Name: 16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 배우세요 MALDI-TOF 질량분석법과 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 활용한 희귀 세균성 병원체의 신속하고 정확한 동정 방법을. Myroides odoratimimus 식별 사례를 통해 임상 미생물학 진단 기술을 향상시킬 수 있습니다.

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저자는 Enno Jacobs 교수의 지속적인 지원에 감사드립니다.

세균 DNA의 추출 (1) <ol><li> PBS 용액의 조제 <ol><li> 1.65 g을 플라스크에 2 HPO 4 × 2H 2 O, 0.22 g의의 NaH 2 PO 4 × 2H 2 O 및 8.80 g의 NaCl 나 무게 1,000 ML의 최종 볼륨에 증류수로 채운다. 7.4 pH를 조정합니다. 최종 사용하기 위해 박테리아 방지 (0.22 μm의) 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> DNA의 추출 그람 음성균 <ol><li> 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것. </li><li> 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고 순도를 확인하고 문화 (49)에 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 단일 세균성 식민지를 선택하고 1 ml의 PBS 용액을 포함하는 멸균 2.0 ml의 반응 관에 1 μl의 단일 사용 접종 루프로 전송합니다. </li><li> thermomix이 현탁액을 품어10 분 동안 95 ° C에서 어. 부화 후, 실온으로 냉각 세균 추출물 (용해 된 DNA를 포함)을하자 하나 더 사용 (그림 1a)에 대한 -20 ° C에서 증폭 또는 저장소에 대해 직접 사용합니다. </li></ol></li><li> 의 DNA 추출 그람 양성 박테리아 <ol><li> 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것. 문화의 morphotype을 확인하기 위해 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고, 문화의 순도를 확인하기에 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 멸균 1 μL를 접종 루프를 단일 박테리아 콜로니를 선택하고, 2.0 ml의 반응 튜브 내의 500 ㎕의 PBS 용액을 중지. </li><li> 500 ㎕의 유리 구슬을 추가하고 5 분 동안, 최대 주파수 및 진폭 (50 Hz에서)에서 작동 진동 균질에 튜브를 전송합니다. 1.0 mm 직경의 유리 구슬을 사용하여박테리아의 세포벽을 파괴한다. </li><li> 95 ° C에서 10 분 동안이 튜브를 부화 상온이. 더 사용하기 위해 -20 ° C에서 PCR 반응 또는 저장소 추출물 직접 사용합니다. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA의 PCR <ol><li> 증폭 프라이머의 제조 <ol><li> 프라이머의 TPU1를 사용하여 (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) 역방향 프라이머로 정방향 프라이머 및 RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;)와 같은 25. , DNase의 및 RNAse가없는 물과 프라이머 원액을 준비 100 pmol의 / μL (100 μM)의 농도가 10 pmol의 / μL에서 작업 솔루션에 추가로 희석. -20 ° C에서 프라이머 재고 및 작업 용액을 저장하거나 직접 사용합니다. </li></ol></li><li> PCR 반응 믹스의 제조 <ol><li> 피펫 1 ㎕의 각 프라이머, 1 μL의의 dNTP 믹스 (100 mM)을 상기 DNA 추출물 2.5 ㎕의 25 mM의 ㎎을 함유하는 5 μL 배 PCR 완충액 (멸균 200 ㎕의 반응 튜브에 CL 2)의 Taq 중합 효소 μL 0.25 (5 개 / μL) 및 39.25 μL DNAse-과의 RNAse 무료 PCR 물. </li></ol></li><li> PCR 프로토콜 <ol><li> 다음과 같이 내장 된 PCR 프로그램을 시작 : 첫째, DNA 형성 촉매 - 중합 효소를 활성화 할 필요가 5 분 동안 95 ° C에서 초기 배양 단계. 둘째, 증폭 35 사이클, 1 분을 함유. 95 ° C, 1 분에서 변성 단계. 50 ℃에서의 프라이머 어닐링 단계, 그리고 72 ℃에서 1.5 분의 프라이머 연장 단계를 포함한다. 셋째, 72 ° C에서 10 분 동안 최종 연장. 마지막으로, PCR 반응은 4 ℃로 냉각시켰다. 