Name: 삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 II 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 학습하세요 삼투압 펌프를 이용한 피하 안지오텐신 II 주입법으로 쥐 대동맥류를 연구하는 방법을. 이 기술은 혈관 확장의 분자 메커니즘 규명에 활용됩니다.

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이 원고에 제시된 연구 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금(HL107319 앨런 도허티(Alan Daugherty)에게, HL107326 리사 카시스(Lisa A. Cassis)에게)의 지원을 받았습니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 원고의 출판은 DURECT Corporation의 후원으로 이루어졌습니다.

윤리 문 : 마우스 연구가 켄터키 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: 2006-0009 IACUC 프로토콜 번호) 대학의 승인을 수행한다. 마우스는 케타민 (~ 210 ㎎ / ㎏)과 자일 라진의 과다 복용 칵테일 (~ 30 ㎎ / ㎏)를 사용하여 종단에서 안락사된다. AngII 금액의 1. 계산 참고 :이 프로토콜은 4 남성 LDL 수용체의 4 주간 AngII (1000 NG / ㎏ / 분)의 주입의 예를 사용합니다 - / - 마우스는 포화 지방이 풍부한 음식을 공급. <ol><li> 주입에 필요한 AngII의 양을 계산하기 전에 마우스를 연구 무게. </li><li> 실험에 필요한 AngII 질량을 계산하는 템플릿 (표 1)를 사용합니다. 템플릿의 4 단계에서 &quot;펌핑 속도&quot;로 펌프의 지시에 표시된 &quot;펌핑 평균 속도&quot;를 사용합니다. 수동 5 및 단계 6 - - 템플릿에, 레코드 1 단계 (10)는 자동으로 산출된다. <ol><li> 템플릿에서, 가정마우스를 4 주간 AngII 1,000 NG / kg / 분의 투여시 체중 1g을 얻게 될 것이다. 참고 : 각 마우스는 마우스의 변형과 다이어트 등 많은 변수에 따라 달라집니다 매우 다른 체중 증가가있을 수 있습니다. 우리는 일상적으로 이전의 연구에서 우리 자신의 경험을 바탕으로 &quot;0&quot;또는 &quot;1g&quot;를 사용합니다. </li><li> 각 펌프는 약 250 μl를 필요로하기 때문에, 각 마우스 AngII 용액 300 μL 총 부피를 계산. </li></ol></li></ol> AngII 2. 해산 <ol><li> 저장소는 -20 ° C에서 AngII 유리 병을 동결 건조. 열기 전에 실온으로 AngII 바이알 평형. </li><li> 멸균 플라스틱 튜브로 계산 AngII 질량 (표 1에 나타낸 바와 같이 7.3 mg)을 단다. 주 : AngII의 수용액을 유리에 결합에 대한 강한 친 화성을 갖기 때문에 당 머크 인덱스, 용해 유리 튜브를 사용하지 않는다. </li><li> (1,200 μ를 멸균 식염수의 계산 된 볼륨을 추가동결 건조 AngII, 캡을 포함하는 플라스틱 튜브에 L), 용액이 깨끗해질 때까지 반전에 의해 충분히 혼합한다. </li><li> 라벨 마우스 번호 # 1, # 2, # 3, 캡 개별 멸균 플라스틱 튜브에 # 4 (0.5-1.5 mL)을 첨가 하였다. 단계 1.2 표 1에 계산 된 체중에 기초하여 각각의 마우스에 대한 층류 후드 AngII 용액을 제조 하였다. <ol><li> 예를 들어, 튜브 # 1, 다음 296.4 μL AngII 솔루션에 피펫 3.6 μL 멸균 생리 식염수와 아래로 부드럽게 피펫 팅에 의해 철저하게 섞는다. </li></ol></li><li> (; 멸균 4 ㎖) 모자와 플라스틱 튜브에 라벨 마우스 번호. 이러한 단계는 3.13에 기술 된 바와 같이 펌프를 배양에 사용된다. </li></ol> 3. 삼투 펌프 충전 <ol><li> 펌프의 본체와 흐름 중재자 (그림 1) : 두 개의 분리 된 부분으로 펌프를 얻습니다. 각 상자에 개별 포장되어 10 펌프 몸과 흐름 사회자가 있습니다. 로트 번호를 기록합니다. 