Name: TCR-pMHC 바인딩 측정 현장에서 FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: 학습하세요 FRET 기반 현미경 분석을 사용하여 면역학적 시냅스에서 TCR-pMHC 결합 동역학을 측정하는 방법을. 단일 분자 수준에서 결합 친화도와 해리율, 결합율을 정량화할 수 있습니다.

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석사 재정 및 행정 지원을위한 오스트리아 과학 기금 (FWF, J3086-B11) 및 감사의 슈뢰딩거의 교제 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다. GS와 JH는 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS13-030)에 의해 지원되었다.

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저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

동일계에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 pMHC TCR-11 결합의 낮은 친 화성 상호 작용을 취급 할 때 특히 매우 바람직하다. 온 - 레이트뿐만 아니라 이러한 상호 작용의 안정성은 크게 결합이 일어나는 상황 하에서 특정의 영향 때문이다. 최소 침습 FRET 기반 이미징 방식 완벽 등의 작업에 적합하다 원리에 따라서, 제 아직 극복해야 할 장애물의 수를 포함한다. 자기 형광 세포에 의해 생성 된 잡음은 측정의 감도를 제한하고 따라서 최소한으로 유지되어야한다. TIRF 현미경 적으로 선택 13-15의 단백질과 장식 평면 유리 지원 지질 이중층의 형태로, 잘 (12)이 필요성을 제공하지만 유리 슬라이드의 작용을 필요로한다. 부분적 reconstitutive 접근법의 또 다른 장점은 재조합 이중층 상주 FRET 파트너 훨씬 m 될 수 있다는쉽게 작고 밝은 형광으로 양적, 사이트 별과 합리적인 방식으로 표시 광석 세포 표면 발현 된 단백질로 가능한 것보다. 이전에 2 테스트되었습니다로 TCR도는 재조합 SCF V S, T 세포의 인식에 영향을주지 않는 태그가 있습니다. 또한, SLB의 단백질 조성물은, 예를 들면 pMHCs의 밀도 및 액세서리 인자의 선택은 하나의 특정 요구에 조정될 수있다. 우리는 이전에 자극 pMHCs의 밀도 변화와 실험을 수행했지만, 오프 2D가-K 및 2D-K (D2)에서 유의 한 차이가 발견되지 않았다. 지금까지 여기 MHC 클래스 II 분자의 인식은 주로 때문에 양단이 개구들이 펩타이드 결합 틈의 특성으로 만 처리되었으며, 따라서 형광 물질을 부착하기위한 링커 펩티드를 포함 큰 수용한다. 어떤 경우에는 이러한 접근 방식은 또한 라벨의 MHC CIA 요원에 대한 작동하지 않을 수 있습니다SS 나는 16 분자하지만 큰주의는 실험에 사용을 확인하기 위해주의해야한다. 표면 플라즈몬 공진에 의해 시험 관내에서 측정 된 T 세포 증식 분석법뿐만 아니라 키네틱 결합 pMHC-TCR을 통해 측정 할 수있는 항원을 향해 T 세포의 감도는 링커 및 형광 물질에의 첨가에 의해 영향을 받아서는 안 펩티드. 또한, 내가 자신을 분자 MHC 클래스는 중쇄 (게시되지 않은 관찰)의 순서 내 짝 시스테인의 도입으로 사이트 별 방식으로 표시 할 수 있습니다. 적절한 분자 프로브를 이용하여 임의의 시냅스 단백질 - 단백질 상호 작용은 원칙적으로 본 명세서에 기재된 방법으로 연구 될 수있다. 예를 들어, 이러한 프로브는, SCF V의 또는 설계 Ankyrin 반복 단백질 (DARPins) (17)는 1가 있어야하며 관심의 상호 작용에 영향을주지 않고 안정적으로 자신의 목표를 ​​결합해야합니다. 물론, 구조 informatio를N은 합리적인 프로브 설계에 매우 바람직하지만 절대적으로 필요합니다. FRET 파트너의 새로운 쌍을 설정할 때, 그것은 기록하고 처음으로 대량으로 FRET을 분석하는 것이 좋습니다. 라벨의 부착 위치는 FRET 신호를 최대화하기 위해 상당히 변화 될 수 있고 또한 수율이 FRET 측정 염료 간 거리에 따라 다를 수 있음을 확인하기 위해. 시스템이 최적화되면, 단일 분자는 신호 10-30%에 높은 풍부 FRET 파트너의 표시를 제한하고 단일 분자 조명 분야에서 분해 될 때까지 낮은 풍부 FRET 파트너 표백에 의해 기록 될 수있다 FRET. 마지막으로 그것이 SLB 수 어떤 근사하지만 주목해야하지 생리적 세포막의 모든 측면. 이러한 막 곡률과 유연성, 도메인 구획화, 세포 골격 재 배열 및 세포 운동성뿐만 아니라 표면 발현 막 단백질의 높은 다양한로서 자질 SLB 수로 표현되지 않고 T에 영향을 미칠 수그는 조사를 받고 처리합니다. 많은 노력이 TIRF 영상에 액세스 할 수없는 생리적 인 시냅스에서 단일 분자 해상도와 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링 허용 영상 방식을 설정하는 데 투자해야합니다.

