TCR-pMHC 바인딩 측정 현장에서 FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

이 비디오에서는 T 세포와 평면 지지 지질 블레이 사이의 면역학적 시냅스 내에 있는 C 2에서 T 세포 항원 수용체와 펩타이드가 로드된 주요 조직 적합성 복합체 또는 PMHC 사이의 역학을 측정하는 방법을 보여줍니다. 단백질 생산의 중요한 측면과 칼슘 플럭스 측정을 통해 지질 블레이의 기능적 무결성을 검증하는 방법을 간략하게 안내해 드리겠습니다. 지질 블레이(lipid blay)를 준비하는 방법 및 단일 분자 형광 현미경을 설정하는 방법에 대한 자세한 내용은 Journal of Visualized Experiments(시각화 실험 저널)에서 버그 및 단일 분자 수준에서 먼저 또는 공명 에너지 전달 측정을 수행하고 분석하는 방법을 자세히 설명합니다.

우리의 전반적인 접근 방식에 사용된 프렛 기반 전략을 설명하기 위해 시냅스 T 세포 수용체 PMHC 결합의 동역학을 추론하기 위해, 우리는 T 세포 수용체 또는 TCR의 결정 구조부터 시작하여 항원과 결합할 때 파란색, 펩타이드 적재 MHC 분자 또는 PMHC는 노란색과 빨간색으로 표시됩니다. 우리는 또한 age 57이라고 불리는 T 세포 수용체 베타 반응성 항체에서 다양한 도메인의 단일 사슬 단편을 소개합니다. 정량적 fre 기반 측정의 경우, fre donor(우리의 경우 single chain fragment)와 fre receptor(PMHC)를 모두 부위별 방식으로 라벨링해야 합니다.

이것은 unaired cysteine의 도입을 통해 재조합 단백질에 대해 실현 가능하며, 이는 진드기 공액 Fluor force에 공유 결합될 수 있습니다. 그림과 같이 공급된 donor Alexa Fluor 5 5 5 또는 side three를 단일 사슬 단편과 fret 수용체에 부착합니다. Alexa 흐름 6, 4, 7 또는 SI 5는 MHC 결합 펩타이드의 C 말단으로 이동합니다.

이 복합 구조에서 볼 수 있듯이 Indy 거리는 약 41 angstrum이며, 두 염료 사이의 절반 최대 에너지 전달 거리인 첫 번째 반경보다 훨씬 작습니다. 우리의 실험에서는 평면 유리로 지지되는 지질 bilar를 대리 항원 제시 세포로 사용합니다. 이들은 PMXC, atory 분자 B 7 one 및 접착 분자 I chem 1로 기능화됩니다.

이러한 방식으로 전반사 형광 모드에서 이미징을 수행할 수 있으며, 이는 계면에 매우 근접한 형광력을 조명하여 세포 배경을 크게 줄입니다. Fret는 단일 사슬 단편으로 표지된 TCR이 layer가 embedded PM hcs에 의해 결합되는 경우에만 검출할 수 있습니다. 이를 통해 T-C-R-P-M-H-C 결합을 시각화 한 다음 C에서 두 개의 적절하게 접힌 히스토 유전자 Tact의 결합 역학을 계산할

P 7 1 및 I chem one의 세포 외 부분은 해당 BUC 바이러스에 감염된 곤충 세포 배양의 상등액으로부터 정제됩니다. 정제는 니켈 안티 아로스 친화성 크로마토그래피로 시작하여 철 교환 및 크기 배제 크로마토그래피의 세 단계로 수행됩니다. Histo 꼬리표 MHC 종류 2 이종이량체는 포함 몸으로 대장균에서 표현되고 레독스 완충액에 있는 급속한 희석을 통해 공간 홀더 펩티드의 존재 및 4 섭씨 온도에 시험관내에서 refolded

스페이스 홀더 펩타이드는 나중에 자외선 노출을 통해 절단됩니다. 적절하게 접힌 PMHC 복합체는 공간 홀더를 정제하고 농축 한 다음 농축되었습니다. 펩티드는 절단되어 pH 5.2에서 형광 펩타이드로 치환됩니다.

