습니다. 전기 이발기를 사용하여 무두강 주름부터 견갑대까지 이어지는 부위의 털을 조심스럽게 제거하십시오.

제모 범위를 등쪽 정중선에서 하악각까지 가쪽으로 넓힙니다. 일회용 면도기를 사용하여 깔끔하게 면도되었는지 확인합니다. 기관 프로토콜에 따라 준비된 부위의 피부를 멸균합니다.

여기서는 Betadine과 에탄올을 교대로 사용하여 2분 동안 원을 그리며 국소적으로 도포합니다. 동물의 체온을 유지하기 위해 신체 아래에 소형 가열 패드를 배치합니다. 36~38 °C에서 헤드 홀더 장치를 통해 동물의 머리를 고정합니다.

동물의 코등 부분에 작은 클램프를 부드럽게 조여 고정합니다. 헤드 홀더가 U자형 관절 암의 중앙에 단단히 연결되었는지 확인합니다. 오른쪽 접근이 가능하도록 U자형 암의 왼쪽에 1cm 너비의 막대를 고정하여 왼쪽 머리 받침대로 사용합니다.

헤드 홀더에 단단히 고정한 후, 마우스를 왼쪽 측와위 상태로 회전시킵니다. 시술 내내 안정성을 유지하고 경추에 과도한 비틀림 응력이 가해지는 것을 방지하기 위해, 평평한 수술 표면에 몸체를 조심스럽게 배치하십시오. 10배 및 20배 배율 조절이 가능한 수술용 현미경을 수술 부위 위에 배치합니다.

현미경 배율 하에서 작업하는 동안 양손을 수술에 사용할 수 있도록, 현미경이 손을 대지 않고도 위치를 유지할 수 있는지 확인하십시오. 날카로운 가위나 메스 날을 사용하여 이개 전주름(auricular cephalic crease)에서 약 6~8mm 떨어진 곳에 1~1.5cm 길이의 귀 뒤 절개(postauricular incision)를 만듭니다. 하부의 혈관 구조를 보존하기 위해 너무 깊게 절개하지 않도록 주의하십시오.

피하 지방층을 둔성 박리합니다. 복측에서 내측 방향으로 박리할 때는 외경정맥이 손상되지 않도록 주의하십시오. 출혈이 발생하면 흡수성 젤라틴, 스펀지 또는 면 펠릿을 사용하여 혈류를 차단하십시오.

지방층이 적절히 분리되면 경부 근육층을 노출시킵니다. 중요한 지표는 유양돌기 후연을 감싸고 있는 제11 뇌신경의 작은 신경 분지입니다. 귓바퀴 방향으로 시야를 확장하려면 자가 유지 견인기를 사용하여 유양돌기 근육체를 후방으로 부드럽게 견인하십시오.

근육체를 감싸고 있는 투명한 근막을 조심스럽게 분리합니다. 또한 귀밑샘과 외경정맥을 반대 방향으로 조심스럽게 견인합니다. CTO 유돌근 근육체를 충분히 견인하면, 더 깊은 경부 근육이 부착되는 부위인 tympanic bulla 골막의 빛나는 돔 모양 구조가 bulla의 가쪽 면에서 보입니다.

흉쇄유돌근 유양돌기염 부위가 보일 것입니다. 양손 기법을 사용하여 CTO 유양돌기를 벌릴 수 있도록 자가 유지 견인기를 배치하고, 양극성 소작기를 조심스럽게 사용하여 골막을 절개하고 하부의 뼈를 노출시킵니다. 그다음 포셉이나 이비인후과용 큐렛을 사용하여 골막을 조심스럽게 들어 올려 주변 방향으로 밀어내어 유양돌기 돔 부위를 완전히 노출시킵니다.

이제 1 또는 2mm의 테이퍼 팁이 장착된 벨트 구동식 치과용 핸드 드릴을 사용하여 외鼓室(bulla) 뼈에 2mm의 가이드 홀을 조심스럽게 뚫습니다. 돔의 외측 가장자리와 외鼓室의吻측(rostral) 면을 가로지르는 가시적인 불투명 선 사이를 뚫습니다. 다음으로, 근처에 두 번째 가이드 홀을 조심스럽게 뚫습니다. 주얼러 팁 포셉(jewelers tip forceps)을 사용하여 외鼓室 뼈의 지붕을 제거하기 쉽도록, 외鼓室 뼈를 등쪽 및 외측 방향으로 캡을 벗기듯 제거합니다.