T 세포가 항원을 인식하는 방법의 근본적인 이해는 T 세포와 APC 사이에 형성된 면역 시냅스 내에서, 즉, 정확한 위치를 찾고 요구한다. 여기서, 분자 결합 동력학은 셀룰러 힘, 막 구조 및 막 단백질 사이의 측 방향 작용뿐만 아니라 시냅스 특정 기하학적 제약들을 포함하는 셀룰러 파라미터에 크게 의존하지만 관련된 상호 작용 파트너의 본질적인 생화학 적 특성에 의해 결정되지 않는다 3. 생화학 적 방법은 그들이 관련된 시냅스 막의 적어도 하나의 중단을 필요로 해상력으로 제한된다. 이러한 이유로 FRET 기반 이미징 방법은 항원 pMHCs 2 TCR의 결합을 모니터하기 위해 개발되었다. 여기에 T - 세포 재조합로 장식되어 및 사이트 특별히 TCRβ 반응 단일 사슬 항체 단편 (SCF의 V) 표시 및 계획에 직면<html> MHC 클래스 II 형광 표지 된 항원 펩티드와 함께로드 분자, 보조 자극 분자와 접착 단백질을 항구 AR 유리 지원 지질 이중층 (SLB 수). 시냅스는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 벌크 및 단일 분자 수준에서 모니터링 할 수 있습니다 FRET의 염료 표지 TCR 및 염색 표지 pMHC 결과 사이의 바인딩. 이 문서는, T 세포에 시냅스를 분석하기위한 SLB 수를 이용하는 기능성 T 세포 칼슘 플럭스 분석을 통해 자신의 무결성을 검증하는 방법을 상세히 설명하고, 실시 대량으로 단일 분자 감도 측정 FRET 및 수집 된 데이터를 분석한다. 권장 사항은 이중층 작용에 필요한 제대로 닮아 단백질을 생산에게 제공됩니다. 이중층의 형성과 적절한 TIRF 현미경 (4)를 다시 다시 게시 추가 공용 액세스 조브 간행물을 참조하시기 바랍니다의 설치에 관한보다 구체적인 내용은. 십t &quot;&gt; SLB 수의 자연 Functionalizable SLB 수 용이 두 지질 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 실 -Sn- gylcero -3- 포스 포 함유 단일 층 소포 (SUV의)로부터 생성 될 수있다 (단 : POPC, 90-99%) 및 1,2- dioleoyl- SN을 - 글리세로 -3 - {[N (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산] 석시} (단 : DGS-NTA 니켈 1-10 %). 깨끗한 유리 슬라이드에 도포 SUV와 인접한 평면 이중층 (4)을 형성한다. DGS-NTA-NI는 합성 NTA - 니켈 함유 헤드 그룹 (그림 1A)와 폴리 히스티딘 매개 복잡한 형성을 통해 폴리 히스티딘 태그가 단백질을 고정하는 역할을한다. 안정 협회 하나를 들어 일반적으로 접착 단백질 ICAM-1과 열두 히스티딘에게 (ICAM-1-12H, B7-1 -12H)를 포함하는 하나의 태그와 공동 자극 분자 B7-1의 기본 횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 대체합니다 (그림 1B) . 펩티드 -로드 된 클래스 II 분자 IE에서 k 개의 임베디드 막 (α 및 β) 폴리 펩타이드 쇄를 포함의. 양쪽 사슬의 트랜스 / 세포질 도메인은 각 여섯 개의 히스티딘 (IE K α β 6H 6H 또는 IE 케이 -2x6H)를 포함하는 태그로 대체되어야한다. 다른 열두 히스티딘과 α-체인을 확장하고 태그가 지정되지 않은 (12H의 β의 0H 또는 IE의 케이 -12H α IE의 K 상승을주는) β-체인의 세포 외 도메인을 떠나으로 만족스러운 결과 (그림 1B)을 발생시킨다. pMHCs의 사이트 별 라벨 그것은 의미있는 평형 결합 상수에 FRET 측정 수율을 변환 할 수하기 위해 화학 양 론적 및 사이트 구체적으로 pMHC 레이블을하는 것이 중요합니다. 이는 재조합 히스티딘 태그가 MHC 클래스 II 분자의 2,5- 펩타이드 결합 틈에로드 합성 펩티드의 화학적 라벨링함으로써 달성 될 수있다. 펩티드 w로서 T 세포 에피토프의 모든 잔기를 포함엘 시스테인 다음에 짧은 C- 말단 링커 (GGS)으로 (예를 들어 나방 시토크롬 C (MCC) 펩타이드 ANERADLIAYLKQATK- GGSC에서, 링커는 굵은 글씨로 표시되어 있습니다). 이 시스테인은 말레이 미드 염료 유도체를 이용하여 화학량 론적으로 펩티드 라벨을 사용한다. 이 점에서 각별한주의가 시스테인 함유 펩타이드 정량 염료 커플 링을 확인에 전념해야한다. 펩타이드 염료 부가의 HPLC 정제를 권장하고 전기 분무 이온화 질량 분석에 의해 따라야한다. (염료없이) 펩타이드 유리체에 해당하는 모든 기록 대중은 불완전한 라벨을 반영한다. 이것이 사실이라면 라벨이 양적 것으로 간주 될 때까지, HPLC 정제 펩타이드는 염료 라벨의 연속 라운드를 실시해야한다. 이 방법은 시료의 이온화를위한 레이저 방사선을 포함 같이 MALDI-TOF 질량 분광법은 피해야합니다. 펩티드 질량 따라서 underrepre 판독되기 전에 처리는 부착 성 형광을 붕괴<html> 염료 결합의 변위량도. 가의 단일 체인 F V 조각의 사용과 셀 바인딩 TCR도의 간접 아직 사이트 별 라벨 아직 사이트 별 방식으로 살아있는 세포의 표면 관련 단백질을 세포하기 위해 염료를 부착 도전하고있다. 표면이 노출 된 TCR도 장애물을 극복하기 위해, 모노클로 날 항체 TCRβ -reactive H57-197 (2)의 유전자 발 가의 단일 쇄 버젼 (SCF V)를 구성하고있다. TCR과 착물이 항체의 결정 구조가 합리적으로 (대응 FRET 파트너 염료가 부착) MHC 관련 펩티드의 C 말단 가까이에있는 세린 잔기가 치환 된 버전을 설계 할 수있다 시스테인 잔류 물. 이 돌연변이 시스테인은 염료의 결합 (그림 2)에 대한 수용체 역할을한다. 방법론은 FRET을 기록하는 NT &quot;&gt; 벌크 FRET 값은 선택된 간 염료의 거리 사이의 관계를 확인하는 것이 가장 적합하며, 시스템 (2) 결합이 TCR-pMHC 측정 효율을 FRET. 또한, 벌크 FRET 측정은 시냅스 TCR-pMHC 유사성의 정량적 차이 (공개 아래 참조) 및 프로토콜 3.2. 문헌 6에 도입 된 FRET 효율을 정량화하기위한 다양한 접근 방법을.이 문서 FRET을 통해 기록에서 (a) 도너 복구 셉터 표백 후, 비아 (b)는 FRET 수용체 방출을 증감. 첫 번째 방법 (A)은 용이하게 광 퇴색 될 수 FRET 수용체, 오히려 광 안정성이다 도너의 사용을 필요로한다. 또한 이는 광 퇴색 셉터 더이상 도너 형광 급냉 할 수없는 것을 보장하는 것이 중요하다. 같은 감지 채널 (기증자)를 정량에 사용되는 바와 같이, 어떤 보정 요인 없습니다D 더 색수차는이 방법론 간단하고 신뢰성을 렌더링하는 고려되어야 할 필요가 없습니다. 그러나, 정량적 측정이 동일한 표본 지점에서 반복 될 수없고 FRET의 변화는 시간에 기록 할 수 없다. (수용체 표백 전) 첫 번째 무서워 기증자와 (FRET 수용체 표백 후) 두 번째 FRET 공여 이미지 수집 사이를 통과하는 시간을 최소화 분자 확산 또는 빠른 표백 단계를 목적으로한다 세포 운동에 의해 발생 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 조명 및 표백 시간을 최소화하기 위해 FRET 셉터 여진 파장의 강력한 레이저 광원을 사용하는 것이 권장된다. 반면, (b) 방출 민감화 FRET 측정 접근법 FRET 도너는 흥분과 FRET 수용체의 발광은 FRET 수용체 채널에서 관찰된다. FRET 수용체 신호의 변화가 적색 편이 수용체 채널로 시간 만 무서워 기증자의 방출을 통해 기록 할 수있다 (Termed bleedthrough) 정확하게 결정하고 기록 FRET 수용체 채널에서 공제 할 필요가 기증자 여기를 통해 수용체 크로스 여기를 FRET. 