참고 : 황색 포도상 구균 및 H 2 O는 긍정적이고 부정적인 제어를 제공 (그림 1b). </li><li> 열 순환기에서 PCR 반응 혼합물이 포함 된 튜브를 배치하고 프로그램을 시작한다. </li></ol></li><li> PCR 산물의 정제 주 : PCR 생성물을 정제하기 위해, 몇몇 프로토콜에서 어느효소 기반 또는 실리카 흡착 매트릭스가 사용될 수있다. 여기에 사용되는 단일 단계 PCR 정리는 두 가수 분해 효소 반응을 이용합니다. 엑소 뉴 클레아 제 I (출 I)가 단일 가닥 DNA를 제거하는 동안, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP)는 비법의 dNTPs를 가수 분해. 세탁 - - 낮은 소금 용출 사이클 두 번째 절차는 높은 염이 빠른 바인딩 실리카 막 흡착 기술을 기반으로합니다. <ol><li> 25 ㎕의 PCR 생성물에 엑소 I 및 SAP 모두를 포함하는 효소 혼합물을 1.5 μL를 추가 철저히 혼합하고 80 ° C에서 15 분,이어서 37 ℃에서 처음 15 분의 간단한 프로토콜을 적용하는 열 순환기로 옮긴다. -20 ° C에서 정제 된 PCR 제품 중 하나를 저장하거나 PCR을 라벨에 대한 대상으로 직접 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. DNA 아가 로스 젤 전기 영동 <ol><li> 영동 완충액 (TBE 버퍼)의 제조 <ol><li> (10 54.0 g (445 mM)을 TRIS베이스, 27.5 g (445 밀리미터) 붕산과 0.5 M EDTA의 20 ㎖를 적정mM)을 플라스크에 수산화 나트륨으로 pH 8.0 용액을 1000 ml의 총 부피를 증류수로 채운다. 그런 다음 전기 증류수 (0.5 배 TBE)이 5 배 버퍼 1:10 희석. </li></ol></li><li> 적하 버퍼의 준비 <ol><li> 250 블루 mg을 브로 모 페놀 250 mg의 크실렌 cyanol의 FF와 플라스크에 polysucrose (재료 표)의 15g을 섞는다. 그런 다음 100 ㎖의 전체 부피의 0.5 배 TBE 완충액으로 채운다. 추가 사용에 대한 -20 ° C에서로드 1 ml의 부분에 염료 및 저장을 나누어지는. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 캐스팅 <ol><li> (w / v) 아가로 오스 겔을 2 %를 제조 아가 플라스크 내의을 300ml의 0.5X TBE 완충액 (3.1.1 절 참조)에 6g 표준 전기 계량. 이어서 아가 로스를 완전히 용해 될 때까지 가열하는 전자 레인지에 가까운 비등점 아가 혼합물을 넣고 용액을 명확 나타난다. </li><li> 용융 아가로 오스를 충분히 냉각하자 1 %의 10 μl를 추가 에티 디움 브로마이드 스톡 SOLU (/ V w)기. 캐스트에 솔루션을 붓고 캐스트에서 (30 우물을 허용) 겔 빗 놓습니다. 겔이 완전히 응고 될 때 빗살을 제거하고 0.5 배의 TBE 버퍼를 포함하는 전기 영동 챔버로 겔을 넣어. 참고 : 에티 디움 브로마이드는 독성 및 돌연변이입니다. 따라서이주의를 처리해야합니다. 니트릴 장갑을 사용하는 것이 좋습니다. 무독성 대안으로 사용할 수있는 다른 인터 핵산 얼룩이있다. </li></ol></li><li> PCR 산물의 아가로 스겔 전기 영동 주 : PCR 증폭 산물의 정확한 크기를 확인하고, 정제 된 PCR 생성물을 아가 로스 겔에서 분리 된 DNA의 농도를 추정하기 위해. <ol><li> 피펫 2 PCR 반응 관 내로 로딩 완충액 μL 및 PCR 생성물 8 μL를 추가한다. 겔의 우물에이 혼합물을 피펫. PCR 산물의 크기를 추정하기 위해 별도의 웰의 분자량 크기 마커 (DNA 사다리) 8 μL를 추가한다. </li><li> 대다일정 10 V / cm에서의 전압은 브로 모 페놀 블루 마커 약 ¾ 겔의 전체 길이에 도달하자마자 전기 영동을 멈춘다. 자외선 - transilluminator가 (파장 302 나노 미터)를 사용하여 분리 된 PCR 단편을 가시화하고, 겔 문서 시스템을 사용하여 기록. DNA의 사다리와 시각적 인 비교에 의해 DNA의 양을 추정한다. 라벨 PCR을위한 대상으로 약 10 NG를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 생거 시퀀싱 <ol><li> 사이클 시퀀싱 PCR 참고 : 시판 키트 (재료 표)를 사용하여 10 ㎕의 반응에서 PCR 레이블링을 수행한다. <ol><li> 5 배 반응 mastermix의 2 μL의 DNA 준비의 2 μL, TPU1 또는 RTU4 작업 용액 (10 pmol의 / μL) 및 DNase의 4.5 μL 및 RNAse가없는 물 1.5 μl를 추가합니다. </li><li> 열 순환기이 시퀀싱 반응 혼합물을 넣고 다른 PCR을 실행합니다. 총 공정은 25 사이클 (96 ° C 변성 단계 이루어지는10 초), 열처리 공정 (45-60 ° C, 5 초) 및 확장 단계 (60 ℃, 2 분). 