TCR-pMHC 바인딩 측정

본 영상에서는 T세포 항원 수용체와 펩타이드가 적재된 주조직 적합성 복합체(pMHC) 사이의 반응 속도론을 T세포와 평면 지지 지질 이중층 사이의 면역 시냅스 내에서 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 단백질 생산의 중요한 측면과 칼슘 플럭스 측정을 통해 지질 이중층의 기능적 무결성을 검증하는 방법에 대해 간략하게 안내해 드리겠습니다. 지질 이중층 준비 방법 및 단일 분자 형광 현미경 설정에 대한 더 자세한 정보는 Journal of Visualized Experiments에 게재된 저희의 관련 논문을 참조하시기 바랍니다. 이어서 벌크 및 단일 분자 수준에서 FRET(형광 공명 에너지 전이) 측정을 수행하고 분석하는 방법을 자세히 설명하겠습니다.

전반적인 접근 방식에 사용된 FRET 기반 전략을 설명하기 위해 시냅스 T 세포 수용체와 PMHC 결합의 역학을 추론하는 과정에서, 먼저 항원인 펩타이드 적재 MHC 분자(PMHC, 노란색 및 빨간색으로 표시)와 결합하고 있는 T 세포 수용체(TCR, 파란색으로 표시)의 결정 구조부터 시작하겠습니다. 또한 AG57이라 명명된 T 세포 수용체 베타 반응성 항체의 가변 도메인 단일 사슬 파편(single chain fragment)을 도입합니다. 정량적인 FRET 기반 측정을 위해서는 FRET 공여체(본 연구의 경우 단일 사슬 파편)와 FRET 수용체(PMHC) 모두를 부위 특이적 방식으로 표지하는 것이 필수적입니다.

이는 재조합 단백질에 비천연 시스테인을 도입함으로써 가능하며, 이를 통해 maleimide-conjugated Fluorophores와 공유 결합을 형성할 수 있습니다. 그림과 같이, 우리는 scFv에 FRET 공여체인 Alexa Fluor 555 또는 Cy3를 부착하고, MHC 결합 펩타이드의 C-말단에 FRET 수용체인 Alexa Fluor 647 또는 Cy5를 부착합니다.

이 복합 구조에서 나타난 Indy 거리는 약 41 angstrum으로, 두 염료 사이의 최대 에너지 전이 절반 거리인 첫 번째 반지름보다도 짧습니다. 본 실험에서는 평면 유리 지지 지질 이중층을 대리 항원 제시 세포로 사용합니다. 여기에는 PMXC, 보조 분자 B7-1 및 접착 분자 ICAM-1이 기능화되어 있습니다.

이러한 방식으로 전반사 형광 모드로 이미징을 수행할 수 있으며, 이는 계면과 매우 인접한 위치의 형광만을 조사함으로써 세포 배경 노이즈를 상당히 감소시킵니다. Fret은 단일 사슬 단편이 표지된 TCR이 층에 매립된 pMHC와 결합할 때만 검출 가능합니다. 이를 통해 TCR-pMHC 결합을 시각화하고, 적절하게 접힌 조직 적합성 항원-MHC 복합체 내에서 결합 역학을 계산할 수 있습니다.

P71 및 Ichem1의 세포 외 영역은 해당 BUC 바이러스가 감염된 곤충 세포 배양 상층액에서 정제합니다. 정제는 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피를 시작으로, 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피의 세 단계로 수행합니다. His-tag MHC Class II 헤테로다이머는 E. coli에서 봉입체 형태로 발현시키며, 산화-환원 버퍼 내에서 급격한 희석을 통해 스페이스홀더 펩타이드가 존재하는 4°C 환경에서 인비트로(in vitro)로 리폴딩합니다.

스페이스 홀더 펩타이드는 이후 UV 광 노출을 통해 절단됩니다. 정제 및 농축된 스페이스 홀더 외에 적절하게 접힌 PMHC 복합체를 준비합니다. pH 5.2에서 펩타이드가 절단되며 형광 펩타이드로 치환됩니다.

