16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별
2016년 7월 11일
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.
이 MALDI-TOF 질량분석기 프로토콜의 전반적인 목표는 빠르고 비용 효율적인 절차를 통해 희귀 병원체의 유형을 개선하는 것입니다. 이 방법은 진단 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 희귀 박테리아 병원체를 신속하게 교육할 수 있습니다. 오늘 우리는 Odoratimimus와 Myroides 속의 박테리아에 대해 이야기하고 싶습니다.
방법을 시연하고 결과 해석에 대해 이야기합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 박테리아 이동, 메트릭과의 오버레이 및 결과 해석에는 기술과 미생물 전문 지식이 필요하기 때문에 어려울 수 있습니다. MALD-TOF MS를 사용하여 희귀 박테리아를 선별하자는 아이디어는 myroides odoratimus로 인한 당뇨병성 식품 감염으로 병원에 입원한 환자가 있었을 때 처음 떠올랐습니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 박테리아 DNA, 16S 리보솜 DNA PCR 및 Sanger 염기서열분석 추출로 이 프로토콜을 시작합니다. 나무 이쑤시개를 사용하여 단일 박테리아 군체를 96웰 강철 표적의 우물로 옮깁니다. 강철 표적의 공기 건조된 유기체 위에 70% 포름산 1마이크로리터를 발견하고 약 2-3분 동안 건조시킵니다.
50%아세토니트릴, 2.5트리플루오로아세트산 및 47.5%물로 구성된 유기 용매에 50mg/ml의 CHCA가 함유된 1마이크로리터의 매트릭스 용액을 그 자리에 오버레이합니다. 번짐과 오버레이된 매트릭스를 후드에서 약 5분 동안 자연 건조시킵니다. 샘플을 소개하려면 기기의 in/out 버튼을 눌러 질량 분석기의 샘플 로딩 포트를 폭기합니다.
로딩 포트를 열고 건조된 박테리아 도말 플러스 매트릭스와 함께 MALDI-TOF MS 타겟 플레이트를 삽입합니다. 항구를 닫고 다시 대피하십시오. 진공을 관찰하고 450만 mbar에 도달하면 측정을 시작합니다.
MMIS 분석 소프트웨어를 열고 파일 메뉴를 클릭합니다. 새 분류"를 선택하면 MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard"라는 새 창이 열립니다. 프로젝트 이름" 필드에 프로젝트 이름을 입력하고 새로 만들기를 클릭하고 새 프로젝트라는 새 대화 상자에서 프로젝트 이름을 확인하고 확인" 버튼을 클릭하여 계속 진행합니다.
MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard에서 분석물 배치 창을 관찰합니다. 대상 위치를 선택하고, 선택한 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 샘플 추가를 선택합니다. 자동으로 열린 테이블 보기에서 샘플 이름, 샘플 ID 및 선택적으로 설명을 입력합니다.
계속하려면 다음" 버튼을 클릭하십시오. 다음으로 MALDI Biotyper 방법 선택 창을 관찰합니다. Taxonomy Trees의 MSP에서 Bruker Taxonomy를 선택하고 Next"를 클릭하여 계속합니다.
그런 다음 프로젝트 요약 창을 관찰합니다. 실제 분류 프로젝트에 대해 위에 제공된 삽입된 항목을 확인하십시오. 마침" 버튼을 클릭하여 분류 실행을 시작합니다.
적절한 진공에 도달하면 측정이 자동으로 시작됩니다. 측정이 성공적으로 완료될 때까지 분류 실행을 따릅니다. 측정이 완료되면 "보기" 메뉴를 열고 "결과"를 클릭하여 MALDI Biotyper Real Time Classification Project One의 결과 테이블을 봅니다.
Bruker-Daltonik MALDI Biotyper 분류 결과를 기본 웹 브라우저에서 html 파일로 볼 수 있습니다. 결과를 인쇄하고 저장합니다. 다음은 MALDI-TOF MS로 얻은 실시간으로 측정 및 분류된 스펙트럼입니다.
스펙트럼에는 종 이름과 측정 품질을 반영하는 점수 값이 할당됩니다. 2.300 이상의 점수는 매우 가능성이 높은 종 식별을 나타냅니다. 2.000에서 2.300 사이의 점수는 안전한 종 식별을 나타냅니다.
1.700 및 2.000 미만의 점수는 가능한 종 식별을 나타냅니다. 그리고 1.700 미만의 점수는 신뢰할 수 없습니다. 고체 배지의 순수 배양액에서 자란 박테리아 병원체를 식별하는 데는 2-3분이 걸립니다.
희귀 박테리아 병원체는 기기가 적절한 스펙트럼을 안정적으로 포함할 때만 MALDI-TOF MS에서 발견될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 특성화된 분리체의 유형화된 균주에서 MaSDA 스펙트럼을 통합하여 말소해야 합니다. 점수 결과가 명백한 균주 식별로 이어지지 않는 경우 생화학적 프로파일링 또는 16S rDNA 염기서열분석과 같은 추가 방법을 적용할 수 있습니다.
이 방법은 박테리아 검출에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 곰팡이 또는 혐기성 동물과 같은 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 또한 박테리아 저항성을 측정할 수 있습니다. 유해 물질인 매트릭스로 작업하고, 장갑, 보호 고글을 착용하고, 후드 아래에서 작업하는 것을 잊지 마십시오.
또한, 분석 챔버에서 스플래시 오버를 방지하기 위해 매트릭스를 건조시키고 철저히 번지는 것이 절대적으로 필요합니다.
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개요
본 프로토콜은 희귀 세균성 병원균의 식별 능력을 향상시키기 위한 MALDI-TOF 질량 분석법의 활용 방법을 설명합니다. 이 방법을 분자 생물학적 기법과 통합함으로써 연구자는 미생물학 분야에서 더욱 정확한 진단을 수행할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 진단 기술
- 병원체 동정
배경
- MALDI-TOF MS는 병원체 타이핑을 위한 강력한 도구입니다.