마지막으로, 4 ° C에서 반응을 냉각. </li></ol></li><li> 시퀀싱 반응의 정화 <ol><li> PCR 정화 (자료 표)에 대한 상업 스핀 열을 사용하여 라벨 반응 혼합물을 정제. </li><li> 예비 수화 겔 - 여과 매트릭스 상 시퀀싱 반응을 10 μl의 하중을 3 분 동안 750 XG에서 원심 분리 공정을 수행한다. 주 : 비 통합 염료 종결이 겔 매트릭스에 유지되는 절차의 사용에 의해. </li><li> 그런 다음 진공 농축기에서 수성 용출액을 건조. 40 ° C에서 20 분 30 2,500 XG에 원심 분리기 건조를 완료합니다. </li><li> 높은 탈 포름 아미드 10 ㎕를 다음 2 분 동안 90 ℃에서 변성과 얼음의 혼합물을 냉각 추가합니다. 피펫 96 웰 μl를 접시에 변성 샘플 10 μL. 분석이 경우 -20 ℃에서 건조 및 세정 PCR 생성물을 보관나중에 수행 될 수있다. </li></ol></li><li> 16S rRNA의 유전자 시퀀싱 및 DNA 서열 분석 참고 : 자동 시퀀서 (자료 표)에 서열 분석을 수행합니다. 여기서 사용 된 시퀀서는 액상 중합체 (67) (도 1C)와 (50cm 4 모세관 배열)을 동시에 4 샘플을 분석하는 자동 형광 계 모세관 전기 영동 시스템이다. <ol><li> 시퀀서의 미세 적정 플레이트를 놓습니다. 2 배치로 샘플 시트 (판 레코드)를 작성, 저장 1에 주어진 단계에 따라 시퀀싱 실행 / 분석을 시작합니다. 참고 : 시퀀스 실행의 지속 시간이 2 시간이고, 800에서 1,000 bp의 데이터를 제공한다. </li><li> 시퀀싱 분석 소프트웨어 (자료 표)를 엽니 다. 시퀀스 데이터는 텍스트 파일 (.SEQ) 및 품질 값 (QV)를 포함하는 electropherogram을 포함하는 파일로 주어진다 (.ab1). 참고 : 기본 통화는 당 자동적으로시퀀싱 분석 소프트웨어에 의해 형성된 하부 electropherogram 육안으로 판정한다 (예를 들어, 피크 높이, 피크 분리) 시퀀스 전에 추가 애플리케이션에 사용된다. </li><li> NCBI의 노이즈 감소 데이터베이스 이용한 BLAST 알고리즘 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)에 저장된 DNA 서열 파일을 비교한다. </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS 참고 : 질량 분석기는 337 nm의 N 2 레이저를 사용하고 특정 제어 소프트웨어 (자료 표)에 의해 운영되고 있습니다. 스펙트럼은 선형 모드와 2,000 만에 다가 덮여 사이의 질량 범위에 기록됩니다. 샘플에 대한 점수의 데이터 해석 및 할당 분석 소프트웨어 (재료 표) (도 1D)에 의해 실시간으로 수행된다. <ol><li> MALDI-TOF MS 분석을위한 박테리아의 준비 <ol><li> 골에 (예를 들어, Myroides odoratimimus) 관심있는 박테리아를 성장세균 균주 (도 2a)에 따라 18 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 5 % 말 혈액을 함유 umbia 혈액 한천. 문화의 조사에서 유기체의 morphotype뿐만 아니라 순도를 확인하는 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 96 웰 스틸 타겟 잘 단일 박테리아 콜로니를 전송하는 나무 이쑤시개를 사용하여 (도 2b 및도 2c). 스팟 1 철강 대상에 공기 건조 유기체의 상단에 70 % 포름산 ㎕의 약 2 ~ 3 분 동안 건조 둡니다. </li><li> 이어서, 유기 용매 (50 % 아세토 니트릴, 2.5 % 트리 플루오로 아세트산, 47.5 % H 2 O) 50 ㎎ / ㎖의 CHCA (α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산)를 포함하는, 1 ㎕의 매트릭스 용액 스폿을 오버레이. 주 : (플레이트 제조 방법)에 산 오버레이 방법은 질량 스펙트럼의 품질을 개선하는데 사용될 수있다. 그것은 그람 양성 세균에 대한 것을 밝혀졌다 이러한 &quot;산 공격은&quot;점수 버지니아 증가측정 된 스펙트럼 (45)의 역병. 주 : 또는 자동화 된 샘플 준비 시스템 (재료 표)하는 제 1 건조 사이클 후 1 ㎕의 70 % 포름산 용액과의 접촉 프리 스폿, 1 ㎕의 매트릭스 용액을 박테리아 스미어에 적용 사용될 수있다. 샘플은 60 % 상대 습도에서 표준 조건하에 건조하고, 분석에 사용할 준비가되어있다. </li><li> 매트릭스 스미어는 후드에서 약 5 분 동안 다시 자연 건조 겹쳐 보자. 적용 행렬이 세균 도말 이제 많은 시간 동안 안정하다. 