이를 위해 FRET 도너 대응하고 FRET 셉터 이미지 공간적으로 정렬되어야한다. 단일 분자 검출 (SM) 이벤트를 FRET 여기 원, 민감한 카메라와 노이즈 감쇠 TIRF 현미경으로서 레이저를 이용하여 하나의 형광체의 형광 쉽게 시간 동안 추적 될 수있다. 유사한 분자간 smFRET 이벤트의 검출을위한 사실이다. 그러나 합병증 FRET 도너 bleedthrough 및 FRET 수용체의 가교 자극에 의​​해 발생하고, 따라서 세심 smFRET 실험에서 형광 밀도를 조정할 때는주의가 필요하다 할 수있다. 아래의 프로토콜 (프로토콜 섹션 4)에서 TCR 낮은 풍부 FRET 수용체 높은 풍부하고 pMHC에 무서워 기증자로 선정되었다. FR을 감쇠충분히, 형광 SCF (V)과 비 형광 SCF의 V를 사용하여 TCR도의 90-70%와 TCR도 10-30 %에 장식 bleedthrough 동부 기증자. 그것은 하나의 분자와 공 초점이 채널을 FRET 때문에 여기 FRET 수용체 채널은 단일 분자 채널로 선택되었다. 이 smFRET 검증의 기초가 무서워 수용체 단일 분자와 smFRET 이벤트를 정렬하는 데 도움이됩니다. smFRET 측정을 통해 시냅스 오프 비율을 추출 양자의 광표백은 도너와 억 셉터를 FRET는 단일 분자의 상호 작용이 트레이스를 FRET의 반감기를 추출 할 때 고려되어야 할 FRET. 단일 도너 - 억 셉터 페어로서의 외관 N의 시작-FRET 관찰 신호의 수 (0) 수용체 - 리간드 복합체의 양 및 광표백 바인딩 해제하여 시간이 지남에 따라 감소된다. 다음과 같이 주어진 시간 N (t)에서 단지 생존 수는 수학적으로 표현 될 수있다 : 광표백 용어 특급 (-t / τ 표백제)의 시간 t는 즉 표백 만 조명시 발생 관찰 수 (N)의 생성물 및 (인해 비 연속적, 불연속 관찰 모드의 병, 조명 시간 t에 의해 설명된다 ). 운동 기간 exp- (t / τ OFF) 시간 t가 관찰 수 (N)의 곱과 단일 FRET 관찰 (즉, 결합 해제 운동이 연속적으로 발생 함)에 대한 시간 t 래그 내이다. 수학 식 1과 같이 표현 될 수있다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> 용어 τ 표백제 / τ 아픈 데백화가 발생하고, 기대 값이 &lt;N 백제&gt;로서의 지수 함수 정의 될 때까지 관찰의 수를 cribes. 다음과 같이 수학 식 2를 단순화 할 수있다 : <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> 시간 t-FRET 관찰 후 이벤트와 프레임의 수 N (t)의 기대 값은 &lt;N (t 래그)&gt; 직접 실험으로부터 결정된다. 이 실험에서 선택된 관측 (t 래그) 및 τ 오프 (OFF k는 오프 - 속도의 역수)에 대한 미지의 값의 설정 가능한 시간에 따라 표백이 발생하기 전에, 관측 횟수의 기대 값을 &lt;N 백제&gt; . 따라서, t의 적어도 두 값의 기대 값 &lt;N (t 래그)&gt;의 계산 <sub&gt; 지연이 &lt;N 표백&gt; 오프 τ의 실험적인 결정을 할 수 있습니다. FRET 기반의 측정을 통해 시냅스 2D-K D 값을 추출 TCR 점유 즉, 바인딩 TCR도 총 TCR도 사이의 비율을 측정, 시냅스 2D-K D의 값을 결정하는 핵심이다. 한 TCR도가 무서워 기증자와 pMHCs 무서워 수용체로의 역할로 산출 프렛 측정에 식 (4)에 따르면이 용어는 직접적으로 비례한다. <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> = TCR 점유율과, C는 = 환산 계수 C는 FRET 시스템에 의존하고 형광체가 사용되는 상수이다. 아래 그림과 같이이 실험적으로 결정될 수있다. 수학 식 5에있어서, 2D-K D로 전환 될 때종래 이중층에 T 세포의 첨가로 TCR 리간드의 초기 밀도가 공지되어있다. 이는 SLB 부착 단백질의 높은 이동성의 SLB 수이며, 또한 (2)의 리간드는 거의 무진장 저장조를 제공하기 때문이다. <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> [pMHC의 초기]는 종래의 T 세포에 첨가 pMHC의 초기 밀도를 함께 = 식 4, 5 일 지금 쉽게 TCR 및 pMHC 사이의 시냅스 2D-K D를 확인할 수 있습니다. 이것은 가장 확실 수용체 표백 (프로토콜 3.1 절 참조) 후 기증자의 회복을 기반으로 FRET 측정으로 이루어집니다. 그러나, C에게 내가 FRET FRET 세기 간의 관계를 측정하고 TCR 점유 결정한다 (배경에 대해 보정, FRET 도너 및 억 셉터 bleedthrough 교차 여진은 FRET). 이를 위해, 하나의내가 기증자를 FRET과 단일 분자의 평균 강도 사건이 난 FRET SM FRET 단일 TCR 관련 FRET 기증자 형광 (예를 Cy3 또는 AF555) SM의 평균 형광 강도의 비 (R)를 알 필요가있다. R은 형광 검출에 사용되는 질문, 배출 필터와 카메라의 FRET 체제에 따라 다릅니다. TCR은 다음 직접 식 6에 따라 결정될 수있다 점유. <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = SM과 내가 FRET 기증자 / SM을 FRET R은 리드 H57 scFv-를 Cy3 / pMHC-Cy5의 시스템에 대한 1.45로 하였다 : = 대량 나는 1.45 • / 대량 나는 TCR-CY3을 FRET TCR 점유 및 FRET 수율 사이의 관계는 FRET 공여체에 의해 결정될 수있다 복구수용체 표백 후 Y. 선형 피팅 그림 4A 국지적 인 슬로프에서와 같이이 두 매개 변수가 숫자 TCR의 microclusters에 대해 서로에 대해 플롯은 (식 4)에서 변환 계수 C를 나타냅니다. 1.995로는 Cy3 / Cy5의 pMHC-FRET 시스템 및 (b) 가해 현미경 시스템 구성 -도 4a에서 설명 된 바와 같이, C가 (a)의 V H57 SCF 대한 금액. TCR은 다음과 같이 용이하게 추론 될 수 점유 : TCR 점유 = 1.995 • 산출 FRET

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>10000713 박테리아 발현</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>10227402 바큘로 바이러스 생산을 위한 곤충 세포 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민이 함유된 곤충-XPRESS (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>바큘로 바이러스 발현을 위한 곤충 세포 배지</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>바이러스용 세포 생산 및 확장</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>포테인 발현을 위한 세포</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>세균 발현</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>단백질 농축 대량의</td></tr><tr><td>Centramate 카세트 10kDa 차단</td><td>Pall</td><td></td><td>OS010T12 