최종 제품은 정제 된 스탠드 크기입니다. 단일 사슬 단편은 unaired cysteine으로 발현되며, 대장균의 봉입체는 단계적 투석 및 크기 정제를 통해 in vitro에서 다시 접힙니다. 그런 다음 미사용 시스테인을 통해 메이드 복합 염료와 크기 정제로 표지됩니다. 다시.

모든 재조합 단백질은 최종적으로 밀리리터당 1밀리그램 단백질로 농축된 50%글리세롤을 함유한 PBS에 대해 투석되고 영하 20도에서 장기간 시작됩니다. 지질 블레이의 자극 효능을 확인하기 위한 수단으로 T 세포의 세포 내 칼슘 수치를 측정하기 위해 URA 2 염료의 비율 메트릭을 사용합니다. URA 2:00 AM 에스테르로 T 세포 블라스트를 로드합니다.

이 화합물은 AM moty를 통해 세포에 들어가지만, AM 부분을 절단하는 에스테라제의 작용을 통해 내부에 갇히게 됩니다. 리터당 5 미크론 MO의 최종 농도로 약 300 만 개의 T 세포에 fira 2:00 AM을 추가합니다. 24웰 플레이트의 세포를 새 튜브로 옮기고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

칼슘과 마그네슘을 포함한 행크스 완충 식염수와 1%의 알부민이 포함된 이미징 버퍼에서 세포를 한 번 세척합니다. 세포 내 칼슘을 모니터링하려면 자동화된 UV 지원 도립 현미경 시스템을 사용하십시오. 타이밍 프로토콜을 시작하고 현미경 스테이지에 초점을 맞춘 기능화된 지질 이중층에 더 적은 수의 2개의 로드된 T 세포를 추가하고, 340 및 380 나노미터 자외선으로 여기된 DIC 이미지와 2개의 형광 이미지를 일정한 시간 간격으로 획득합니다.

이중층 접촉을 한 직후, T 세포는 실행 시작 15분 후에 URA 2 비율로 판독하는 대로 상승된 칼슘 수치를 채택합니다. 모든 PMHC 항원을 포화시키는 차단 항체를 세포에 추가합니다. 그 결과, 세포 내 칼슘 수치는 활성화되지 않은 상태의 수치로 떨어지며, 이는 나중에 참고 자료로 사용됩니다.

차단 항체 존재 수준이 무서워 측정을 위해 1로 정규화하는 비활성화되지 않은 상태를 반영하는 값으로 감소하자마자 T 세포는 각 실험에 대해 TCR 반응성 단일 사슬 단편 프렛 프로브로 염색하고, 약 100 만 개의 세포를 튜브로 옮기고, 400 G에서 스핀 다운해야합니다. 배지를 디캔트하고 나머지 배지 방울을 배출합니다. 내벽은 종이 타월로 붙입니다. 이것은 앞서 언급 한 약 30 마이크로 리터의 최소 배양 부피를 보장합니다.

프렛 프로페는 섭씨 영하 20도에서 밀리리터당 1밀리그램과 50%글리세롤의 농도로 보관됩니다. 그것은 알렉사, 5, 5, 5, 또한 3 중 하나의 디토 단백질 비율로 특히 표지 된 사이트입니다 세포에 대한 프로브의 0.3 마이크로 리터에서 1의 디토 단백질 비율. 펠릿을 조심스럽게 여러 번 튕기고 얼음 위에서 20분 동안 세포를 배양합니다.

얼음처럼 차가운 이미징 버퍼에서 세포를 세척합니다. 이 세탁 절차를 한 번 반복하십시오. 저온에서 배양, 원심분리 보관은 T 세포가 형광 프로브에 노출되는 동안 내부화하지 않도록 합니다.