참고 : 매트릭스없이 세균성 얼룩 때문에 단백질 분해에 안정되지 않을 수 있습니다. </li></ol></li><li> MALDI-TOF MS 분석을 수행 <ol><li> 샘플 소개 <ol><li> 우리 MMIS (재료 표)의 제어 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 악기의 IN / OUT 버튼을 눌러 질량 분광계의 샘플 로딩 포트 통기. </li><li> 클릭 후로드 포트를 열고 건조 된 세균 도말 플러스 매트릭스와 MALDI-TOF MS의 목표 판을 삽입합니다. </li><li> 포트를 닫고 다시 대피. 진공을 관찰하고 도달 할 때 4.5 × 10 -6 mbar에서 측정을 시작합니다. </li></ol></li><li> 샘플 분석 <ol><li> 우리 MMIS (재료 표)의 분석 소프트웨어를 열고 &#39;파일&#39;메뉴를 클릭합니다. &quot;새 분류&quot;새 창 &quot;MALDI의 biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;를 선택 열립니다. 프로젝트 이름 &quot;필드에, Myroides 측정 project_1&quot;예를 들어, 프로젝트 이름을 입력합니다 &quot;하고 버튼을 눌러&quot;새 프로젝트 &quot;라는 이름의 새 대화 상자에서.&quot;새 &quot;를 체크 프로젝트 이름과 버튼을 눌러 계속 진행&quot;OK &quot;를. </li><li> 은 &quot;MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;에서 열린 &quot;분석 배치&quot;창을 관찰합니다. 선택 대상 위치 (예를 들어, A1, A2, A3 ...), 마우스 오른쪽 CLICK 선택된 (파란색 사각형으로 표시) 위치는 &quot;샘플을 추가&quot;를 선택합니다. 샘플 이름, 샘플 ID 및 선택적 주석에서 자동으로 열립니다 테이블 뷰 유형에. 계속 버튼 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;에서 열린 &quot;선택 MALDI의 biotyper 방법&quot;창을 관찰합니다. 에서 &quot;브루 커 분류&quot;, &quot;분류 나무에서 MSP가&quot;를 선택하고 계속 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;에서 열린 &quot;프로젝트 요약&quot;창을 관찰합니다. 실제 분류 프로젝트 위에서 주어진 삽입 된 항목을 확인합니다. 버튼 &quot;마침&quot;을 눌러 실행 분류를 시작합니다 (그림 2D를 - F). 적절한 진공에 도달하면 측정이 자동으로 시작됩니다. </li><li> 측정이 성공적으로 완료 될 때까지 분류 실행하십시오. t에서 결과 테이블을보기그는 &quot;MALDI Biotyper 실시간 분류 프로젝트 Myroides 측정 project_1&quot;메뉴 &quot;보기&quot;를 열고 &quot;결과&quot;를 클릭합니다. </li><li> 기본 웹 브라우저에서 HTML 파일로 &quot;브루 커 달 토닉 MALDI Biotyper 분류 결과&quot;를 볼 수 있습니다. 인쇄하고 결과를 저장합니다. </li></ol></li><li> 계측기 교정 및 장비 검증 주간 (악기 자체 테스트)를 수행하기 위해 분석을 샘플링 매일 전에 테스트 표준을 측정합니다. 주 : MALDI-TOF 측정 스펙트럼 중은 분석 소프트웨어 (재료 표)에 의해 실시간으로 분석한다. 각각의 점수와 함께 10 종의 목록이 주어진다 및보고를위한 실험실 정보 시스템 (LIS)로 공급된다. </li><li> 비판적으로 MALDI-TOF MS 결과 (대표 결과를 참조)는, 적절한 경우, 그러한에 필요한, ​​그람 염색 경우 biochemical- 및 항생제 감수성 프로필 또는 16S rRNA 유전자 염기 서열과 같은 다른 테스트를 포함 평가미생물 학적 보고서 박테리아 종을 지정. </li></ol></li></ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 서열은 모두 다른 박테리아의 다수를 식별 할 수있는 가능성을 제공한다. MALDI-TOF MS는 처리하고 세균 질량 스펙트럼의 대형 데이터베이스를 사용할 수있는 용이 한 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 이유로, MALDI-TOF MS 희귀 세균성 병원균 17,20,39,51 집중 스크리닝 연구를 수행하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 방법이다. 다른 표현형 식별 방법, 셍 등. 입증 비용 효율성 및 MALDI-TOF MS 59 탄의 속도로 MALDI-TOF MS를 비교하는 전향 적 연구에서 등. 자신의 실험실 환경에서 박테리아 식별을위한 시약과 노동 비용의 감소를보고 매년 62 56.9 %로. 이러한 비용 절감은 Gaillot 등의 등의 메모에 의해 지원된다. (28) ...