최종 생성물은 크기 배제 정제를 거칩니다. 단일 사슬 단편은 e coli에서 인클루전 바디 형태로 노출된 시스테인과 함께 발현되며, 단계적 투석을 통해 인비트로(in vitro)에서 리폴딩된 후 크기 배제 정제됩니다. 그 후 노출된 시스테인을 통해 말레이미드 결합 염료로 라벨링하고, 다시 한번 크기 배제 정제를 수행합니다.

모든 재조합 단백질은 최종적으로 50% glycerol이 포함된 PBS에 대해 투석하여 단백질 농도가 1 mg/mL가 되도록 농축한 후 -20 °C에서 장기 보관을 시작합니다. lipid blay의 자극 효능을 검증하기 위한 수단으로 T 세포의 세포 내 칼슘 농도를 측정하기 위해 ratio metric URA two dye를 사용하십시오. T-cell blast에 URA 2:00 AM ester를 로딩하십시오.

이 화합물은 AM 작용기를 통해 세포 내로 진입하며, 이후 esterase의 작용으로 AM 부분이 절단되어 세포 내에 갇히게 됩니다. 약 300만 개의 T 세포에 최종 농도가 5 µM이 되도록 fira 2:00 AM을 첨가하십시오. 24웰 플레이트에서 세포를 새 튜브로 옮기고 실온에서 30분 동안 배양하십시오.

칼슘과 마그네슘이 포함된 Hanks 완충 식염수와 1% albumin이 포함된 이미징 완충액으로 세포를 한 번 세척하십시오. 세포 내 칼슘을 모니터링하려면 UV 기능이 있는 자동 도립 현미경 시스템을 사용하십시오. 타이밍 프로토콜을 시작하고, 현미경 스테이지의 초점에 맞춰 배치된 기능화 지질 이중층에 로딩된 T 세포 2개를 추가한 뒤, 정기적인 시간 간격으로 DIC 이미지 하나와 340 및 380 nanometer UV 광원으로 여기시킨 형광 이미지 두 장을 획득하십시오.

이중층 접촉 직후, T 세포는 실행 15분 시점에 URA two ratio로 측정되는 상향 조절된 칼슘 수준을 나타냅니다. 모든 PMHC 항원을 포화시키는 차단 항체를 세포에 첨가합니다. 그 결과, 세포 내 칼슘 수준은 이후 기준점으로 사용될 비활성화 상태의 수준으로 떨어집니다.

블로킹 항체 농도가 비활성화 상태를 반영하는 값(FRET 측정을 위해 1로 정규화함)까지 감소하면, 각 실험마다 T세포를 TCR 반응성 단일 사슬 단편 FRET 프로브로 염색해야 합니다. 약 100만 개의 세포를 튜브에 옮기고 400 ×g에서 원심 분리합니다. 배지를 따라내고, 종이 타월로 튜브 내벽에 붙은 남은 배지 방울을 닦아냅니다. 이렇게 하면 앞서 언급한 약 30 µL의 최소 인큐베이션 부피를 확보할 수 있습니다.

FRET 프로브는 1 mg/mL 농도와 50% glycerol 상태로 -20 °C에서 보관합니다. 이 프로브는 Alexa Fluor 555 또는 Alexa Fluor 647로 부위 특이적 표지되었으며, 단백질 당 염료 비율은 1:1입니다. 세포에 0.3 µL의 프로브를 첨가합니다. 펠렛을 여러 번 조심스럽게 튕겨 섞어준 후, 세포를 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.

얼음처럼 차가운 이미징 버퍼로 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 배양, 원심분리 및 저온 보관은 T 세포가 형광 프로브에 노출되는 동안 이를 내부로 섭취하지 않도록 보장합니다.

이는 배경 형광의 상승을 초래할 것입니다. 더욱이, T 세포는 현미경 스테이지 교환 장치에 챔버가 포함된 바이알을 배치하기 전, 세척 및 보관 과정 중 저온 상태에서 프로브를 소실하지 않습니다. PBS를 이미징 버퍼로 순차적으로 교체하며, 이 과정에서 이중층이 공기에 노출되면 파괴될 수 있으므로 반드시 공기 노출을 피해야 합니다.