이로 인해 배경 형광이 상승합니다. 또한, T cell은 bilar 함유 챔버를 microscope stage exchange에 배치하기 전에 세척 및 보관 중에 추위에서 프로브를 잃지 않습니다. 이미징 버퍼와 함께 PBS는 이중층을 파괴할 수 있으므로 어떤 대가를 치르더라도 이중층이 공기에 노출되는 것을 피합니다.

세포 배경을 줄이기 위해 잔디 조명을 사용합니다. 이를 위해 excitation beam을 내부 전반사가 발생하는 임계각으로 배치합니다. excitation을 끄고 광광을 켠 다음 T-cell을 ltec 챔버에 추가하고 지질 블레이에 정착되도록 합니다.

여기를 켜고 잔디가 아닌 조명에 초점을 맞춥니다. 세포막은 잔디의 모든 초점면에서 광축을 따라 고리로 관찰되며, 이중층과 접촉하는 기저막만 관찰할 수 있습니다. 위의 초점면은 더 이상 여기되지 않으므로 보이지 않습니다.

타이밍 프로토콜은 PMHC 및 TCR 이미징을 위한 적색 및 녹색 여기 파일부터 시작하여 P-M-H-C-F 수용체를 제거하기 위한 적색 표백제 펄스로 이어집니다. F 지방 수용체 표백 후 TCR을 이미지화하기 위한 녹색 펄스와 F 수용체 절제 실험을 검증하기 위한 빨간색 펄스는 첫 번째 녹색 펄스와 두 번째 녹색 펄스 사이의 가능한 가장 짧은 지연으로 초 미만의 시간 척도로 수행됩니다. 선택적으로, DIC 이미지는 시작 부분에서 얻을 수 있으며, 두 가지 컬러 이미지 분할을 통해 공급된 공여체 및 공급된 수용체 채널을 동시에 감지할 수 있습니다.

유인 수용체 여기(fed accepter excitation)는 T 세포 시냅스에 P HCS가 축적된 것을 보여줍니다. 이 프리블 이미지는 pmcs의 존재를 확인하고 이미 TCR 매개 PMHC 결합을 나타냅니다. 흥미로운. 먹인 공여자는 두 채널 모두에서 이미지를 발생시킵니다.

공급된 공여체 채널의 신호는 F 수용 채널로의 에너지 전달로 인해 강도가 어느 정도 감소합니다. 프렛 허용 채널의 신호는 공급된 공여체의 초조함 블리드와 초조함 수용체의 교차 여기로 구성됩니다. 어쨌든 이 이미지는 분석에 사용되지 않습니다.

현재 프로토콜에서. 빠른 표백제 더미가 뒤따르고 모든 F 허용 불소 힘을 제거합니다. fret 허용 가능한 표백 후 F Fed donor 이미지의 강도는 이제 fre 채널로의 강도 손실 없이 더 높은 수준으로 복구됩니다.

다음 프렛 수용체 기대는 완전한 F 지방 수용체 표백을 확인합니다. 사료를 공급받은 기증자 회수를 정량화하기 위해 시냅스를 확대해 보겠습니다. 평균 배경 강도를 fre acceptor에 관계없이 일정하게 결정합니다.

그런 다음 광표백은 시냅스의 평균 강도와 대표적인 TCR 클러스터의 평균 강도를 결정합니다. 그런 다음 f acceptor 절제 전과 후의 차이를 정규화하여 fret 수율을 계산합니다. 이 예에서는 전체 시냅스에 대해 16%프렛을 측정하고 대표자에 대해 26%프렛을 측정합니다.

TCR 클러스터 프렛 수율은 나중에 TCR 점유로 변환되어 2차원 시냅스 해리 상수 단일 분자 데이터를 생성합니다. 단일 분자 F 위협 실험을 위한 시냅스 TCR 펩타이드 MHC 결합의 동역학을 추론하기 위해 당사에 서비스를 제공합니다. 우리는 이전과 동일한 시약과 노동 전략을 사용합니다.