일상적인 진단에 드문 병원체의 안전 확인은 고전 문화와 생화학 적 방법이 복잡하고 때로는 의심 있다는 사실에 의해 방해된다. 또한, 진단 미생물학 연구소는 자동화 된 시스템의 사용을 필요로 매일 수천에 수백에 이르는 병원균 다수, 처리한다. 높은 일일 처리량의 관리뿐만 아니라, 박테리아 종의 정확한 식별은 필요하다. 그들은 자신의 항균제 감수성 패턴에 차이가 있으므로 올바른 식별 적절한 항생제를 선택하는 중요한 정보 (예를 들어, 엔테로 종., 된 Acinetobacter 종.) 12,43와 임상의를 제공하기 때문에이 보증합니다. 자동 미생물 식별 시스템 (AMIS)는 박테리아 균주의 대사 특성을 특성화하기 위해 효소 반응의 표준 세트를 적용 <sup&gt; 13,15,16,26,27. 이러한 시스템에 사용되는 카트리지는 다양한 생화학 적 반응의 다수, 예를 들어, 52이 연구에 사용 된 AMI의 GN 카드 (47) 만 세균 제한된 전략이 허가 보안 ID를 이용하더라도. 또한, 데이터베이스, 고급 전문가 시스템은 명확 의학적 중요성 13,15,16,36의 관련성 관련성 세균의 검출에 초점을 맞추고있다. 널리 실험실에서 사용되는 두 개의 추가 시스템은 또한 박테리아 식별이 생화학 적 방법을 적용 할 수 있습니다. 종 (35) 수준에서 3 차 AMI를 단지 82.4 %의 식별 정확도를 갖는다 최근의 연구는 본 연구에서 사용 된 AMI와 경쟁 온 (93.7 %는 각각 93.0 %) 사이의 비교 식별의 정확도를 증명한다. 이러한 불일치는 기본 식별 데이터 참조, 키트 및 소프트웨어, 메타 보의 차이 버전의 품질에 의해 설명 될 수있다lism 및 기술 인력 35, 36의 능력. 두 자동화 된 MALDI-TOF MS 시스템 (MALDI-TOF 미생물 식별 시스템, MMIS)이 주로 사용된다. 이 시스템은 단백질 지문 질량 스펙트럼에 기초한 박테리아 종의 다수의 검출을 허용한다. 예를 들어, 사용 된 MMIS의 데이터베이스는 6000 참조 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 질량 분석을 기반으로 식별 시스템은 희귀 병원균 11,48,51를 포함하는 미생물의 큰 다양성의 빠르고 안정적인 검출을 제공합니다. 지금까지 몇 직접적인 비교는 본 연구에서 사용 된 MMIS와 경쟁 19,33 사이에 사용할 수 있습니다. Daek 따르면 외. 두 시스템 식별 정확도 유사한 높은 속도를 제공하지만, 본 연구에 사용 된 MMIS 종 식별 19보다 안정적인 것으로 보인다. 마찬가지로, 분자 기술은 또한 잘 보존하지만 주소 지정 고유 한 유전자 ( <em&gt; 예를 들어, 16S rDNA의 또는 rpoB)는 명확한 종 식별 3,22,61을 허용합니다. 이들 중에서, 16S rDNA의 때문에 모든 세균 (34)의 존재에 가장 널리 사용되는 하우스 키핑 유전자이다. 그 기능은 생물 정보학 14, 34에 적합 할만큼 충분히 긴 대략 1,500 염기쌍으로 변경하고 마지막 유지된다. 많은 연구자들은 박테리아 식별 (21)에 대해 &quot;금 표준&quot;등의 16S rRNA 유전자 분석을 간주한다. 이것은 몇몇 실험실 희귀하거나 새로운 박테리아 14, 34 식별하기위한 날짜 DNA-DNA 혼성화 기술을 사용한다는 사실에 기인한다. 또한, 더 많은 데이터베이스는 16S rRNA 유전자 분석 (50)에 이용 될 수 있습니다. 그러나, 16S rDNA의 기반 탐지 시스템은 표준 PCR 프로토콜에 비해 제한된 감도를 가지고 있음을 고려해야한다. 또한, 분자 접근 방식은 많은 시간이 소요, 정교하고 고도로 훈련 된 직원뿐만 아니라 필요전용 실험실 시설이며, 따라서 쉽게 일상적인 진단 (55)에 구현되지. 또한, 세균의 식별 중 적어도 두 가지 방법들의 조합이 고정밀 스트레인 식별에 이르게하는 것이 밝혀졌다. MALDI-TOF MS 및 16S rDNA 염기 서열의 결합은 높은 정밀도로 다른 세균 종의 다수의 식별을 허용한다. 최근 MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 분석의 조합은 역학적 질문 희귀 병원균 세균성 56 공부 식별을 위해 제시되었다.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, HPLC 등급 물, 1 L</td><td>시그마 - Aldrich Chemie, M &uuml; nchen, Germany</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>85600</td><td>Oscillating homogenizer</td></tr><tr><td>Glass-beads 1.0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg,</td><td>Germany 2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1,000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&acute;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, 독일 울름&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>리버스 프라이머 RTU4 (5&acute;-TAC, CAG, GGT, ATC, TAA, TCC, TGT, T-3&acute;)</td><td>biomers.net, 독일 울름&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>마스터사이클러&nbsp;</td><td>에펜도르프, 함부르크, 독일</td><td>-&nbsp;</td><td>열원세포(Thermocylcer)</td></tr><tr><td>반응관 1.5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>72,692</td><td></td></tr><tr><td>반응관 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, 독일</td><td>72,693,005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrip</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, 독일</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, 함부르크, 독일</td><td>-</td><td>마이크로파</td></tr><tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, 벨기에</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루 (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, 독일</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 시아놀 FF (10g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, 독일</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Germany-Ethidium</td><td></td></tr> <tr><td>bromide solution 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen, 독일</td><td>-</td><td>겔 문서화 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 반응)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 (10x) EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di 포름아미드 (25 ml)</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>-</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 96-웰 반응 플레이트(바코드 포함)</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 유전자 분석기, 플레이트 베이스 96-well</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 유전자 분석기, 플레이트 리테이너 96-well</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 유전자 분석기, 웰 plate septa</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 유전자 분석기, POP-7 폴리머, 7 ml</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 유전자 분석기, 4-모세관 어레이, 50cm</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>염기서열 분석 소프트웨어 5.4</td><td>Life Technologies, 다름슈타트, 독일</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, 브레멘, 독일</td><td>-</td><td>우리의 mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; 르팅겐, 독일&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Germany-Device</td> <td>control software</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Germany-Analysis</td> <td>software</td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, 브레멘, 독일</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>펩타이드 보정 표준 II</td><td>Bruker Daltonik, 브레멘, 독일</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 타겟 광택 스틸</td><td>Bruker Daltonik, 브레멘, 독일</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 바이오타이퍼 갤럭시&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, 브레멘, 독일</td><td>부품 번호 1836007&nbsp;</td><td>자동 시료 전처리 시스템</td></tr><tr><td>비텍 2&nbsp;</td><td>바이오M&에아큐트; rieux, N&uuml; 르팅겐, 독일&nbsp;</td><td></td><td>우리의 aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Germany</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade; Automated Microbiology System</td><td>BD, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><tr><td>포도상구균&nbsp;subsp.&nbsp; 아우레우스&nbsp; 로젠바흐 (ATCC&reg; &nbsp; 25923&거래;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France</td><td></td><td>PCR에 대한 긍정적인 대조군&nbsp;</td></tr></tbody></table>