세포 배경 신호를 줄이기 위해, 저희는 터프 조명(turf illumination) 방식을 사용합니다. 이를 위해 여기 빔을 전반사가 일어나는 임계각으로 배치합니다. 여기 광원을 끄고 광역 조명을 켠 다음, T-세포를 ltec 챔버에 넣고 지질 이중층 위에 안착하도록 둡니다.

들뜸광을 켜고 비터프 영역에 초점을 맞춥니다. 모든 초점 평면에서 세포막이 광축을 따라 링 형태로 관찰되며, 터프 영역에서는 이중층과 접촉하는 기저막만 관찰 가능합니다. 그 위의 초점 평면들은 더 이상 들뜨지 않으므로 보이지 않습니다.

타이밍 프로토콜은 PMHC와 TCR 이미징을 위한 적색 및 녹색 여기 펄스로 시작하며, 이어서 P-M-H-C-F 수용체를 제거하기 위한 적색 표백 펄스가 이어집니다. F 지방 수용체 표백 후 TCR을 이미징하기 위한 녹색 펄스와 F 수용체 제거를 확인하기 위한 적색 펄스가 첫 번째와 두 번째 녹색 펄스 사이의 지연 시간을 최대한 단축하여 서브 세컨드(sub-second) 시간 규모로 수행됩니다. 선택 사항으로, 처음에 DIC 이미지를 얻을 수 있으며, 두 색상의 이미지 분할을 통해 공여체 채널과 수용체 채널을 동시에 검출할 수 있습니다.

수용체 여기 이미지는 T세포 시냅스 내 P HCS의 축적을 보여줍니다. 이 전처리 이미지는 pmcs의 존재를 확인시켜 주며, 이미 TCR 매개 PMHC 결합이 일어났음을 나타냅니다. 공여체 여기는 두 채널 모두에서 이미지를 생성합니다.

에너지 전이가 FRET 수용체 채널로 일어나기 때문에 fed 공여체 채널의 신호 강도는 어느 정도 감소합니다. FRET 수용체 채널의 신호는 fed 공여체의 FRET 블리드스루(bleed-through)와 FRET 수용체의 교차 여기(cross excitation)로 구성됩니다. 어찌 되었든, 이 이미지는 분석에 사용되지 않습니다.

본 프로토콜에서는 빠른 표백 펄스를 통해 모든 F 수용체 형광을 제거합니다. FRET 수용체 표백 후 F 공여체 이미지의 강도는 FRET 채널로의 강도 손실 없이 더 높은 수준으로 회복됩니다.

다음의 FRET acceptor 기대값은 완전한 F acceptor 광퇴색을 검증합니다. 시냅스를 확대하여 FRET donor 회복량을 정량화하겠습니다. FRET acceptor와 관계없이 일정한 평균 배경 강도를 결정하십시오.

광퇴색(Photobleaching)을 수행한 후, 시냅스와 대표적인 TCR 클러스터의 평균 강도를 결정합니다. 그다음 acceptor 제거 전후의 차이를 정규화하여 FRET 효율을 계산합니다. 본 예시에서는 시냅스 전체에 대해 16% FRET을, 대표 클러스터에 대해 26% FRET을 측정하였습니다.

TCR 클러스터의 FRET 효율은 이후 TCR 점유도로 변환되며, 이는 2차원 시냅스 해리 상수 단일 분자 데이터를 생성합니다. 이는 단일 분자 FRET 실험에서 시냅스 TCR-펩타이드-MHC 결합의 역학을 추론하는 데 도움이 됩니다. 우리는 이전과 동일한 시약 및 라벨링 전략을 사용합니다.

하지만 단일 TCR과 단일 펩타이드 MHC 사이의 상호작용을 실제로 관찰하고 있음을 보장하기 위해, 다음과 같은 기준을 충족하도록 설정하였습니다. 단일 분자 fre의 후보 이벤트는 단일 fre 수용체 또는 fre 공여체 분자와 일치해야 합니다. 본 연구에서는 관찰된 fre 이벤트의 단일 분자 특성을 검증하기 위해 단일 PMHC를 fre 수용체 분자로 사용하였으나, 그 반대의 논리 또한 적용 가능합니다.