단백질 농축 대량</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>&Auml; kta pure 25L</td><td>GE 헬스케어</td><td>29-0182-24</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5175-01</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5174-01</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5166-01</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 패스트 플로우</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5318-01</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 열</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Gilson HPLC 시스템</td><td>Gilson</td><td></td><td>정제 형광 결합 펩티드</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &micro; m 입자 크기, 21.2 * 250mm 열 크기</td><td>애질런트</td><td>A6000250X212</td><td>형광 결합 펩타이드</td></tr><tr><td>정제 XR C18, 5 &micro 추구; m 입자 크기, 21.2*50 mm 컬럼 크기</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column</td>의 정제;<td>GE 헬스케어</td><td>28-4064-13</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>Gilson HPLC 시스템</td><td>Gilson</td><td></td><td>정제 형광 결합 펩티드</td></tr><tr><td>추구 XR C18, 5 &마이크로; m 입자 크기, 21.2 * 250mm 열 크기</td><td>애질런트</td><td>A6000250X212</td><td>형광 결합 펩타이드</td></tr><tr><td>정제 XR C18, 5 &micro 추구; m 입자 크기, 21.2*50mm 컬럼 크기</td><td>애질런트</td><td>A6000050G212</td><td>형광 결합 펩타이</td></tr>드 <tr><td>정제 Cy3 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>돌연변이 쌍을 이루지 않은 시스테인을 통한 부위 특이적 단백질 라벨링</td></tr><tr><td>Cy5 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>돌연변이 짝을 이루지 않은 시스테인을 통한 부위 특이적 단백질 라벨링</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>돌연변이 짝을 이루지 않은 시스테인을 통한 부위 특이적 단백질 라벨링</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>돌연변이 짝을 이루지 않은 시스테인을 통한 부위 특이적 단백질 라벨링</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, 세포 투과성</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>세포 라벨링용 칼슘 민감성 염료</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>용해용 fura-2 am</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution plus 칼슘/마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>이미징 버퍼</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 동결건조 분말</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>이미징 버퍼용 보충제</td></tr><tr><td>14-4-4S 항체</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>H2-I-Ek에 대한 차단 항체 (5c.c7, 2B4 및 AND TCR에 의해 인식)</td></tr> <tr><td>5 ml 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m Ultrafree-MC 원심 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2&micro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 마이크로스피어, 0.1 &마이크로; m, 형광 블루/그린/오렌지/다크 레드</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>현미경은 fura-2 기반 칼슘 측정을 위한 것입니다&nbsp;</td><td>(</td><td></td>단일 분자) FRET 측정을 위한 LEICA DMI4000B <td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>에 대한 자세한 내용은 Axmann et al.의 병렬 JoVE 기여를 참조하십시오.</td><td></td></tr><tr><td>planar supported lipid bilayers</td><td></td><td>에 대한 자세한 내용은 Axmann et al.의 병렬 JoVE 기여를 참조하십시오.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T 세포 배지</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T 세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T 세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T 세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>마우스 인터루킨-2 재조합 단백질</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T 세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>연구 학년 소 태아 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>T 세포 배지 보충제</td></tr><tr><td>원산지 (분석 프로그램)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>두 매개 변수의 비선형 피팅 (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

tcr-pmhc 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; fret 기반의 현미경 분석을 사용하여