16s rrna의 유전자 시퀀싱과 maldi-tof ms에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

특히 면역 환자에서 심각한 감염을 일으킬 것으로보고되고 있으므로, 충분히 설명 된 희귀 세균성 병원체가 있습니다. 대부분의 경우 보고서로 게시 대부분의 경우 단지 몇 데이터,에서, 감염원과 같은 병원균의 역할을 조사 할 수 있습니다. 따라서, 병원성 미생물의 특성을 명확하게하기 위해, 이들 박테리아의 다수를 포함 역학 조사를 수행 할 필요가있다. 균주의 확인은, 그들이 루틴 진단 (견고성) 취급하기 쉽고 경제적이어야 유효 명명법에 따른 정확성을 가지며, 이들은 비교 생성 할 : 이러한 감시 연구에서 사용되는 방법은 다음 조건을 만족해야 다른 실험실 중 결과. 일반적으로, 일상적인 환경에서 박테리아 균주를 식별하기위한 세 가지 전략이있다 같습니다 biochemica의 특성 1) 표현형 식별박테리아 L 및 대사 특성 2) 신규 프로테옴 기반 접근법으로서 16S rRNA 유전자 서열 3) 질량 스펙트럼 분자 기법. 질량 분석 및 분자 접근법 박테리아 종의 많은 종류를 식별하기위한 가장 유망한 도구이기 때문에, 이러한 두 가지 방법이 설명된다. 이러한 기술을 사용하여 진행 제한 및 잠재적 인 문제가 논의된다.

