총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

본 절차의 전반적인 목적은 관련 바이오매스 변이체 간의 열화학적 전처리 및 효소 가수분해 저항성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 크기 조절, 분쇄 및 전분과 수용성 당의 추출을 통해 테스트용 바이오매스 샘플을 준비합니다. 두 번째 단계는 열화학적으로 호환되는 고처리량 반응기 플레이트에 바이오매스를 정밀하게 분주하는 것입니다.

시료를 증기 반응기에서 전처리합니다. 다음으로, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 가수분해하기 위해 표준 상용 셀룰라아제로 3일 동안 시료를 소화시킵니다. 마지막 단계는 GO pod 및 XDH 분석법을 사용하여 효소 가수분해 동안 방출된 글루코오스와 자일로오스를 정량하는 것입니다.

최종적으로, 고처리량 포도당 및 자일로스 정량 분석을 통해 시작 바이오매스 1g당 생성된 당의 g수로 샘플 간의 상대적인 당 방출량을 결정합니다. 벤치 스케일 전처리와 효소 가수분해와 같은 다른 벤치 스케일 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수백 또는 수천 개의 샘플을 동시에 처리할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 어떤 품종이나 변이체가 당 및 후속 생성물로의 전환에 더 적합한지와 같이 바이오매스 전환 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.

따라서 세포벽 생합성 경로에서 생성된 돌연변이의 구조적 화학적 변화를 스크리닝할 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 세포벽의 구조와 기능에 대한 이해로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 식물 세포벽의 난분해성에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 효소 활성 및 시너지 연구와 같은 바이오매스 전환의 다른 구성 요소에도 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 밀리그램 단위에서 동일하고 동시에 처리해야 하는 대규모의 바이오매스 변이체 샘플 세트가 포함되기 때문입니다. 따라서 전문적인 로봇 공학 및 장비가 필요합니다. 절차를 시작하기 위해, 바코드가 부착된 정전기 방지 봉투에 담긴 이전에 분쇄된 바이오매스 약 250 mg을 번호가 매겨진 티백으로 옮깁니다. 전분 제거 및 추출 과정에서 손실이 발생하지 않도록 끝부분이 바이오매스를 덮도록 주의하며 티백을 조심스럽게 말아 올립니다. 다음으로, 주석 코팅 구리 와이어를 사용하여 각 티백을 묶어 밀봉하고, 바코드가 부착된 각 샘플에 해당하는 티백 번호를 기록합니다.

미리 준비한 전분 제거 효소 용액 500 milliliters를 플라스틱 용기에 넣습니다. 그다음 배치 처리 프로토콜을 위해 버퍼 효소 용액에 티백 120개를 넣습니다. 셰이커에서 배양한 후, 전분이 제거된 바이오매스를 철저히 헹구고 수 리터의 탈이온수에서 30분 동안 담가 둡니다.

완충염을 제거하기 위해, 티백을 추출용 소클렛(Soxhlet) 컬럼에 넣습니다. 95% ethanol을 사용하여 소클렛 환류 장치를 설치하고, 24시간 동안 샘플을 추출합니다. 추출이 완료되면 티백을 풀어 건조된 바이오매스를 원래의 바코드가 부착된 용기에 되돌려 놓습니다.

정전기 방지 봉투에서 건조된 바이오매스 50 mg 이상을 바코드가 부착된 호퍼로 옮깁니다. 정확한 시료 추적을 위해 정전기 방지 봉투와 수신 호퍼의 바코드를 스캔합니다. 호퍼를 고체 칭량 로봇에 적재한 후, 로봇을 이용해 건조된 시료 5 mg을 내산성 스테인리스 스틸 용기에 칭량합니다.

96웰 플레이트에 각 샘플의 반복 시료 3개를 플레이트 전체에 분산 배치하여 국소적인 변동을 최소화합니다. 다음으로, 각 웰에 250 µL의 탈이온수를 추가하고 실리콘 접착제가 부착된 폴리테트라플루오로에틸렌(POLYTETRAFLUOROETHYLENE) 또는 PTFE 테이프로 플레이트를 밀봉합니다. 1/8인치 납땜 인두 팁을 사용하여 각 증기 포트의 PTFE 테이프를 뚫습니다.