그러나 단일 TCR과 단일 펩타이드 MHC 간의 상호 작용을 실제로 관찰하기 위해 다음 기준을 충족하기로 결정했습니다. 단일 분자 fre에 대한 후보 이벤트는 단일 fre 수용체 또는 fre 공여체 분자와 구어체로 이루어져야 합니다. 여기서 우리는 관찰된 fre 이벤트의 단일 분자 특성을 검증하기 위해 단일 PMHC를 fre 수용체 분자로 사용하지만 그 반대의 합리성을 확인합니다.

더 높은 버튼에 공급된 수용체를 사용하고 Fred 기증자 및 낮은 버튼에 사용하는 것은 확실히 옵션입니다. 우리는 일반적으로 514 및 647 나노미터 여기, 1밀리초의 최소 시간 지연으로 광 순차 및 반복 공여자 및 수용체 여기와 접촉하는 T 세포를 노출시킨 후 지연 시간을 갖습니다. 이는 실험의 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.

여기 후 밀리초 이내에 단일 다이 감지를 위한 충분히 강력한 형광 신호를 얻으려면 제곱센티미터당 1kW에서 5kW 사이의 높은 여기 전력 밀도를 적용해야 합니다. 광표백으로 인해 가시적인 PMHC 프렛 수용체 분자의 수는 평방 미크론당 30개 이상의 라벨링된 PMCS를 포함하는 이중층에서 단일 프렛 수용체 형광력을 구별할 수 있는 수준으로 빠르게 떨어집니다. 다음은 42밀리초의 전체 시간 지연에 대한 예입니다.

빨간색 원으로 표시된 단일 프렛 이벤트는 두 번째 및 세 번째 시점에서 볼 수 있습니다. 그것은 녹색 원으로 표시된 단일 S 5 분자와 함께 공동 국소화합니다. 이 예에서 관찰 가능한 프렛 이벤트의 트레이스 길이는 2이며, 약 128개의 트레이스에서 표에 표시된 것처럼 더 많은 단일 분자 프렛 트레이스를 수집합니다.

다음으로, 녹색 숫자로 표시된 대로 트레이스의 상보 누적 합을 계산하고 표시된 대로 정규화하여 정규화된 값을 플롯하고 모노 지수 함수로 맞춥니다. 기대값은 1.5 타임프레임보다 약간 더 큽니다. 이 값은 TCR 펩타이드, MHC 결합 및 광표백에 따라 달라지며, 따라서 기대값은 적어도 세 가지 다른 시간에 대해 계산되어야 합니다.

지연은 이제 각각의 시간 지연에 대해 모든 기대값을 플롯하고 여기에 수명을 포함하는 표시된 함수에 데이터 포인트를 맞춥니다. 2.12초 및 PHOTOBLEACHING f Fred에 대한 기대값. F Fred 허용 가능한 표백 후 기증자 회복은 여기 및 이전에 자세히 설명된 바와 같이 면역학적 시냅스 내에서 효과적인 2차원 해리 상수를 몇 단계만으로 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에서는 T-C-R-P-M-H-C 결합이 가장 두드러지는 TCR 참여 및 TCR 클러스터에 대한 분석에 중점을 둡니다. 표시된 측정에서 알 수 있듯이 F FRED 수율은 크게 다릅니다. 개별 TCR 클러스터의 경우.

F fred 수율에 비례 계수 C를 곱하면 TCR 점유율이 발생하며, PMHC 결합 TCR의 수와 총 수 C 간의 비율을 설명하는 항은 특정 fre 쌍 집합과 사용된 FRE 시스템에 대해 한 번 결정해야 합니다. 이 프레젠테이션의 끝 부분에서는 예를 들어 TCR R 반응성 단일 사슬 항체 단편과 MHC 결합 펩타이드의 C 말단에 특별히 설정된 SI 3 및 SI 5를 포함하는 C를 결정하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이는 약 2개의 시냅스에 해당하며, 2차원 해리 상수는 A라고 하는 TCR 점유와 지질 블레이에 존재하는 pmcs의 초기 밀도로부터 계산할 수 있습니다.