참고 : 항상 착용장갑은 펌프의 외부 케이스에 손에서 전송 된 오일은 부정적인 기능을 펌핑 영향을 미칠 것 때문이다. 임플란트에서 감염의 위험을 피하기 위해, 멸균 장갑, 거즈, 튜브, 충전 니들을 사용하고, 펌프를 제조 보트 무게. </li><li> 이 번 열 저장 될 수 없기 때문에, 연구에 필요한 펌프 몸과 흐름 중재자의 수를 엽니 다. 10 개 이상의 펌프가 필요하면, 다른 로트 번호에서 펌프는 다른 평균 채우기 볼륨 및 펌프 속도를 가지고 있기 때문에 펌프의 로트 번호가, 한 연구에 대한 동일한 지 확인합니다. </li><li> (본체와 사회자 흐름을 모두 포함) 각 펌프의 무게를 측정하고, 소수점 이하 4 자리까지 무게를주의 (예를 들어, 마우스 #의 1.1443 g의 1). 템플릿 (표 1)에서 &quot;펌프 무게 빈&quot;라이 중량은, 충전 비율을 계산하는 데 사용된다. </li><li> 1 CC 멸균 주사기 펌프 충전 바늘을 부착하고주의 깊게 적절에서 AngII 솔루션 주사기를 채우번호 플라스틱 튜브. 이는 주사기로 공기를 흡입 피하는 것이 중요하다. </li><li> 바늘 아래에 위치되는 동안 주사기로부터 심하게 모든 공기 방울을 제거한다. 펌프로 거품의 도입을 방지하기 위해이 위치에 바늘 / 주사기를 유지합니다. </li><li> 조심스럽게 펌프 본체에 충전 바늘을 삽입합니다. 펌프에 바늘의 끝 부분을 진행합니다. 단단히 펌프의 하단에있는 바늘의 끝 부분을 올려 놓지 마십시오. </li><li> AngII 용액 펌프를 채우기 위해 천천히 주사기의 플런저를 밀어 넣습니다. 펌프 내부의 어두운 그림자는 충전 수준을 나타냅니다. 충전 부피는 지시에 따라, 약 246 μL이다. </li><li> 펌프를 충전 중지하고 유체의 비드가 펌프에서 상승으로 조심스럽게 즉시 바늘을 제거합니다. </li><li> 갭은 유동 중재자의 헤드와 펌프 본체의 상부 (도 1) 사이에 볼 수없는 때까지 펌프 본체의 상단에 구멍을 통해 펌프로 유동 중재자를 삽입한다. </li><li> moderat의 삽입또는 펌프 본체에 흐름 사회자의 오프닝에서 일부 유체 누출로 이어집니다. 조심스럽게 사회자의 배치하는 동안 누출 수있는 모든 여분의 유체를시킨다. </li><li> 충전 펌프를 달아. 템플릿에 &quot;채워진 펌프 무게&quot;의 무게를 기록한다. </li><li> 채우기 비율 (%) = ( &quot;작성&quot;펌프 무게 - &quot;빈&quot;)을 계산하면 1,000 / 볼륨 × 100을 채울 의미 X. <ol><li> 비율을 채우는 것은 같거나 100 %보다 커야한다, 표 1에 나타낸 바와 같이, 이상적으로는 비 충진 계산. 충전율이 경우 리필 펌프 &lt;95 % (즉, 기포 펌프에 연루 존재할 수있다). </li></ol></li><li> 사회자 헤드가 위쪽으로 향하도록 표시 4 ML 튜브 (단계 2.5)에 충전 펌프를 놓습니다. 펌프를 충당하기 위해 멸균 생리 식염수의 충분한 볼륨을 추가합니다. 주입 될 때까지 생리 식염수 튜브 펌프를 유지합니다. </li><li> 37 ºC 인큐베이터에 넣어 튜브. 품어 부분 프라이밍을 허용 한 다음 마우스에 이식 O / N (최소 12 시간)을 펌프. 펌프AngII의 ING 쥐 수술의 사전 AngII 주입하는 동안 발생하는 잠재적 인 스트레스를 복구 할 수 있습니다 주입 후 약 24 시간을 시작합니다. </li></ol> 펌프 주입 4. 준비 <ol><li> 오토 클레이브 (중력 모드, 건조 사이클, 15 분) 거즈, 면봉과 가위, 지혈, 집게, 스테이플을 포함하여 수술 도구, 스테이플러 적어도 일일 수술 전에. </li><li> 프로 시저 방, 이소 플루 란을 사용하여 마취에 대한 기화기를 준비합니다. 층류 후드에서 멸균 커튼을 열고 이소 플루 란 마취 코 콘을 배치합니다. 층류 후드에 betadine, 70 % 에탄올, 멸균 수, 구슬 살균기, 살균 handrub, 면봉, 거즈, 및 충전 펌프를 놓습니다. </li><li> 돈 마스크와 가운은 다음 깨끗한 손으로 층류 후드에서 외부 드레이프를 엽니 다. 멸균 장갑을 착용하고 멸균 내부 팩을 엽니 다. </li></ol> 펌프 주입 5. 수술 <ol><li> 유도 참의 장소 마우스2 % - 1.5의 유량으로 유입 이소 플루 란으로 BER. 