각 플레이트에 대해, 플레이트 사이에 0.031 inch 두께의 유리 강화 PTFE 가스켓을 끼우고 적층 구조의 최상단과 최하단에 빈 플레이트를 배치한 후 플레이트들을 단단히 고정합니다. 180 °C로 설정된 증기 반응기를 사용하여 샘플을 17.5분 동안 전처리합니다. 처리가 완료되면, 탈이온수로 충진하여 반응기 플레이트를 50 °C까지 냉각합니다.

플레이트가 식으면 스윙 버킷 원심분리기로 원심분리합니다. 로터를 1700 GS에서 20분 동안 작동시킵니다. 그 다음 상단 필름을 제거합니다.

새 PTFE 테이프로 다시 밀봉한 후, 각 웰에 미리 준비한 8% 효소 스톡 용액 40 µL를 추가하고 밀봉된 플레이트를 마그네틱 플레이트 클램프에 고정합니다. 플레이트를 최소 15회 이상 부드럽게 반전시켜 샘플을 혼합하고 50 °C에서 70시간 동안 배양합니다. 배양 후, 반응 플레이트를 혼합하고 원심 분리합니다.

그 다음, 액체 핸들링 로봇을 사용하여 효소 연결 발색 분석법을 통해 포도당과 자일로스를 정량하는데, 자일로스에는 자일로스 탈수소효소(xylose dehydrogenase 또는 XDH)를, 포도당에는 포도당 산화효소와 과산화효소(glucose oxidase, peroxidase 또는 go pod)를 사용합니다. 데크에는 GO POD 및 XDH 시약 저장조, 희석용 물, 그리고 각 시약당 96채널 200 µL 팁 랙이 배치됩니다. 이 팁들은 여러 개의 반응 플레이트에 걸쳐 재사용됩니다.

데크에는 또한 수분 제거 및 당 표준물질 조제를 위한 일회용 200 µL 팁과 미리 제조된 당 표준물질이 포함되어 있습니다. 로봇은 보관 캐러셀의 HPLC 바이알로부터 투명 마이크로 타이터 플레이트 3개를 가져오는데, 하나는 가수분해 혼합물의 희석용이며, 나머지 두 개는 각각 XDH 및 GoPod 분석용입니다. 그리퍼는 이 4개의 플레이트를 모두 데크의 지정된 위치로 이동시킵니다.

반응기에서 희석 플레이트로, 그리고 희석 플레이트에서 XDH 및 go pod 플레이트로 옮기는 작업에 사용하기 위해 일회용 96채널 100 µL 팁을 캐러셀에서 데크로 가져옵니다. 가변 간격 8채널 피펫을 사용하여, 희석 플레이트로의 오염을 방지하기 위해 전처리 전 추가했던 물을 반응기 플레이트의 각 모서리에 있는 3개 웰에서 제거합니다. 이 12개 웰은 96채널 피펫팅 헤드를 사용하는 당 표준물질용으로 사용되기 때문입니다.

각 모서리의 팁 3개를 제거한 후, 희석 플레이트의 웰에 180 µL의 물을 첨가합니다. 팁을 교체한 후, 96 채널 피펫팅 헤드를 사용하여 XD, H 및 go pod 시약을 각각의 저장소에서 해당 분석 플레이트로 옮깁니다.

이 과정이 진행되는 동안, 희석 플레이트의 각 모서리에 있는 3개의 웰에 당 표준물을 추가합니다. 8채널 피펫팅 헤드를 사용하여 더 작은 팁으로 교체한 후, 96채널 피펫팅 헤드를 이용해 가수분해 상층액 20 µL를 희석 플레이트로 옮기고, 플레이트를 3회 혼합합니다. 팁이 바이오매스 입자로 인해 오염되는 것을 방지하기 위해, 액체 표면 근처에서 샘플을 흡입해야 합니다.

혼합 후 20 µL를 순차적으로 옮깁니다. 96채널 피펫팅 헤드를 사용하여 XDH 및 go pod 플레이트로 옮깁니다. 각 샘플을 trier로 혼합한 후, 샘플 팁 리액터 및 희석 플레이트는 캐러셀의 폐기 랙으로 되돌리고, XDH 및 go pod 플레이트는 별도의 캐러셀 랙으로 옮겨 자외선-가시광선(UV-vis) 96-웰 플레이트 리더를 사용하는 분광광도계로 측정하기 전 한 시간 동안 방치합니다.