MALDI-TOF MS는 소설, 미생물 일상적인 진단을위한 신속하고 저렴한 방법입니다. MALDI-TOF MS에 의해 세균 종 식별이 주로 리보솜 단백질뿐만 아니라 다른 &quot;환경 조건에 의해 최소한의 정도에 영향을 집 유지 기능을 가진 매우 보존 된 단백질&quot;로 구성 스펙트럼을 생산하는이 MMIS의 17 국지적 인 데이터베이스는 기준 스펙트럼의 큰 집합을 포함 거의 임상 분리에서 찾을 수없는 경우에도 박테리아가 안전하게 7,56,57를 식별 할 수 있습니다. 스코어 값은 식별 된 종의 신뢰성을 나타낸다. 2.300 위의 점수는 가능성이 매우 높은 종 식별을 나타내고, 2.000과 2.300 사이의 점수가 보안 종 식별을 표시하는 가능성 종 식별을위한 1.700과 2.000 스탠드 사이의 점수와 1.700 이하의 점수가 아닌 신뢰할 수있다. 둘 이상의 종의 경우 2.000 추가 TES 상기 점수로 식별되고TS는 적용 ...

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

본 MALDI-TOF 질량 분석법 프로토콜의 전반적인 목표는 신속하고 비용 효율적인 절차를 통해 희귀 병원균의 타이핑을 개선하는 것입니다. 이 방법은 진단 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 희귀 세균성 병원균의 신속한 확인을 가능하게 합니다. 오늘은 odoratimimus 및 Myroides 속 세균에 대해 다루고자 합니다.해당 방법을 시연하고 결과 해석에 대해 논의하고자 합니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 개인은 박테리아 전이, 지표를 이용한 오버레이 및 결과 해석에 기술적 숙련도와 미생물학적 전문 지식이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 병원에 입원한 환자가 myroides odoratimus에 의한 당뇨병성 족부 감염으로 고통받는 것을 보고, 희귀 박테리아를 선별하기 위해 MALDI-TOF MS를 사용한다는 아이디어를 처음 갖게 되었습니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 박테리아 DNA 추출, 16S 리보솜 DNA PCR 및 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 수행하여 본 프로토콜을 시작하십시오. 나무 이쑤시개를 사용하여 단일 박테리아 콜로니를 96-웰 스틸 타겟의 웰로 옮깁니다. 스틸 타겟 위에서 공기 건조된 미생물 위에 70% formic acid 1 µL를 점적하고, 약 2~3분 동안 건조시킵니다.50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid, 47.5% water로 구성된 유기 용매에 50 mg/ml의 CHCA가 포함된 매트릭스 용액 1 µL를 스팟 위에 덮어줍니다. 후드 내에서 도말물과 덮인 매트릭스를 약 5분 동안 자연 건조시킵니다. 샘플을 도입하려면, 질량 분석기의 in/out 버튼을 눌러 샘플 로딩 포트를 통기시킵니다.로딩 포트를 열고 매트릭스와 함께 건조된 박테리아 도말물이 도포된 MALDI-TOF MS 타겟 플레이트를 삽입합니다. 포트를 닫고 다시 진공 상태로 만듭니다. 진공도를 관찰하여 4.5 million millibar에 도달하면 측정을 시작합니다.MMIS 분석 소프트웨어를 실행하고 파일 메뉴를 클릭합니다. 'New Classification'을 선택하면 'MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard'라는 새 창이 열립니다. 'Project Name' 필드에 프로젝트 이름을 입력하고 'New'를 클릭한 후, 'New Project'라는 새 대화 상자에서 프로젝트 이름을 확인하고 'Okay' 버튼을 클릭하여 진행합니다.MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard에서 Analyte placement 창을 확인하십시오. 대상 위치를 선택하고, 선택한 위치 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 뒤 Add samples를 선택하십시오. 자동으로 열리는 테이블 뷰에 샘플 이름, 샘플 ID 및 필요한 경우 메모를 입력하십시오."다음" 버튼을 클릭하여 진행하십시오. 다음으로, MALDI Biotyper 방법 선택 창을 확인하십시오. 'Taxonomy Tree의 MSP'에서 "Bruker Taxonomy"를 선택하고 "다음"을 클릭하여 계속하십시오.그 다음, 프로젝트 요약 창을 확인하십시오. 위에 제시된 항목들이 실제 분류 프로젝트에 올바르게 입력되었는지 검토하십시오. "Finish" 버튼을 클릭하여 분류 실행을 시작하십시오.적절한 진공 상태에 도달하면 측정이 자동으로 시작됩니다. 측정이 성공적으로 완료될 때까지 분류 실행 과정을 지켜보십시오. 측정이 완료되면 "View" 메뉴를 열고 "Results"를 클릭하여 MALDI Biotyper Real Time Classification Project One의 결과 표를 확인하십시오.기본 웹 브라우저에서 Bruker-Daltonik MALDI Biotyper 분류 결과를 html 파일로 확인하십시오. 결과를 출력하고 저장하십시오. 여기에는 실시간으로 측정 및 분류된 MALDI-TOF MS 획득 스펙트럼이 표시되어 있습니다.스펙트럼에는 종 이름과 측정 품질을 나타내는 점수 값이 할당됩니다. 2.300 이상의 점수는 종 식별 가능성이 매우 높음을 나타냅니다. 2.000에서 2.300 사이의 점수는 안정적인 종 식별을 나타냅니다.1.700에서 2.000 사이의 점수는 종 식별 가능성이 높음을 나타내며, 1.700 미만의 점수는 신뢰할 수 없는 것으로 간주합니다. 고체 배지에서 순수 배양된 세균성 병원체의 식별에는 2~3분이 소요됩니다.희귀 세균 병원체는 기기에 적절한 스펙트럼이 안정적으로 포함되어 있을 때만 MALDI-TOF MS로 검출할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우에는 특성이 규명된 분리주의 표준 균주로부터 MaSDA 스펙트럼을 통합하여 보완해야 합니다. 스코어 결과가 명확한 균주 식별로 이어지지 않는 경우에는 생화학적 프로파일링이나 16S rDNA 시퀀싱과 같은 추가적인 방법을 적용할 수 있습니다.이 방법은 박테리아 검출에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 곰팡이나 혐기성 균과 같은 다른 미생물에도 적용될 수 있습니다. 또한, 박테리아 내성 측정도 가능합니다. 위험 물질인 매트릭스를 다루는 경우이므로 장갑과 보호 안경을 착용하고 후드 내에서 작업하는 것을 잊지 마십시오.또한, 분석 챔버 내로 액체가 튀는 것을 방지하기 위해 매트릭스와 도말 표본을 완전히 건조시키는 것이 절대적으로 필요합니다.