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T cell은 Antigen Presenting Cells(APC) 표면의 MHC 분자(pMHC)에 내장된 펩타이드 형태의 항원을 인식할 때 매우 특이적이고 효과적입니다. 이는 T세포 항원 수용체(T-cell antigen receptor, TCR)가 in vitro1에서 결합을 측정할 때 항원에 대해 보통 중간 정도의 친화력(μM 범위)을 발휘함에도 불구하고 발생합니다. T-세포 항원 민감도에 기여하는 분자 및 세포 매개변수를 고려하여, 살아있는 T-세포의 시냅스와 항원제시세포(Antigen Presenting Cell, APC)의 세포막을 모방한 인공적이고 기능적인 유리 지지 평면 지질 이중층(SLB) 내에서 발생하는 TCR-pMHC 결합을 현장에서 모니터링하기 위한 수단으로 현미경 기반 방법론이 개발되었습니다 2. 측정은 TCR과 pMHC에 부착된 청색 및 적색 편이 형광 염료 사이의 Förster FRET(Resonance Energy Transfer)를 기반으로 합니다. FRET의 효율은 inter-dye distance의 6제곱에 반비례하기 때문에 FRET 신호를 사용하여 시냅스 TCR-pMHC 결합을 시각화할 수 있습니다. 현미경 접근법의 민감도는 단일 분자 FRET 이벤트의 검출을 지원합니다. 이를 통해 시냅스 TCR-pMHC 상호 작용의 친화도 및 오프 레이트를 결정하고 결합의 온율을 보간할 수 있습니다. 유사한 분석을 적용하여 원래 환경에서 다른 수용체-리간드 상호 작용을 측정할 수 있습니다.

의 Fura-2 칼슘 염료 통하여 세포 내 칼슘의 기록뿐만 아니라 후속 셀룰러 분석 자극 효능 및도 4에 도시되어 SLB 수의 따라서 기능을 확인하기 위해. 분명하게 된 바와 같이, 칼슘 농도는 다음과 같이 표현 (T 세포 상승 기준 즉시 즉시이 자극 SLB 수에 정착으로) 1 인 정규화의 Fura-2 시간 조사 / 380 ㎚ ​​비율. 칼슘 농도가 곧 TCR 결합 이로부터 차단 pMHCs가 T 세포 활성화를 종료 항체의 첨가 후에 기준선 수준으로 복귀. 도 6은 (도 4에 도시) FRET 수율을 측정하기 위해 채용되며, 2D-K D 값을 산출하는 역할을하는 셉터 표백 후 FRET 도너 회복과 관련된 대표적인 실험을 도시한다. 무서워의 신속하고 완전한 절제 후 AF555을 통해 표시 TCR을 나타냅니다 무서워 기증자 강도의 증가를, 양해 해 주시기 바랍니다cceptor 종 (여기서는 pMHCs과 관련된 AF647). 또한 분명이 무서워 채널에 강한 감소는, 즉, FRET 수용체 표백 후 FRET 공여 여기에서 FRET - 수용체 채널. 거의 보이지 나머지 신호는 기증자 bleedthrough을 FRET에 해당합니다. 개별 TCR의 microclusters 또는 전체 시냅스 내 무서워 수익률을 계산 표시된 측정 된 강도 값 (그림 6B)을 기반으로합니다. 그림 7은 두 시간 프레임에서 볼 수 단일 분자 FRET 이벤트의 궤적과 시간 경과를 나타낸다. 도입에 위에서 설명한 것과 같은 행동은 모두 결합 시냅스 TCR-pMHC의 부패와 광표백에 의해 발생합니다. 이러한 두 가지 기여를 구별하기 위해, 실험 획득 시간 프레임은 지속 기간에서 가변 할 수있다 : 광표백은 일정하게 유지하면서, FRET 이벤트 궤도 길이의 변화에​​만 결합 동력학에 의해 야기된다. tracelengths의 정량, W<html> HICH도 7에 도시 된 오프 - 속도와 표백의 계산을위한 기초를 형성한다, (3) 표 1에 제공된다. 2D-K D의의 결정은 대량의 녹음이 무서워 - 기증자 표시 TCR도에 대한 수율을 FRET이 필요합니다. 실험적으로 유추 상수 C (도 4)의 사용으로, TCR의 microcluster 또는 전체 시냅스 측정 FRET 수율 TCR로 점유 전환 될 수있다, 즉, pMHC - 결합 및 총 TCR도의 비 (도 4C) . 종래 T 세포에 첨가 SLB에 본 공지 pMHC 밀도로, 값은 시냅스 2D-K D 값 (도 4d)를 결정하기 위해 적용될 수있다. 온 속도는 질량 작용의 법칙으로 계산 될 수있다 (에 2D-K = 2D-K / 2D-K D를) 결정 시냅스에서 오프 속도와 2D-KD 값. 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; 도 1의 평면 유리 지원 지질 이중층 (SLB) 시스템의 개략 회로도. (A) SLB 수는 해당 지질로 구성된 POPC (90-99%) 및 합성 지질 DGS의 Ni-NTA (1-10%)로 구성하고 깨끗한 유리 표면이 작은 단일 층 소포 (포드 SUV)으로 충전되면 자발적으로 형성된다. (B)가 형성되면, 예컨대 SLB 수는 T 세포에 대한 장갑차 역할을하는 수용성 폴리 히스티딘 - 태그 pMHCs 세포 유래의 부분, 보조 자극 B7-1 단백질과 ICAM-1의 접착 단백질로 작용 화 될 수있다. SLB 수를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 AXMANN 등. (4)를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> 2. 포스터 공명 에너지 재 전송 기반의 분석은 TCR-pMHC가 현장에서 바인딩을 정량한다. (A) pMHC 결합 H57 단일 사슬 단편과 복합 TCR의 복합 구조물은 본원에 기재된 FRET 기반 접근법 나타낸다. 약 41A FRET을받은 두 대응하는 형광 물질을 분리하는 짧은 거리를합니다. 형광 - 말레이 미드에 대한 수용체 사이트는 녹색과 빨간색으로 표시됩니다. (B)는 현장에서 TCR-pMHC 상호 작용을 검출하는 원리가 설명된다. 만 SCF V는 특정 복합체를 형성 TCR도 및 pMHCs (여기에 IE의 k)를, -decorated, 측정 FRET 신호에 상승을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &quot;/&gt; 도 SCF V S 단량체와 펩티드 -로드 된 IE의 K -2x6H 분자 최종 겔 여과 단계주는 상승 3. 크로마토. X 축이 용액에 보유 체적을 나타내고, Y 축에는 임의의 단위로 280 nm에서 (AU)을 흡광도를 나타낸다 . (A) H57 SCF의 V 부위 - 특이 알렉사 형석 555 말레이 미드 단백질 (단계 1.2.5)에서 미 반응 된 염료를 분리 S75 크로마토 그래피로 표지. 고정 간격으로 14 - 15 ㎖ (점선)에 대응 분획 단량체 H57 SCF의 V 라벨링 나타낸다. UV 분해성 ANP 공간 홀더 펩타이드 복합체 (B) IE의 유전율 -2x6H 분자하면, UV가 조사 된 부위 - 특이 알렉스 함께 배양했다 647 말레이 미드 표지 펩티드​​ 마지막 자유 펩티드 (단계 1.1.2.4)로부터 단백질을 분리하는 S200 크로마토. 포함이 제대로 접혀 점선과 단량체 pMHCs 사이의 간격. (A, B) </strong는&gt; 0.7 ml의 샘플 럼 (0 mL의 점)의 시작 컬럼에 적용 하였다. 수집 된 분획을 농축 하였다. 단백질을 염색 비율 전에 PBS / 50 % 글리세롤에 대한 투석에 photospectrometry에 의해 결정되었다 (-20 °에서 저장). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> 그림 4. 결정 2D-K D S와 S의 2D-K. (A) 수용체의 표백 및 TCR 점유율이 실험적으로 측정 한 후 기증자의 회복에 의해 결정되는 FRET 수익률 사이의 상관 관계. 4.2 절에 설명 된대로 TCR 점유율은 개별 TCR의 microclusters에 대해 판단 할 수있다. 