드러 누움 후 3 분 - 추가 2 마우스를 모니터합니다. 왼쪽 또는 오른쪽 어깨에 1/4 정도의 크기의 영역을 면도. </li><li> 이소 플루 란 유출 (그림 2A)에 연결된 콘과 같은 높이의 코, 층류 후드에 마우스를 놓습니다. 외과 의사의 지배적 인 손으로 마우스의 머리를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 마우스가 수술 전에 통증 자극에 대한 응답이 없음을 확인합니다. 예를 들어, 페달 반응은 통증에 대한 좋은 지표이다. </li><li> 면봉과 70 % 에탄올 세 잎사귀 뒤에 betadine로 면도 부위를 닦아주십시오. 돈 또는 멸균 장갑을 변경합니다. </li><li> 앞 다리의 견갑골을 통해 귀 뒤에 ~ 1cm의 절개를하는 수술 메스를 사용합니다. 이 절개는 꼬리에 수직이어야한다. 단지 피부가 아닌 기본 조직을 잘라주의하십시오. </li><li> 홀드 그렇게해야한 손으로 EPS는 절개를 열고, 지혈제 (그림 2B)를 사용하여 피부 아래 피하 터널을 만들기 위해 다른 손을 사용합니다. </li><li> 꼬리쪽으로 지혈 팁을 사전 및 펌프 주머니를 만듭니다. 이것은 조심스럽게 주머니를 열어 피부 아래 지혈의 턱을 열어 수행 할 수 있습니다. 절개에서 지혈을 철회. </li><li> 마우스 (그림 2C)의 후면에 위치 사회자 머리 절개로 펌프를 삽입합니다. 조심스럽게 주머니에 완전히 펌프를 밀어 넣습니다. 전혀 긴장하거나 피부의 스트레칭으로 상처를 닫습니다 충분한 여유 공간이 있어야합니다. </li><li> 펌프를 삽입 한 후, 견고하므로 가장자리가 만나는 직선화, 절개의 양면 핀치하고 (도 2d)를 닫고 1 또는 2 창상 클립을 배치했다. 상처의 완전한 밀폐가되도록 절개 부위를 검사하고 펌프 사이트에 직접 가압하지 않은 것. </li><li> 국소 리도카인 크림을 적용코 콘에서 깨끗한면 swab.Remove 마우스로 (4 % 중량 / 중량), 그리고이 의식을 회복 할 때까지 가열 패드에 놓습니다. 복구 후, 마우스의 케이지에 반환됩니다. </li><li> 마우스 사이에 10 초 동안 비드 살균기로 수술 도구를 놓습니다. 악기를 사용하기 전에 냉각 시키십시오. 마우스 사이의 살균 handrub 청소 장갑. 전체 복구가 달성 될 때까지 마우스를 모두 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 밀접하게 수술 후 마우스를 모니터링합니다. 마우스가 곤란, 탈수 또는 명백한 체중 감소의 흔적을 보여줍니다 경우 - (0.3 ml의 0.2) 피하 멸균 식염수의 덩어리를 주입한다. 처음 10 일 동안 적어도 하루에 두 번 쥐를 관찰하고, 이후에 적어도 한 번 매일. 어떤 마우스 AngII 주입하는 동안 죽을 경우 즉시 부검을 수행합니다. 수술 후 7-14일 사이에 상처 클립을 제거합니다. </li></ol> 6. 수확, 수리, 청소 및 대동맥의 영상 <ol><li> OPE를 절단, 복부 마우스 흉부와 복강을 열고 잘라N 우심방은 대동맥에서 혈액을 제거하는 심장의 좌심실을 통해 식염수로 관류 한 다음 대동맥 (27)를 수확. </li><li> 48 시간 27 - 24 4 % 파라 포름 알데히드 또는 10 % 중성 완충 포르말린 적어도 3 ㎖를 포함하는 플라스틱 튜브에 수확 대동맥를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 외막 조직을 제거합니다. 핀 검은 색 왁스에 핀 대동맥. 같은 배율 대동맥 이미지를 획득. 도 3에 도시 된 바와 같이, 보정 각 이미지에 눈금자를 포함한다. </li></ol> 대동맥의 7 욕실 얼굴 영상 <ol><li> 대동맥 궁의 외부 및 내부 곡률을 통해 길이 방향으로 열려있는 대동맥을 절단하고, 무명, 왼쪽 경동맥, 왼쪽 쇄골 하 동맥을 포함한 열린 주요 가지를 잘라. 외부 외막이 검은 색 왁스에 인접 누워 평면 핀 대동맥. </li><li> 같은 배율에서 대동맥의 내막 표면의 얼굴 사진 엉 취득. 쇼로, 교정 각 이미지의 통치자를 포함그림 4 명. </li></ol>

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이 문서의 공개는 Alzet 후원됩니다.