identification-rare-bacterial-pathogens-16s-rrna-gene-sequencing

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단기 (MALDI-TOF) 질량 분석 (MS) 직접 혈액 배양액 행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 애플리케이션은 박테리아의 식별을 촉진. 제출 방법은 직접 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 식별을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법입니다.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

이 작업은 MALDI-TOF MS를 사용하여 박테리아를 신속하게 식별하기 위한 절차를 자세히 설명합니다. 식별 절차에는 스펙트럼 수집, 데이터베이스 구축 및 후속 분석이 포함됩니다. 유사성 계수 기반 방법과 바이오마커 기반 방법의 두 가지 식별 방법이 제시됩니다.

MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

IDBac는 박테리아 식민지에서 긁어낸 세포 물질에 수집된 손상되지 않은 단백질과 특수 대사 산물 스펙트럼의 데이터를 통합하는 오픈 소스 질량 분석 기반 생물 정보학 파이프라인입니다. 이 파이프라인을 통해 연구원들은 수백 에서 수천 개의 세균 식민지를 분류학 그룹으로 신속하게 구성하고 전문 대사 산물 생산을 기반으로 이를 더욱 차별화 할 수 있습니다.

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

이 프로토콜은 배양체학과 MALDI-TOF MS를 결합하여 유제품의 미생물 구성을 신속하고 비용 효율적으로 평가할 수 있습니다. 기존 배양 방법보다 짧은 처리 시간으로 16S rRNA 시퀀싱에 필적하는 분류 결과를 제공합니다.

MALDI 접근법 을 통한 박테리아 단백질체학 프로파일링을 이용한 낙농장의 미생물 안전성 평가

우선 세균성 병원균의 식별을위한 간단한 방법은 유전자 조작 기자 파지를 사용하는 것입니다. 자신의 특정 호스트 수종와 관련된 이러한 기자의 파지는 빠르게 호스트 세포에 발광 생물 신호 응답을 transducing 수 있습니다. 여기에, 우리는의 검출에 대한 기자의 파지의 사용을...

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 &#39;발광 생물&#39;리포터 파지

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을...

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

배우세요 MALDI-TOF 질량분석법과 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 활용한 희귀 세균성 병원체의 신속하고 정확한 동정 방법을. Myroides odoratimimus 식별 사례를 통해 임상 미생물학 진단 기술을 향상시킬 수 있습니다.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

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