상기 데이터의 선형 피팅을 행함으로써 표시의 기울기는 TCR 간의 비율 C 같다점유하고 무서워 수율. C는 FRET 시스템과 사용 된 형광 (여기를 Cy3와 Cy5에)에 대한 일정한 다릅니다. 이 예는 (B). 1.988를 산출 수율 데이터는 개별 TCR의 microclusters 결정했다 FRET (N = 187, 온도 = 24 ° C) 수용체 표백의 기증자 복구를 통해. 히스토그램 막대 아래 번호 간격 내의 상한을 나타낸다. 측정 곱하여 (B)에 도시 한 데이터 (C)는 변환 (A)가 C에서 결정된 상수 수율 FRET. 바 아래 숫자 간격 내의 상한을 나타낸다. (D) 히스토그램 (세미 - 대수,베이스 = 4)의 개별 TCR microclusters 측정 2D-K D (S)의 분포를 도시. 중간 2D-K (D)는 청색으로 표시됩니다. 바 아래 숫자는 (E) (D)에 도시 한 히스토그램. 간격 내의 상한을 나타내는 INT를 전환시켰다OA 2D-K 24 ° C의 오프 시냅스 K를 사용 -histogram (반 대수,베이스 = 4)에 (0.41 S-1). 값에 결정된 중간 2D-k는 청색으로 표시됩니다. 데이터가 원래 Huppa 등. 2 년에 출판 된 새로운 형식으로 여기에 시각입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> SLB 수의 그림 5. 기능 검증은 T 세포 자극 및 이미징 위해 사용. 의 Fura-2와 함께로드 (A) TCR-트랜스 제닉 T 세포는 항원 폭발 pMHCs, ICAM-1 및 B-7을 자극하는 형질 SLB 직면 하였다. 셀룰러 340 nm의 380 nm에서 흥분의 Fura-2 방출뿐만 아니라 DIC 이미지가 기록되었다. 나타낸 바와 같이, 발광 강도 비의 값은 34로 여기0과 380 nm의는 오른쪽 창에 표시됩니다. 자극 SLB 수 접촉 pMHC이 실험 실행에 항체를 14 분 동안 차단의 첨가는 T 세포 휴식에 필적 세포 내 칼슘 농도의 저하를 초래. (B)의 평균의 Fura-2 비율의 전형적인 시간 프로파일 T를 세포는 특징이있다 항체 - 매개 봉쇄 박탈 후 항원 비 - 활성화 T 세포 또는 T 세포에 비해 2 내지 4 배 높은 세포 내 칼슘의 상승 초기. 녹색 동그라미가 (A)에 예시 된 시점을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> FRET 수용체 표백 후 FRET 기증자 복구를 통해 측정 그림 6. 벌크는 수율을 FRET. <str옹&gt; 표시됨 (A)는 전형적인 시냅스 무서워 - 측정의 예입니다. 왼쪽과 상단에 표시되어있는 바와 같이 일련의 이미지가 무서워 기증자 및 FRET 수용체 채널에 상승 제공 방출 빔 스플리터를 사용하여 인수 한 (빔 스플리터에 대한 자세한 내용은 AXMANN 참조 등 4). DIC 좌측 이미지에 표시된 선은 T 세포 시냅스의 경계를 나타낸다. (B).도 FRET 수용체 표백 (단계 4) 후 FRET 도너 채널 강도의 증가는 FRET 수용체 채널 내의 강도의 손실을 참고 개별 시냅스 영역 또는 전 시냅스에 대해 나타낸 바와 같이, 효율을 정량화 할 수있다 FRET. 검사의 경우, 이전과 FRET 수용체 표백 후 이미지는 두 개의 룩업 테이블 (LUT를, 녹색과 물리학)의 사용으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> 그림 7. 단일 분자 이벤트가 나타나 insingle 단계를 사라와 완벽하게 하나의 FRET 수용체의 형광과 정렬 FRET. 단일 분자 FRET 이벤트의 시간 경과가 표시됩니다. 이미지가 백 조명 EMCCD 카메라를 사용하여 획득 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> τ를 결정 그림 8. = 1 / 측정 smFRET 궤도에서 떨어져 케이. (A) 5c.c7 TCR 유전자 변형 T 세포 폭발이 IE를 &lt;인식 장식 H57 SCF V -AF555에서 파생 관찰 FRET 신호 (의 정규화 된 누적 금액SUP&gt; / K3-AF647는 네 개의 다른 타임 래그 (42 밀리 초, 490 밀리 초, 밀리 1,007, 1,989 밀리 초) 24 ℃)에서 관측들의 총 수의 함수로서 플로팅 하였다 K. 모노 - 지수 피팅 함수. 기대 값 &lt;N (t 래그)&gt;의 음극 역 대응을 야기 (B)의 기대 값이 지연 t 지연에 대해 도시하고, &lt;N (t 래그)&gt; 식을 이용하여 장착 = τ / 오프 {(&lt;N 표백&gt; / 오프 τ) + T 지연이} τ를 산출하고 &lt;N 표백&gt;.에 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

본 영상에서는 T세포 항원 수용체와 펩타이드가 적재된 주조직 적합성 복합체(pMHC) 사이의 반응 속도론을 T세포와 평면 지지 지질 이중층 사이의 면역 시냅스 내에서 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 단백질 생산의 중요한 측면과 칼슘 플럭스 측정을 통해 지질 이중층의 기능적 무결성을 검증하는 방법에 대해 간략하게 안내해 드리겠습니다. 지질 이중층 준비 방법 및 단일 분자 형광 현미경 설정에 대한 더 자세한 정보는 Journal of Visualized Experiments에 게재된 저희의 관련 논문을 참조하시기 바랍니다. 이어서 벌크 및 단일 분자 수준에서 FRET(형광 공명 에너지 전이) 측정을 수행하고 분석하는 방법을 자세히 설명하겠습니다.전반적인 접근 방식에 사용된 FRET 기반 전략을 설명하기 위해 시냅스 T 세포 수용체와 PMHC 결합의 역학을 추론하는 과정에서, 먼저 항원인 펩타이드 적재 MHC 분자(PMHC, 노란색 및 빨간색으로 표시)와 결합하고 있는 T 세포 수용체(TCR, 파란색으로 표시)의 결정 구조부터 시작하겠습니다. 또한 AG57이라 명명된 T 세포 수용체 베타 반응성 항체의 가변 도메인 단일 사슬 파편(single chain fragment)을 도입합니다. 정량적인 FRET 기반 측정을 위해서는 FRET 공여체(본 연구의 경우 단일 사슬 파편)와 FRET 수용체(PMHC) 모두를 부위 특이적 방식으로 표지하는 것이 필수적입니다.이는 재조합 단백질에 비천연 시스테인을 도입함으로써 가능하며, 이를 통해 maleimide-conjugated Fluorophores와 공유 결합을 형성할 수 있습니다. 그림과 같이, 우리는 scFv에 FRET 공여체인 Alexa Fluor 555 또는 Cy3를 부착하고, MHC 결합 펩타이드의 C-말단에 FRET 수용체인 Alexa Fluor 647 또는 Cy5를 부착합니다.이 복합 구조에서 나타난 Indy 거리는 약 41 angstrum으로, 두 염료 사이의 최대 에너지 전이 절반 거리인 첫 번째 반지름보다도 짧습니다. 본 실험에서는 평면 유리 지지 지질 이중층을 대리 항원 제시 세포로 사용합니다. 여기에는 PMXC, 보조 분자 B7-1 및 접착 분자 ICAM-1이 기능화되어 있습니다.이러한 방식으로 전반사 형광 모드로 이미징을 수행할 수 있으며, 이는 계면과 매우 인접한 위치의 형광만을 조사함으로써 세포 배경 노이즈를 상당히 감소시킵니다. Fret은 단일 사슬 단편이 표지된 TCR이 층에 매립된 pMHC와 결합할 때만 검출 가능합니다. 이를 통해 TCR-pMHC 결합을 시각화하고, 적절하게 접힌 조직 적합성 항원-MHC 복합체 내에서 결합 역학을 계산할 수 있습니다.P71 및 Ichem1의 세포 외 영역은 해당 BUC 바이러스가 감염된 곤충 세포 배양 상층액에서 정제합니다. 