불독 캡(bullock cap) 바로 아래에 위치한 EDL 동맥을 천자하지 않도록 주의하십시오. 약제를 도포하기 전, 중이로 과도한 액체가 유입되는 것을 방지하기 위해 제거하는 뼈의 양을 최소화하십시오. 종이 심지를 사용하여 건조한 뼈가 보일 때까지 중이와 정원창 틈새(round window niche)에 보이는 모든 액체를 제거하십시오.

이 단계는 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 최대 배율로 해당 부위를 관찰하면서, 1mL 투베르쿨린 주사기에 장착된 미세 구경 바늘을 사용하여 이독성 약물 한 방울을 정원창 틈새(round window niche)에 직접 도포하여 완전히 채웁니다. 약물이 정원창 틈새에 10분 동안 머물도록 둡니다.

초기 단계에서는 건조 니치(dry niche) 바닥의 작은 빛 반사가 흐릿하고 뿌연 액체 메니스커스(meniscus)로 바뀌는지 면밀히 관찰하십시오. 이는 니치가 적절하게 채워지고 있음을 나타냅니다. 10분이 완전히 경과하면 시약을 완전히 닦아내고 동일한 시약을 새로 도포하십시오.

도포 횟수는 사용하는 약제에 따라 다릅니다. 노출 시간은 일반적으로 30분에서 60분 사이입니다. 마지막 도포 후, 불(bull)을 덮지 않은 상태로 두고 포셉을 사용하여 수술 부위의 연조직을 닫아줍니다.

수술 부위의 피부를 봉합하기 위해 4-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용하십시오. 동물은 베딩과 부드러운 먹이가 갖춰진 깨끗한 홈 케이지에서 마취로부터 회복되도록 합니다. 희생 및 성체 C-B-A-C-A-J의 와우 조직 채취 시까지 매일 동물을 모니터링하십시오.

양성의 암수 마우스 모두에게 이독성 약물인 Hept 에탄올을 투여하였습니다. 원창을 통한 확산이 이루어졌습니다. Hept를 처리한 마우스에서는 수술 후 1일부터 14일까지 BR 역치(thresholds)의 유의미한 증가가 관찰되었으며, 이는 Hept 대신 식염수를 투여하여 가짜 수술(sham surgery)을 받은 대조군 동물과 대비되는 결과였습니다.

에탄올은 테스트한 어떤 주파수에서도 유의미한 역치 이동을 보이지 않았습니다. 녹색으로 표시된 내향 정류 칼륨 채널에 대한 면역 염색은 와우 구조의 손상 및 회복을 시각화하기 위한 간접적인 방법으로 사용되었습니다. 염색 강도는 theria vais 내에서 현저하게 감소했습니다.

수술 후 1일 차에, 세포 사멸의 전형적인 특징인 핵 무결성 파괴 및 염색체 응축의 증거가 적색으로 표시된 핵 대조 염색에서 관찰되었습니다. 스트라티스(stratis) 처리된 귀 영역에서 칼륨 채널 염색 강도를 정량화했을 때, hep 노출 7일 후 초기 저점을 찍은 뒤 대조군 강도로 유의미하게 되돌아오는 변화가 나타났으며, 이후로도 회복이 계속되었습니다. 숙달되면, 이 절차는 적절히 수행될 경우 30분에서 60분 이내에 완료할 수 있습니다.

추가 노출 또는 보충을 통해 혈액 응고나 간질액으로 인해 자가 독성 제제가 원치 않게 희석되는 것을 방지하는 것이 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 하지만 이 방법은 실수로 와우동맥을 손상시키거나 정원창 틈새(round window niche)에 간질액이 유입될 위험을 높일 수 있으므로 주의해서 사용해야 합니다. 이 최소 침습적 기술은 섬세한 생화학적 과정에 대한 상세한 연구를 가능하게 하며, 생체 내(in vivo) 와우 재생 잠재력을 이해하기 위한 당사의 연구를 진전시키는 데 결정적인 역할을 해왔습니다.