AngII 피하을 제공 삼투 펌프는 쥐에서 대 동맥류를 유발하는 일상적인 방법입니다. 많은 실험실에서 데이터를 기반으로,이 AAAS 3,4와 마우스에 TAAS 22-26 모두를 연구하는 신뢰성과 재현성 방법이다 일관된 연구 결과가 있었다. 따라서,이 마우스 모델은 인간의 대동맥 동맥류의 몇 가지 기능이 되풀이되었습니다 이러한 파괴적인 질병에 기계적인 통찰력을 제공하는 모델로 간주됩니다. 노화는 인간 AAAS 위험 인자 인 반면, 체계적 생쥐 AngII 유도 AAAS 대한 연구되지 ​​않았다. 48 주 4,5,7 - 그러나, 빈도와 AngII 유도 AAAS의 심각도는 8 세의 나이에 쥐 비슷 나타납니다. TAA 형성에 명백한 연령에 따른 차이를 보이지 않았다 (24) 주 22 ~ 26, - 현재, 8 세의 나이에 쥐 AngII 유도 TAAS를보고 몇 연구가있다. 여성 마우스는 AngII 4,28 주입 수컷 마우스에 비해 AAAS의 훨씬 낮은 발병률을 가지고있다. 그것은 AngII 유도 AAAS의 빈도는 각각 30 % 이하 대비 50 % 이상이다 normo-cholesterolemic 마우스, 하이퍼보다 훨씬 높다는 것을 주목할 가치가있다. AngII 주입하는 동안 모두 normo- 및 콜레스테롤 혈증 쥐 - (30 % 약 10) 또한, 대동맥 파열이 자주있다. 1000 NG / kg의 속도로 AngII의 주입 / 분은 LDL 수용체와 같은 콜레스테롤 혈증 마우스로 - / - 마우스는 서양 다이어트 또는 아포 지단백 (의 apoE)를 공급 - / - 마우스는 정상 또는 서양 음식을 공급, AAA에 최대 효과가있다 개발 3,4,29. 이 주입 속도는 혈증 마우스에서 관심 유전자를 조작이 AAAS을 감소 할 것으로 예상되는 연구에 최적이다. 콜레스테롤 혈증 마우스의 조작이 AAAS을 확대 할 것으로 예상되는 경우, 500 NG / ㎏ / 분 또는 30 이하의 속도로 AngII을 주입하는 것이 좋습니다. AAAS 대조적으로, 더 데모가 없다남성 성 또는 고 콜레스테롤 혈증과 AngII 유도 TAAS (25) 사이의 nstrated 협회. 관심의 유전자 조작이 TAAS을 확대 할 것으로 예상된다 경우, 유사 AAAS에, 우리는 AngII 주입 1,000 NG / ㎏ / 분보다 낮은 주입 속도를 권장합니다. 그것은 AngII 유도 동맥류의 빈도와 심각도 개별 생쥐들과 연구 사이에 차이가 아는 것도 중요하다. 쥐 대동맥 동맥류를 개발하지 않는 경우, 하나의 잠재적 인 가능성이 AngII가 성공적으로 마우스에 전달되지 수도 있다는 것입니다. AngII의 높은 주입 속도의 검증을 위해, 예컨대 1,000 NG / kg / 분, 혈압 측정은 비 침습적 꼬리 - 커프 방법 (31)을 사용하기에 앞서 및 AngII 주입 동안에 권장된다. 1,000 NG / kg의 속도로 주입 AngII / 분 마우스에서 수축기 혈압을 증가시킨다. 또한, 혈장 레닌 농도는 AngII는 R에 부정적인 의견을 가지고 있기 때문에 AngII 주입 중 또는 종료에 측정 할 수있다enin 분비. 따라서, AngII 주입 혈장 레닌 농도의 감소로 이어집니다. AngII 주입 마우스는 명백한 대동맥 병변, 혈압의 증가없이, 플라즈마 레닌 집중력을 저하가없는 경우에는 AngII가 이식 된 삼투압 미니 펌프를 통하여 효율적으로 전달되지 않았 음을 나타낼 것이다. 우리는이 연구에서이 마우스를 제거 추천 할 것입니다. 그것은 몇 가지 마우스가 증가 수축기 혈압에도 불구하고 대 동맥류를 개발하고 혈장 레닌 농도를 감소하지 않도록주의하는 것이 중요하다. 이 마우스는 연구에 남아 있어야한다. 요약하면, AngII 주입은 마우스에서 대 동맥류를 유도하는 삼투 펌프를 이용하여 피하 주입에 의해 달성된다. 이 방법은 AAAS과 TAAS 모두를 연구하는 데 사용되는 지정된 기간에 대한 정의 속도로 지속적으로 AngII을 제공합니다.