측정 파장을 510 nanometers로 설정하고 시약 공시료(reagent blank) 대비 흡광도를 기록합니다. 그 후, 플레이트 리더의 측정 파장을 340 nanometers로 설정하고 소형 스패튤라를 사용하여 흡광도를 기록합니다. 준비된 바이오매스 약 4 mg을 질량 분석기 오토샘플러용 80 µL 스테인리스 스틸 컵에 분주합니다.

표준 펀치를 사용하여 바인더가 없는 type ad 유리 섬유 시트로부터 유리 필터 디스크를 수동으로 제작하십시오. 핀셋을 사용하여 오토샘플러 랙에 샘플을 로드하며, 시간에 따른 분광계 드리프트로 인한 편향을 방지하기 위해 샘플을 컵에 무작위로 로드하십시오. 캘리브레이션을 수행하고 질량 분석기에 적절한 파라미터를 입력한 후, 데이터 수집을 시작하고 배경 스펙트럼 수집에 충분한 데이터를 얻을 때까지 최소 60초 동안 기다리십시오. 마지막으로 0.9 liters per minute의 헬륨 운반 가스 유량을 사용하여 자동 오토샘플러법을 시작하십시오.

경향성의 한 예로 태평양 북서부 지역에서 샘플링한 포플러 천연 변이체 755종의 난분해성에 대한 조사가 있습니다. 결과에 따르면 시린지 대 길 비율이 상승함에 따라 난분해성이 감소하며, 비율이 약 2에 도달하면 난분해성 개선 수준이 평탄해집니다. PT four CL one 유전자가 하향 조절된 부분에서 이상치가 관찰될 수 있습니다.

포플러의 경우, 스크리닝한 수백 개의 품종 중 일부에서 당 방출 감소가 확인되어 난분해성 성분이 분명하게 증가한 것으로 나타났습니다. 여러 지역에서 재배되고 다양한 성장 조건 하에 수확된 서로 다른 밀 짚 품종들은 위의 변수들의 조합에 따라 20개의 뚜렷한 집단으로 구분되었습니다. 이러한 샘플 세트들은 쉽게 구분이 가능하며, 긍정적 변수와 부정적 변수를 나타냅니다.

난분해성 물질의 열분해 시, 세포벽 조성의 변화를 평가하기 위해 분자 빔 질량 분석법을 사용할 수 있습니다. 질량 분석 파편들은 서로 다른 리그닌 단량체로 할당됩니다. 리그닌 함량이 높은 시료와 탄수화물 함량이 높은 시료를 비교하면, 스펙트럼 데이터의 차이가 분명하게 나타납니다.

질량 분석 데이터와 주성분 분석(principle component analysis)을 결합하여 사용하는 방법을 여기서 설명합니다. 주성분 부하량(loadings) 도표는 점수 분류(scores classification) 도표에서 어떤 화학적 특성이 설명되고 있는지 식별하는 데 도움을 줄 뿐만 아니라, 샘플 군집 간에 어떤 특성이 변화하고 있는지를 규명하는 데 유용합니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면, 매주 수천 개의 샘플을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 가능한 한 일관성을 유지하고, 연관된 세트 내의 샘플들만 비교하는 것이 중요합니다.

따라서 이 기술의 개발 이후, 연구자들은 이온성 액체 및 알칼리 전처리와 같은 방법을 사용하여 식물 세포벽의 난분해성에 관한 고처리량 스크리닝 방법 및 기타 분야 연구를 수행할 수 있는 기틀을 마련하게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 입자 크기 감소 및 추출, 열화학적 전처리 및 효소 가수분해를 통해 난분해성의 차이를 확인하기 위해 마이크로 스케일에서 대량의 바이오매스 샘플 세트를 적절하게 준비, 취급 및 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 고압, 증기 및 자동화 장비를 사용하는 것은 매우 위험하므로, 이러한 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장구를 착용하고 모든 장비에 안전 인터록을 설정하는 등 모든 안전 예방 조치를 취해야 함을 유념하시기 바랍니다.