정제는 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피를 시작으로, 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피의 세 단계로 수행합니다. His-tag MHC Class II 헤테로다이머는 E. coli에서 봉입체 형태로 발현시키며, 산화-환원 버퍼 내에서 급격한 희석을 통해 스페이스홀더 펩타이드가 존재하는 4°C 환경에서 인비트로(in vitro)로 리폴딩합니다.스페이스 홀더 펩타이드는 이후 UV 광 노출을 통해 절단됩니다. 정제 및 농축된 스페이스 홀더 외에 적절하게 접힌 PMHC 복합체를 준비합니다. pH 5.2에서 펩타이드가 절단되며 형광 펩타이드로 치환됩니다.최종 생성물은 크기 배제 정제를 거칩니다. 단일 사슬 단편은 e coli에서 인클루전 바디 형태로 노출된 시스테인과 함께 발현되며, 단계적 투석을 통해 인비트로(in vitro)에서 리폴딩된 후 크기 배제 정제됩니다. 그 후 노출된 시스테인을 통해 말레이미드 결합 염료로 라벨링하고, 다시 한번 크기 배제 정제를 수행합니다.모든 재조합 단백질은 최종적으로 50% glycerol이 포함된 PBS에 대해 투석하여 단백질 농도가 1 mg/mL가 되도록 농축한 후 -20 °C에서 장기 보관을 시작합니다. lipid blay의 자극 효능을 검증하기 위한 수단으로 T 세포의 세포 내 칼슘 농도를 측정하기 위해 ratio metric URA two dye를 사용하십시오. T-cell blast에 URA 2:00 AM ester를 로딩하십시오.이 화합물은 AM 작용기를 통해 세포 내로 진입하며, 이후 esterase의 작용으로 AM 부분이 절단되어 세포 내에 갇히게 됩니다. 약 300만 개의 T 세포에 최종 농도가 5 µM이 되도록 fira 2:00 AM을 첨가하십시오. 24웰 플레이트에서 세포를 새 튜브로 옮기고 실온에서 30분 동안 배양하십시오.칼슘과 마그네슘이 포함된 Hanks 완충 식염수와 1% albumin이 포함된 이미징 완충액으로 세포를 한 번 세척하십시오. 세포 내 칼슘을 모니터링하려면 UV 기능이 있는 자동 도립 현미경 시스템을 사용하십시오. 타이밍 프로토콜을 시작하고, 현미경 스테이지의 초점에 맞춰 배치된 기능화 지질 이중층에 로딩된 T 세포 2개를 추가한 뒤, 정기적인 시간 간격으로 DIC 이미지 하나와 340 및 380 nanometer UV 광원으로 여기시킨 형광 이미지 두 장을 획득하십시오.이중층 접촉 직후, T 세포는 실행 15분 시점에 URA two ratio로 측정되는 상향 조절된 칼슘 수준을 나타냅니다. 모든 PMHC 항원을 포화시키는 차단 항체를 세포에 첨가합니다. 그 결과, 세포 내 칼슘 수준은 이후 기준점으로 사용될 비활성화 상태의 수준으로 떨어집니다.블로킹 항체 농도가 비활성화 상태를 반영하는 값(FRET 측정을 위해 1로 정규화함)까지 감소하면, 각 실험마다 T세포를 TCR 반응성 단일 사슬 단편 FRET 프로브로 염색해야 합니다. 약 100만 개의 세포를 튜브에 옮기고 400 ×g에서 원심 분리합니다. 배지를 따라내고, 종이 타월로 튜브 내벽에 붙은 남은 배지 방울을 닦아냅니다. 이렇게 하면 앞서 언급한 약 30 µL의 최소 인큐베이션 부피를 확보할 수 있습니다.FRET 프로브는 1 mg/mL 농도와 50% glycerol 상태로 -20 °C에서 보관합니다. 이 프로브는 Alexa Fluor 555 또는 Alexa Fluor 647로 부위 특이적 표지되었으며, 단백질 당 염료 비율은 1:1입니다. 세포에 0.3 µL의 프로브를 첨가합니다. 펠렛을 여러 번 조심스럽게 튕겨 섞어준 후, 세포를 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.얼음처럼 차가운 이미징 버퍼로 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 배양, 원심분리 및 저온 보관은 T 세포가 형광 프로브에 노출되는 동안 이를 내부로 섭취하지 않도록 보장합니다.이는 배경 형광의 상승을 초래할 것입니다. 더욱이, T 세포는 현미경 스테이지 교환 장치에 챔버가 포함된 바이알을 배치하기 전, 세척 및 보관 과정 중 저온 상태에서 프로브를 소실하지 않습니다. PBS를 이미징 버퍼로 순차적으로 교체하며, 이 과정에서 이중층이 공기에 노출되면 파괴될 수 있으므로 반드시 공기 노출을 피해야 합니다.세포 배경 신호를 줄이기 위해, 저희는 터프 조명(turf illumination) 방식을 사용합니다. 이를 위해 여기 빔을 전반사가 일어나는 임계각으로 배치합니다. 여기 광원을 끄고 광역 조명을 켠 다음, T-세포를 ltec 챔버에 넣고 지질 이중층 위에 안착하도록 둡니다.들뜸광을 켜고 비터프 영역에 초점을 맞춥니다. 모든 초점 평면에서 세포막이 광축을 따라 링 형태로 관찰되며, 터프 영역에서는 이중층과 접촉하는 기저막만 관찰 가능합니다. 그 위의 초점 평면들은 더 이상 들뜨지 않으므로 보이지 않습니다.타이밍 프로토콜은 PMHC와 TCR 이미징을 위한 적색 및 녹색 여기 펄스로 시작하며, 이어서 P-M-H-C-F 수용체를 제거하기 위한 적색 표백 펄스가 이어집니다. F 지방 수용체 표백 후 TCR을 이미징하기 위한 녹색 펄스와 F 수용체 제거를 확인하기 위한 적색 펄스가 첫 번째와 두 번째 녹색 펄스 사이의 지연 시간을 최대한 단축하여 서브 세컨드(sub-second) 시간 규모로 수행됩니다. 선택 사항으로, 처음에 DIC 이미지를 얻을 수 있으며, 두 색상의 이미지 분할을 통해 공여체 채널과 수용체 채널을 동시에 검출할 수 있습니다.수용체 여기 이미지는 T세포 시냅스 내 P HCS의 축적을 보여줍니다. 이 전처리 이미지는 pmcs의 존재를 확인시켜 주며, 이미 TCR 매개 PMHC 결합이 일어났음을 나타냅니다. 공여체 여기는 두 채널 모두에서 이미지를 생성합니다.에너지 전이가 FRET 수용체 채널로 일어나기 때문에 fed 공여체 채널의 신호 강도는 어느 정도 감소합니다. FRET 수용체 채널의 신호는 fed 공여체의 FRET 블리드스루(bleed-through)와 FRET 수용체의 교차 여기(cross excitation)로 구성됩니다. 어찌 되었든, 이 이미지는 분석에 사용되지 않습니다.본 프로토콜에서는 빠른 표백 펄스를 통해 모든 F 수용체 형광을 제거합니다. FRET 수용체 표백 후 F 공여체 이미지의 강도는 FRET 채널로의 강도 손실 없이 더 높은 수준으로 회복됩니다.다음의 FRET acceptor 기대값은 완전한 F acceptor 광퇴색을 검증합니다. 시냅스를 확대하여 FRET donor 회복량을 정량화하겠습니다. FRET acceptor와 관계없이 일정한 평균 배경 강도를 결정하십시오.광퇴색(Photobleaching)을 수행한 후, 시냅스와 대표적인 TCR 클러스터의 평균 강도를 결정합니다. 그다음 acceptor 제거 전후의 차이를 정규화하여 FRET 효율을 계산합니다. 본 예시에서는 시냅스 전체에 대해 16% FRET을, 대표 클러스터에 대해 26% FRET을 측정하였습니다.TCR 클러스터의 FRET 효율은 이후 TCR 점유도로 변환되며, 이는 2차원 시냅스 해리 상수 단일 분자 데이터를 생성합니다. 이는 단일 분자 FRET 실험에서 시냅스 TCR-펩타이드-MHC 결합의 역학을 추론하는 데 도움이 됩니다. 우리는 이전과 동일한 시약 및 라벨링 전략을 사용합니다.하지만 단일 TCR과 단일 펩타이드 MHC 사이의 상호작용을 실제로 관찰하고 있음을 보장하기 위해, 다음과 같은 기준을 충족하도록 설정하였습니다. 단일 분자 fre의 후보 이벤트는 단일 fre 수용체 또는 fre 공여체 분자와 일치해야 합니다. 