대동맥 동맥류는 죽음에 이르게 보통 파열을 예고하고 대동맥의 영구 내강 확장을 나타낸다. 이 질병은 각각 복부 대 동맥류 (AAAS) 및 흉부 대 동맥류 (TAAS)로 불린다 복부 및 흉부 대동맥 지역 모두에서 발생합니다. 때문에 분자 메커니즘 및 병태 생리 학적 과정의 불완전한 이해, 대 동맥류의 두 유형의 확장 또는 파열을 방지 할 수있는 입증 된 약물 치료가 없다. 이 환자의 샘플을 수집하고 AAAS의 메커니즘을 정의에 집중 직접 인간 연구를 실험을 수행하기 어렵 기 때문에 자주 동물 모델에서 외삽되었다. 일반적으로 사용되는 동물 모델 쥐에 안지오텐신 II (AngII)의 피하 주입입니다. 이러한 내 대동맥 엘라 스타 제 관류 또는 개복술 1, 2를 필요로 염화칼슘의 요정 대동맥 응용 프로그램이 운전 방식으로 마우스에 AAAS을 유도하기위한 다른 수술 방법에 비해D는 체강 내에 엔트리를 필요 최소한의 수술 3,4- 전문성을 요구하지 않는다. AAAS을 유도하는 삼투 펌프를 통해 AngII의 피하 주입은 초기에 낮은 밀도 지단백 (LDL) 수용체에보고 - / - 마우스의 apoE 년 이후 포화 지방이 풍부한 다이어트 (3)를 공급하고, - / - 마우스는 일반 실험실 다이어트 (4)를 공급. 많은 최근의 연구는 또한 AngII가 normolipidemic 마우스 5-7 AAAS을 유도 것을 증명하고있다. 주입 AngII의 접근 방식은 AAAS을 유도하고이 모델은 인간의 AAAS에서 관찰 된 많은 기능을 되풀이되었습니다 때문에 분자 메커니즘뿐만 아니라 (예 : 5-15) 잠재적 인 치료 전략의 개발을 탐험하기 위해 적용되었습니다. 예를 들어, 흡연, 노화, 남성 성 인간 AAAS의 위험 요소는 마우스 (16, 17)에 AngII 유도 AAAS을 증가. 인간의 AAAS와 고 콜레스테롤 혈증의 협회는 설명이 필요합니다. 그러나, 보유 될일관된 엉 콜레스테롤 혈증 쥐 18 AAAS을 AngII가 유도 증대있다. 쥐 AngII 유도 AAAS의 병리는 매우 이질적인하고 깊은 식세포 침투, 콜라겐 저하, 혈전 형성과 해상도, 신생 혈관 19-21 특징이다. 인간의 AAAS의 가장 일반적인 infrarenal 대동맥 위치는 대조적으로, 생쥐에서 AAAS는 부신 대동맥 지역에서 발생 AngII은 유도. AngII 유도 AAAS의 또 다른 유비쿼터스 기능은 전층 혈전증으로 이어지는, 전층 중간 휴식 시간입니다. 그것은 인간의 AAAS의 병리학 적 개발이 독점적으로 인해 초기 단계에서 동맥류 조직의 부족으로 연구되지 ​​않았기 때문에 전층 엘라스틴 파열 인간에 발생하는지 불분명하다. 쥐에 AngII 주입은 주로 가장 일반적인 영역은 인간 TAAS입니다 상행 대동맥으로 제한됩니다 흉부 대동맥 지역의 깊은 확장에 이르게 <s&gt; 19,22-26입니다. AngII 유도 AAAS 마찬가지로, TAAS는 인간 TAAS (25)의 많은 기능을 요점을 되풀이 AngII 주입하는 동안 유도. 그러나 AngII 유도 AAAS 달리 AngII 유도 TAAS는 고 콜레스테롤 혈증과 연관되지 않으며, 성별 차이가 없다. 마우스에 피하 AngII 주입의 전반적인 목표는 병리학 적 특징과 AAAS 및 TAAS의 분자 메커니즘을 연구하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>안지오텐신 II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>대동맥류를 유도하는 데 사용되는</td></tr><tr><td>화합물 Alzet 삼투압 펌프</td><td>DURECT Corporation</td><td>Alzet Model 2004</td><td>체중 > 20g 무게의 마우스에서 28일 주입</td></tr> 가능 <tr><td>포화 지방 강화 다이어트</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>LDL 수용체에서 고콜레스테롤혈증을 자극하는 42% 칼로리/칼로리 -/- 마우스</td></tr></tbody></table>

삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 ii 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