더 높은 파장의 버튼에 수용체를, 더 낮은 파장의 버튼에 공여체를 사용하는 것도 분명 하나의 방법입니다. 일반적으로 우리는 514nm 및 647nm 여기 광원을 사용하여 자극성 지질 층과 접촉하는 T 세포를 노출시키며, 최소 1ms의 시간 지연 후 공여체와 수용체 여기를 순차적이고 반복적으로 수행합니다. 이 지연 시간은 실험 요구 사항에 따라 조절할 수 있습니다.

들뜸 후 밀리초 이내에 단일 염료 검출을 위해 충분히 강한 형광 신호를 얻으려면, 제곱센티미터당 1~5kW 범위의 높은 들뜸 전력 밀도를 적용해야 합니다. 광퇴색으로 인해, 가시적인 PMHC fret 수용체 분자의 수가 빠르게 감소하여, 제곱마이크론당 30개 이상의 라벨링된 PMCS가 포함된 이중층에서 단일 fret 수용체 형광 힘을 구별할 수 있는 수준이 됩니다. 전체 시간 지연이 42ms인 예가 여기에 제시되어 있습니다.

빨간색 원으로 표시된 단일 FRET 이벤트가 두 번째와 세 번째 시점에서 관찰됩니다. 이는 초록색 원으로 표시된 단일 S5 분자와 공국소화(co-localize)됩니다. 이 예시에서 관찰 가능한 FRET 이벤트의 트레이스 길이는 2이며, some 128 traces의 표에 나타난 것처럼 더 많은 단일 분자 FRET 트레이스를 수집하십시오.

다음으로, 초록색 숫자로 표시된 것처럼 트레이스의 보완 누적 합(complementary cumulative sum)을 계산하고, 이를 정규화하여 정규화된 값을 그래프로 나타낸 뒤 단일 지수 함수(mono exponential function)로 피팅합니다. 기대값은 1.5 timeframe보다 약간 더 큽니다. 이 값은 TCR 펩타이드, MHC 결합 및 광퇴색(photobleaching)에 따라 달라지므로, 이 두 가지 기여도를 구별하기 위해서는 최소 세 가지의 서로 다른 시간에 대해 기대값을 계산해야 합니다.

이제 모든 기댓값을 각각의 시간 지연(time lag)에 대해 도식화하고, 표시된 수명 함수에 데이터 지점을 맞춥니다. 여기서 수명은 2.12 seconds이며, 광퇴색(PHOTOBLEACHING)에 대한 기댓값은 f Fred입니다. 여기에 표시되었고 앞서 더 자세히 설명한 것처럼, 허용 가능한 수준의 퇴색 후 도너(Donor) 회복을 통해 면역 시냅스(immunological synapse) 내에서 유효한 2차원 해리 상수를 몇 단계만으로 결정할 수 있습니다.

여기서는 T-C-R-P-M-H-C 결합이 가장 두드러지게 나타나는 TCR 결합 및 TCR 클러스터에 분석 초점을 맞춥니다. 제시된 측정 결과에서 알 수 있듯이 F FRED 수득률은 상당한 차이를 보입니다. 개별 TCR 클러스터의 경우 다음과 같습니다.

F fred의 곱에 비례 계수 C를 곱하면 TCR 점유율(TCR occupancy)이 산출됩니다. 이는 pMHC와 결합한 TCR의 수와 전체 TCR 수 사이의 비율을 나타내는 항입니다. C는 특정 fre 쌍 세트와 사용된 FRE 시스템에 대해 한 번 결정되어야 합니다. 이 발표의 마지막 부분에서, 예를 들어 TCR R 반응성 단일 사슬 항체 단편과 MHC 결합 펩타이드의 C 말단에 구체적으로 배치된 SI 3 및 SI 5를 포함하여 C를 결정하는 방법을 더 자세히 설명하겠습니다. 이는 약 2개의 시냅스적, 2차원 해리 상수를 TCR 점유율 A와 지질 이중층에 존재하는 pMHC의 초기 밀도로부터 계산하는 것과 같습니다.