표시된 관계는 질량 행동의 법칙에서 파생되었으며 이 영화와 함께 제공되는 기사에 더 자세히 설명되어 있습니다. 이 예에서 pmcs의 초기 밀도는 제곱 미크론당 30 분자에 달합니다. 우리는 2D kds의 분포에 도달하는데, 이는 제곱 미크론당 약 34개의 분자 중앙값을 가진 T 세포 시냅스에서 효과적입니다.

온율 분포는 시냅스 2D KD 분포와 이에 해당하는 오프 레이트(초당 0.41)에서 섭씨 24도에서 단일 분자 프렛 트레이스 분석을 통해 결정된 값으로 계산할 수 있습니다. 중앙값은 분자당 약 0.01제곱미크론(초)입니다. 요약하면, TCR과 펩타이드 MHC 사이의 F 위협 측정은 C 2의 반응 역학을 설명하는 모든 운동 매개변수에 대한 포괄적인 분석을 가능하게 합니다.

이 방법론은 원칙적으로 다른 수용체 리간드 상호 작용이 세포 인식에 필수적일 수 있으므로 분석으로 일반화할 수 있습니다. 마지막으로, 지방 수율을 TCR 점유로 변환하는 데 필요한 상수 C를 실험적으로 유도하는 방법에 대해 논의합니다. 이 절차는 한 번만 수행하면 됩니다.

그런 다음 결정된 상수 C를 동일한 fluor fours를 가진 동일한 fret 시스템이 적용되는 모든 후속 실험에 사용할 수 있습니다. 이 절차에서는 수용체 광표백 후 공여체 회수를 통해 개별 TCR 클러스터에서 측정된 본질적으로 초조한 수율을 감작된 초조도 채널에서 감지된 해당 강도 값으로 전달했습니다. 앞서 논의한 바와 같이, 프렛 수율은 프렛 수용체 절제 전후의 배경 보정된 프렛 공여체 채널 이미지에서 결정됩니다.

민감화된 프렛 채널은 F 공여체 채널 및 X 및 Y와 정렬되고 배경을 보정해야 합니다. Fred 기증자는 출혈을 일으키고 Fred는 여기에 표시된 대로 교차 여기를 받아들입니다. Fred 기증자 출혈을 교정하고 Fred가 교차 여기를 받아들이는 방법에 대한 자세한 설명이 문서에 나와 있습니다.

이 비디오와 함께 이제 각 TCR 클러스터에 대해 수정된 프렛 이미지와 해당 수정된 프렛 도너 이미지의 버그 신호 비율을 계산합니다. 단일 초조함 공여체 및 단일 분자 초조구 기증자에 대한 수정된 평균 신호를 결정하고 비율을 계산합니다. 그런 다음 TCR 점유율은 두 비율을 곱하여 도출됩니다.

이제 TCR 점유율에 대해 개별 TCR 클러스터에 대해 결정되는 플롯 프렛 수율입니다. 그런 다음 C는 다음과 같이 선형 회귀를 통해 결정됩니다. 이 예에서는 2라운드에 해당합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단일 분자 형광 현미경과 함께 단백질 기능화 지질 이중층을 활용하여 PMHC와 TCR 사이의 시냅스 결합 역학을 측정할 수 있습니다. 단백질 생산, T 세포 표지 및 최종 프렛 측정을 포함한 모든 필요한 단계에 대해 논의했습니다. 또한, 이미지 분석이 상세하게 나타나 T 세포 활성화 곡선과 프렛 값을 산출했습니다.

마지막으로, kinetic on off rate의 결정의 기초가 되는 방법론이 제시되었습니다. 원칙적으로 다른 시냅스 수용체 리간드 상호 작용을 결정하기 위해 유사한 접근법을 사용할 수 있지만, 적절한 수정이 필요한 것으로 판명될 수 있습니다.