- 희귀 세균성 병원체는 일상적인 진단에 어려움을 줍니다.
- 전통적인 방법의 한계를 이해하는 것이 매우 중요합니다.
- 효과적인 구현을 위해서는 기술적 숙련도가 필요합니다.
연구 목적
- 희귀 병원균의 타이핑(typing) 성능을 향상시키기 위함입니다.
- 신속하고 비용 효율적인 진단 절차를 제공하기 위함입니다.
- 특정 박테리아 사례를 사용하여 해당 방법을 입증하기 위함입니다.
사용된 방법
- 병원균 스크리닝을 위한 MALDI-TOF 질량 분석법.
- 분자 동정을 위한 16S rRNA 유전자 시퀀싱.
- 박테리아 전이 및 오버레이를 위한 기술적 절차.
- 질량 분석 결과의 해석.
주요 결과
- Myroides odoratimimus의 성공적인 동정.
- 희귀 병원균에 대한 신속 진단법 입증.
- 기술적 전문성의 중요성 강조.
- 임상 환경에서 해당 방법의 적용 가능성에 대한 통찰 제공.
결론
- 분자 생물학적 기법과 결합된 MALDI-TOF MS는 진단 능력을 향상시킵니다.
- 이 방법을 효과적으로 사용하기 위해서는 교육이 필수적입니다.
- 향후 응용 분야가 확대되면 병원균 식별 범위가 넓어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
희귀 세균 병원체의 정확한 식별은 바이오 제약 R&D의 진단 미생물학, 특히 면역 저하 환자군을 대상으로 하는 연구에서 매우 중요합니다. MALDI-TOF MS와 16S rRNA 시퀀싱을 통합하면 신속하고 비용 효율적인 종 수준의 식별이 가능하며, 이는 항균 표적 검증 과정에서의 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 이러한 통합적 접근 방식은 병원체 검출의 위음성을 줄임으로써 전임상 모델의 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 감염 모델에서 희귀 병원체의 정체를 확인함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 재현 가능한 타겟 리스크 제거에 필수적인, 명명법을 준수한 견고한 균주 식별을 제공합니다.
- 예측적 가치: 질환 관련 시스템에서 정확한 병원체 특성 분석을 통해 포트폴리오 우선순위 결정을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 정량적 점수 출력(예: 고확률 ID의 경우 >2.300)을 생성하여 항균 스크리닝에서 표준화된 히트 확인을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 신속한(<3 min) 순수 배양 식별을 통해 분석 준비를 용이하게 하여 스크리닝 처리량과 확장성을 개선합니다.
- 재현성 가치: 표준화된 스펙트럼 매칭 및 검증된 데이터베이스 의존성을 통해 실험실 간 비교 가능성을 보장합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 임상적으로 유의미한 감염 모델에서 희귀 병원체를 검증함으로써 발견 단계에서 전임상 연속성으로의 가교 역할을 합니다.
- 운영적 가치: 점수 임계값(2.000–2.300)을 통해 안전한 종 식별이 확인될 때, 리스크가 조정된 추진 결정을 내릴 수 있게 합니다.
- 중개적 연속성: 면역결핍 모델에서 병원체의 존재가 숙주 반응과 상관관계를 가질 때 바이오마커 정렬을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 타겟 검증부터 전임상 평가에 이르는 발견 연속체 내에 포함되며, 여기서 정확한 병원체 식별은 기전 연구 및 리드 화합물 평가의 기초가 됩니다.
- 발견 생물학: 감염 모델에서 희귀 세균 인자를 확인함으로써 가설 검증을 지원하고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 스크리닝: 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 위해 정량적 결과물을 제공하는, 분석 준비가 완료된 검증된 생물학적 시스템을 제공합니다.
- 분석: 객관적인 조건 비교와 히트(hit) 검증이 가능하도록 점수 기반의 판독 결과(예: MALDI Biotyper 분류)를 제공합니다.
- 중개 연구: 원본 자료에 의해 뒷받침되는 경우에 한해, 질환 관련 시스템 내 병원체 검증을 통해 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 희귀 병원체 프로젝트 전반에 걸쳐 재사용 가능한 진단 역량으로 작동하여 중복 검증 노력을 줄입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증의 예측 신뢰도 향상, 잘못된 병원체 지정의 감소 및 기전적 리스크 완화.
- 운영적 가치: 여러 실험실 간 병원체 식별의 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 항균제 프로그램의 go/no-go 결정 개선, 신속 진단을 통한 자본 효율성 증대 및 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 전임상 모델에서 확인된 병원체 정체성을 활용한 항균제 후보 물질의 리스크 기반 우선순위 설정.
실행 시 고려 사항
- 박테리아 전이, 매트릭스 오버레이 및 결과 해석을 위한 미생물학적 전문 지식이 필요합니다.
- 정확한 스펙트럼 매칭을 위해 최신 분류학 데이터베이스(예: Bruker Taxonomy)가 업데이트된 MALDI-TOF MS 장비가 필요합니다.
- 분석기 오염을 방지하기 위해 매트릭스와 도말 상태를 건조하게 유지하는 표준화된 시료 준비 프로토콜이 필수적입니다.
- MALDI-TOF 점수가 1.700 미만으로 나타나 식별 신뢰도가 낮은 경우에는 16S rRNA 시퀀싱 또는 생화학적 프로파일링으로 대체해야 합니다.
- 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 흄 후드 내에서 위험한 매트릭스 용액(예: formic acid, acetonitrile)을 취급하기 위한 안전 프로토콜이 포함됩니다.