표시된 관계는 질량 작용 법칙에서 유도되었으며, 이 영상과 함께 제공되는 논문에 더 자세히 설명되어 있습니다. 본 예시에서 pmc의 초기 밀도는 제곱 마이크론당 30분자로 설정되었습니다. 이를 통해 T-세포 시냅스에서 효과적인 2D kd의 분포를 도출하였으며, 중앙값은 제곱 마이크론당 약 34분자로 나타났습니다.

결합 속도(on rate) 분포는 시냅스의 2D KD 분포와 이에 해당하는 해리 속도(off rate)를 통해 계산할 수 있으며, 여기서 해리 속도는 24 °C에서 단일 분자 FRET 트레이스 분석을 통해 결정된 초당 0.41입니다. 중앙값은 분자당 초당 약 0.01 square micron입니다. 요약하자면, TCR과 peptide MHC 간의 FRET 측정은 C2에서의 반응 역학을 설명하는 모든 반응 속도 매개변수에 대한 종합적인 분석을 가능하게 합니다.

이 방법론은 원칙적으로 세포 간 인식에 필수적일 수 있는 다른 수용체-리간드 상호작용 분석으로 일반화될 수 있습니다. 마지막으로, 지방 수율을 TCR 점유율로 변환하는 데 필요한 상수 C를 실험적으로 도출하는 방법을 논의합니다. 이 절차는 한 번만 수행하면 됩니다.

결정된 상수 C는 동일한 형광체들이 적용된 동일한 FRET 시스템을 사용하는 모든 후속 실험에 활용될 수 있습니다. 이 절차에서 우리는 본질적으로 수용체 광퇴색 후 공여체 회복을 통해 측정된 개별 TCR 클러스터의 FRET 효율을 감작된 FRET 채널에서 검출된 해당 강도 값과 연결했습니다. 앞서 논의한 바와 같이, FRET 효율은 FRET 수용체 제거 전후의 배경 보정된 FRET 공여체 채널 이미지로부터 결정됩니다.

감도 조절된 FRET 채널은 F 공여체 채널 및 X, Y 채널과 정렬되어야 하며 배경 신호에 대해 보정되어야 합니다. 여기에 표시된 것처럼 FRET 공여체 누출(bleed through) 및 FRET 수용체 교차 여기(cross excitation) 현상이 나타납니다. FRET 공여체 누출 및 FRET 수용체 교차 여기를 보정하는 방법에 대한 자세한 설명은 본 논문에 제공되어 있습니다.

본 영상에 이어, 이제 각 TCR 클러스터에 대해 보정된 fret 이미지의 bug 신호와 그에 대응하는 보정된 fret 공여자 이미지의 신호 비율을 계산하십시오. 단일 fret 공여자와 단일 분자 fret 이벤트에 대한 보정된 평균 신호를 결정하고 그 비율을 계산합니다. 그 다음, 두 비율을 곱하여 TCR 점유율을 도출합니다.

이제 개별 TCR 클러스터에 대해 결정된 fret 수율을 해당 TCR 점유율에 대해 도식화합니다. 그런 다음 여기에서 보여주는 바와 같이 선형 회귀를 통해 C를 결정합니다. 본 예시의 경우, 이는 약 2가 됩니다.

이 영상을 시청한 후, 단분자 형광 현미경과 단백질 기능화 지질 이중층을 결합하여 PMHC와 TCR 사이의 시냅스 결합 역학을 측정하는 방법을 활용할 수 있게 될 것입니다. 단백질 생산, T-세포 표지 및 최종 FRET 측정을 포함한 모든 필수 단계가 논의되었습니다. 또한, T-세포 활성화 곡선과 FRET 값을 도출하는 이미지 분석 과정이 상세히 제시되었습니다.

마지막으로, 동역학적 온-오프 속도(on off rates) 결정의 기초가 되는 방법론을 제시하였습니다. 원칙적으로 이와 유사한 접근 방식을 사용하여 다른 시냅스 수용체 리간드 상호작용을 결정할 수 있으나, 적절한 수정이 필요할 수 있습니다.