본 연구에서는 관찰된 fre 이벤트의 단일 분자 특성을 검증하기 위해 단일 PMHC를 fre 수용체 분자로 사용하였으나, 그 반대의 논리 또한 적용 가능합니다.더 높은 파장의 버튼에 수용체를, 더 낮은 파장의 버튼에 공여체를 사용하는 것도 분명 하나의 방법입니다. 일반적으로 우리는 514nm 및 647nm 여기 광원을 사용하여 자극성 지질 층과 접촉하는 T 세포를 노출시키며, 최소 1ms의 시간 지연 후 공여체와 수용체 여기를 순차적이고 반복적으로 수행합니다. 이 지연 시간은 실험 요구 사항에 따라 조절할 수 있습니다.들뜸 후 밀리초 이내에 단일 염료 검출을 위해 충분히 강한 형광 신호를 얻으려면, 제곱센티미터당 1~5kW 범위의 높은 들뜸 전력 밀도를 적용해야 합니다. 광퇴색으로 인해, 가시적인 PMHC fret 수용체 분자의 수가 빠르게 감소하여, 제곱마이크론당 30개 이상의 라벨링된 PMCS가 포함된 이중층에서 단일 fret 수용체 형광 힘을 구별할 수 있는 수준이 됩니다. 전체 시간 지연이 42ms인 예가 여기에 제시되어 있습니다.빨간색 원으로 표시된 단일 FRET 이벤트가 두 번째와 세 번째 시점에서 관찰됩니다. 이는 초록색 원으로 표시된 단일 S5 분자와 공국소화(co-localize)됩니다. 이 예시에서 관찰 가능한 FRET 이벤트의 트레이스 길이는 2이며, some 128 traces의 표에 나타난 것처럼 더 많은 단일 분자 FRET 트레이스를 수집하십시오.다음으로, 초록색 숫자로 표시된 것처럼 트레이스의 보완 누적 합(complementary cumulative sum)을 계산하고, 이를 정규화하여 정규화된 값을 그래프로 나타낸 뒤 단일 지수 함수(mono exponential function)로 피팅합니다. 기대값은 1.5 timeframe보다 약간 더 큽니다. 이 값은 TCR 펩타이드, MHC 결합 및 광퇴색(photobleaching)에 따라 달라지므로, 이 두 가지 기여도를 구별하기 위해서는 최소 세 가지의 서로 다른 시간에 대해 기대값을 계산해야 합니다.이제 모든 기댓값을 각각의 시간 지연(time lag)에 대해 도식화하고, 표시된 수명 함수에 데이터 지점을 맞춥니다. 여기서 수명은 2.12 seconds이며, 광퇴색(PHOTOBLEACHING)에 대한 기댓값은 f Fred입니다. 여기에 표시되었고 앞서 더 자세히 설명한 것처럼, 허용 가능한 수준의 퇴색 후 도너(Donor) 회복을 통해 면역 시냅스(immunological synapse) 내에서 유효한 2차원 해리 상수를 몇 단계만으로 결정할 수 있습니다.여기서는 T-C-R-P-M-H-C 결합이 가장 두드러지게 나타나는 TCR 결합 및 TCR 클러스터에 분석 초점을 맞춥니다. 제시된 측정 결과에서 알 수 있듯이 F FRED 수득률은 상당한 차이를 보입니다. 개별 TCR 클러스터의 경우 다음과 같습니다.F fred의 곱에 비례 계수 C를 곱하면 TCR 점유율(TCR occupancy)이 산출됩니다. 이는 pMHC와 결합한 TCR의 수와 전체 TCR 수 사이의 비율을 나타내는 항입니다. C는 특정 fre 쌍 세트와 사용된 FRE 시스템에 대해 한 번 결정되어야 합니다. 이 발표의 마지막 부분에서, 예를 들어 TCR R 반응성 단일 사슬 항체 단편과 MHC 결합 펩타이드의 C 말단에 구체적으로 배치된 SI 3 및 SI 5를 포함하여 C를 결정하는 방법을 더 자세히 설명하겠습니다. 이는 약 2개의 시냅스적, 2차원 해리 상수를 TCR 점유율 A와 지질 이중층에 존재하는 pMHC의 초기 밀도로부터 계산하는 것과 같습니다.표시된 관계는 질량 작용 법칙에서 유도되었으며, 이 영상과 함께 제공되는 논문에 더 자세히 설명되어 있습니다. 본 예시에서 pmc의 초기 밀도는 제곱 마이크론당 30분자로 설정되었습니다. 이를 통해 T-세포 시냅스에서 효과적인 2D kd의 분포를 도출하였으며, 중앙값은 제곱 마이크론당 약 34분자로 나타났습니다.결합 속도(on rate) 분포는 시냅스의 2D KD 분포와 이에 해당하는 해리 속도(off rate)를 통해 계산할 수 있으며, 여기서 해리 속도는 24 °C에서 단일 분자 FRET 트레이스 분석을 통해 결정된 초당 0.41입니다. 중앙값은 분자당 초당 약 0.01 square micron입니다. 요약하자면, TCR과 peptide MHC 간의 FRET 측정은 C2에서의 반응 역학을 설명하는 모든 반응 속도 매개변수에 대한 종합적인 분석을 가능하게 합니다.이 방법론은 원칙적으로 세포 간 인식에 필수적일 수 있는 다른 수용체-리간드 상호작용 분석으로 일반화될 수 있습니다. 마지막으로, 지방 수율을 TCR 점유율로 변환하는 데 필요한 상수 C를 실험적으로 도출하는 방법을 논의합니다. 이 절차는 한 번만 수행하면 됩니다.결정된 상수 C는 동일한 형광체들이 적용된 동일한 FRET 시스템을 사용하는 모든 후속 실험에 활용될 수 있습니다. 이 절차에서 우리는 본질적으로 수용체 광퇴색 후 공여체 회복을 통해 측정된 개별 TCR 클러스터의 FRET 효율을 감작된 FRET 채널에서 검출된 해당 강도 값과 연결했습니다. 앞서 논의한 바와 같이, FRET 효율은 FRET 수용체 제거 전후의 배경 보정된 FRET 공여체 채널 이미지로부터 결정됩니다.감도 조절된 FRET 채널은 F 공여체 채널 및 X, Y 채널과 정렬되어야 하며 배경 신호에 대해 보정되어야 합니다. 여기에 표시된 것처럼 FRET 공여체 누출(bleed through) 및 FRET 수용체 교차 여기(cross excitation) 현상이 나타납니다. FRET 공여체 누출 및 FRET 수용체 교차 여기를 보정하는 방법에 대한 자세한 설명은 본 논문에 제공되어 있습니다.본 영상에 이어, 이제 각 TCR 클러스터에 대해 보정된 fret 이미지의 bug 신호와 그에 대응하는 보정된 fret 공여자 이미지의 신호 비율을 계산하십시오. 단일 fret 공여자와 단일 분자 fret 이벤트에 대한 보정된 평균 신호를 결정하고 그 비율을 계산합니다. 그 다음, 두 비율을 곱하여 TCR 점유율을 도출합니다.이제 개별 TCR 클러스터에 대해 결정된 fret 수율을 해당 TCR 점유율에 대해 도식화합니다. 그런 다음 여기에서 보여주는 바와 같이 선형 회귀를 통해 C를 결정합니다. 본 예시의 경우, 이는 약 2가 됩니다.이 영상을 시청한 후, 단분자 형광 현미경과 단백질 기능화 지질 이중층을 결합하여 PMHC와 TCR 사이의 시냅스 결합 역학을 측정하는 방법을 활용할 수 있게 될 것입니다. 단백질 생산, T-세포 표지 및 최종 FRET 측정을 포함한 모든 필수 단계가 논의되었습니다. 또한, T-세포 활성화 곡선과 FRET 값을 도출하는 이미지 분석 과정이 상세히 제시되었습니다.마지막으로, 동역학적 온-오프 속도(on off rates) 결정의 기초가 되는 방법론을 제시하였습니다. 원칙적으로 이와 유사한 접근 방식을 사용하여 다른 시냅스 수용체 리간드 상호작용을 결정할 수 있으나, 적절한 수정이 필요할 수 있습니다.

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

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연구

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생명공학

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TCR-pMHC 바인딩 측정

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