삼투압 펌프는 일정한 속도로 화합물을 작은 동물에 지속적으로 전달합니다. 이 기사에서는 이식된 삼투압 펌프에서 안지오텐신 II(AngII)의 피하 주입을 통해 대동맥류를 유도하는 데 사용되는 표준 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜에는 AngII 양 및 용해 계산, 삼투압 펌프 충전, 삼투압 펌프의 피하 이식, 펌프 이식 후 관찰 및 마우스의 대동맥류를 시각화하기 위한 대동맥 채취가 포함됩니다. 이 프로토콜에 따라 삼투압 펌프를 통한 AngII의 피하 주입은 마우스에서 복부 및 흉부 대동맥류를 모두 유도할 수 있는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 기술입니다. 주입 기간은 연구 목적에 따라 며칠에서 몇 달까지 다양합니다. AngII 1,000ng/kg/min은 아포지단백 E 결핍 또는 저밀도 지단백 수용체 결핍 마우스와 같은 남성 고콜레스테롤 혈증 마우스 모델에서 복부 대동맥류 형성에 최대한의 효과를 제공하기에 충분합니다. 삼투압 펌프를 통한 AngII 주입에 의해 유도된 복부 대동맥류의 발생률은 암컷 고콜레스테롤혈증 마우스에서 5 - 10배 낮았으며, 정상콜레스테롤혈증 마우스의 성별 모두에서 더 낮았습니다. 대조적으로, 마우스에서 AngII 유발 흉부 대동맥류는 고콜레스테롤혈증이나 성별에 의존하지 않습니다. 중요한 것은 이 마우스 모델의 여러 특징이 인간 대동맥류의 특징을 요약한다는 것입니다.

4 남성 LDL 수용체 - / - 프로토콜 절에 설명 된 마우스는 AngII 주입 4 주 후에 안락사시켰다. 대동맥은 수확 청소 및 대동맥 딜레이 션을 시각화하기 위해 몇 군데 있었다. (도 3A AAAS), 상승 영역의 확장 (TAAS;도 3b), 또는 두 영역의 확장 (AAAS 및 TAAS 모두의 존재도 3에 도시 된 바와 같이, 대동맥 부신 영역의 확장을 포함하여 여러 가지 다른 특징이도를 3C), 형태 반면 한 마우스에서) 그림 3D (심하게 정상이었다. 도 3a에 적색 선으로 도시 한 바와 같이 복부 대동맥의 팽창은, 부신 영역의 생체 최대 폭을 측정하여 정량화된다. 도 4에 도시 된 바와 같이 팽창 대동맥 오름차순 측정하기 위해 대동맥을 절개하고 고정 하였다. 내막 표면적 차에 의해 둘러싸인 상승 대동맥 영역 (영역에서 측정했다그림 4A)에서 전자 빨간색 선은 TAAS을 정량한다. 눈금자는 모두도 3 및도 4에 도시 된 바와 같이, 측정 값을 표준화 각 화상에 포함시켰다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" /> . 본체와 흐름 사회자 : 충전 삼투 펌프 그림 1. 대표 이미지는 각 펌프는 두 개의 분리 된 부분이 포함되어 있습니다. AngII와 펌프 본체를 작성 후, 흐름은 중재자 펌프를 밀봉하도록 삽입된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" /> 펌프 주입 수술의 그림 2. 공정 (A) 마우스는 이소 플루 란과 산소를 방출 지속적 인 코 콘 층류 후드에 배치됩니다.; (B) 직선 지혈제는 피하 터널을 만드는 피부 절개에 삽입되고; (C)는 펌프를 통해 삽입<html> 피부 절개 부드럽게; (D) 피부 절개는 펌프 삽입 후 스테이플. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" /> 주입 마우스의 그림 3. 대동맥 이미지 (생체) AngII AngII 1000 NG / ㎏ / 분은 남성 LDL 수용체에 주입되었다 -. / - 이십팔일을위한 마우스. (A)는 혈전증 AAAS 수반; 레드 라인 (2.05 mM)을 부신 지역에서 최대 대동맥 폭의 측정을 보여줍니다. 심하게 정상 복부 대동맥과 대동맥 팽창 (TAA)를 오름차순 (B) (C) 상승과 부신 대동맥 지역 (TAAS 및 AAAS) 모두에서 심오한 딜레이 션; (D) 오름차순 또는 부신 대동맥 영역 중 하나의 명백한 팽창과 심하게 정상 대동맥. 4.jpg &quot;/&gt; 그림 AngII AngII 1000 NG / ㎏ / 분은 남성 LDL 수용체에 주입 된 주입 쥐에서 흉부 대동맥 지역의 4 욕실 얼굴 이미지 - 이십팔일을 위해 마우스 -. /. 빨간 선으로 설명 표면 영역은 대동맥 궁의 일부를 포함하여 상승하는 대동맥 영역을 나타냅니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="2"> 용량이 필요 </td><td></td><td> 1,000 </td><td colspan="2"> NG / ㎏ / 분 </td><td></td></tr><tr><td> (2) </td><td colspan="3"> 체중 (최대 마우스)를 시작합니다 </td><td> 24.8 </td><td> G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> 예상 총 체중 증가 </td><td> 1 </td><td> G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 펌핑 속도 </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> μL / 시간 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> (5) </td><td colspan="2"> 뉴마우스의 mber </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (6) </td><td colspan="2"> 동물에 대한 시간당 복용량 </td><td></td><td> 1518 </td><td> NG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> 진한 필요 </td><td></td><td></td><td> 6072 </td><td> NG / μL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="2"> 300 UL 솔루션 </td><td></td><td> 1.82 </td><td colspan="2"> 밀리그램 / 300 μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 솔루션 NEEDED </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="2"> 총 AngII (mg)을 </td><td></td><td> 7.3 </td><td> 밀리그램 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> (10) </td><td colspan="2"> 식염수에 용해 및# 160; </td><td></td><td> 1,200 </td><td> μL </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 쥐 </td><td> 체중 </td><td> 희석 배수 </td><td colspan="2"> 볼륨 (μL) </td><td colspan="2"> 펌프 중량 (g) </td><td> 채워진 비율 </td></tr><tr><td> # </td><td> (G) </td><td></td><td> AngII </td><td> 식염 </td><td> 빈 </td><td> 채우는 </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296.4 </td><td> 3.6 </td><td> 1.1443 </td><td> 1.3877 </td><td> (99) </td></tr><tr><td> (2) </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1.1677 </td><td> 1.4145 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263.7 </td><td> 36.3 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> (100) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> 희석 배수 = 최대 마우스의 마우스 / 체중 체중 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 쥐 </td><td> 체중 </td><td> 희석 배수 </td><td colspan="2"> 볼륨 (μL) </td><td colspan="2"> 펌프 중량 (g) </td><td> 채워진 비율 </td></tr><tr><td> # </td><td> (G) </td><td></td><td> AngII </td><td> 식염 </td><td> 빈 </td><td> 채우는 </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296.4 </td><td> 3.6 </td><td> 1.1443 </td><td> 1.3877 </td><td> (99) </td></tr><tr><td> (2) </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1.1677 </td><td> 1.4145 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263.7 </td><td> 36.3 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> (100) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 삼투 펌프를 통해 28 일간의 주입을위한 계산.

삼투 펌프의 피하 주입 화합물의 연장하고 일관된 전달을위한 편리한 방법을 제공합니다. 이러한 접근은 마우스에서 복부 및 흉부 대동맥 동맥류 모두 광범위하게 연구하기 위해 사용되었다.

삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 II 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스의 대동맥류의 병리학적 특징과 분자적 기전을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 angiotensin two 용액이 담긴 삼투압 펌프를 준비합니다. 그 다음 동물의 등 피부에 파우치를 만들어 펌프를 삽입합니다.궁극적으로 흉부 및 복부 대동맥 영역의 대동맥 확장은 ex vivo 이미징을 통해 평가할 수 있습니다. 따라서 당사는 죽상동맥경화증의 발전을 촉진하기 위해 안지오텐신을 주입할 때 혈압의 역할을 명확히 정의하고자 이 기술을 먼저 구현했습니다. 삼투압 펌프를 채우는 절차는 Soha Cardiovascular Research Center의 구성원인 Deborah Hart와 Angio banan이 시연할 예정입니다.펌프 본체 및 유량 조절기와 함께 제공된 펌프와 유량 조절기의 로트 번호를 기록하는 것으로 시작하십시오. 펌프의 외장 케이스에 손의 유분이 옮겨가는 것을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오. 다음으로 연구에 필요한 수의 펌프와 유량 조절기만 개봉하십시오.그런 다음 메인 바디와 유량 조절기를 포함하여 각 펌프의 무게를 소수점 넷째 자리까지 측정합니다. 템플릿에서 펌프 공중량(pump weight empty)으로 명명된 이 무게는 모든 펌프의 무게 측정이 완료된 후 충전 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 펌프 충전 바늘을 멸균된 1 cc 시린지에 장착하고, 번호가 매겨진 플라스틱 튜브에서 갓 조제한 angiotensin two 용액을 시린지에 조심스럽게 채웁니다.바늘을 아래쪽으로 향하게 하여 주사기 내의 모든 기포를 조심스럽게 제거합니다. 그 다음, 펌프 내부로 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 주사기를 이 상태로 유지합니다. 충전 바늘을 펌프 본체에 부드럽게 삽입합니다.바늘이 적절한 위치에 놓이면, 펌프 바닥에 닿을 때까지 팁을 펌프 내부로 밀어 넣으십시오. 그런 다음 플런저를 천천히 눌러 용액 약 246 µL를 분주합니다. 펌프 내부의 어두운 그림자를 통해 충전 수준을 모니터링할 수 있습니다.펌프가 가득 찼습니다. 유체 방울이 펌프 밖으로 솟아오르면, 바늘을 조심스럽게 제거하고 유량 조절기(flow moderator)를 펌프 본체 상단의 구멍을 통해 삽입하십시오. 이때 유량 조절기의 헤드와 펌프 본체 상단 사이에 틈이 보이지 않을 때까지 밀어 넣습니다. 삽입 과정에서 발생한 여분의 유체 누출물은 조심스럽게 닦아내십시오.그 다음, 충전된 펌프의 무게를 측정하여 템플릿의 해당 펌프 및 충전 무게 셀에 기록합니다. 이후 공식을 사용하여 충전율을 계산할 수 있으며, 이 데이터를 템플릿의 충전율 셀에 입력합니다. 이상적으로 충전율은 95% 이상이어야 합니다. 펌프 충전이 완료되면 조절기 헤드가 위를 향하도록 하여 적절한 대응 멸균 4 mL 플라스틱 튜브에 넣고, 펌프가 잠길 만큼 충분한 양의 멸균 식염수를 추가합니다.모든 펌프의 보관이 완료되면, 이식 당일에 펌프가 부분적으로 프라이밍될 수 있도록 튜브를 37 °C 인큐베이터에 최소 12시간 동안 보관합니다. 가운, 마스크, 장갑을 착용한 상태에서 마취된 마우스의 어깨 부위에 25센트 동전 크기만큼 제모를 하고 동물을 라미나 후드로 옮깁니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 발가락 꼬집기에 반응이 없는 것을 확인한 후, 제모된 부위를 베타딘(Betadine)으로 닦아내고 이어서 70% 에탄올로 세 번 닦아냅니다.다음으로, 오토클레이브로 멸균한 외과용 메스를 사용하여 꼬리 방향과 수직이 되도록, 그리고 앞다리 견갑골 위쪽 귀 뒷부분 피부에 1cm 길이의 절개창을 만듭니다. 그런 다음 한 손으로는 포셉을 잡고, 다른 한 손으로는 지혈집게(hemostat)를 사용하여 절개 부위를 벌립니다. 다른 쪽 손으로 지혈집게의 팁을 꼬리 방향으로 전진시키며 피부 아래에 피하 터널을 만듭니다.지혈鉗(hemostat)의 조(jaws)를 조심스럽게 벌려 펌프를 삽입할 포켓을 만듭니다. 그다음 지혈鉗을 제거하고, 모더레이터 헤드(moderator head)가 마우스의 후방을 향하도록 하여 적절한 펌프로 교체한 뒤, 펌프를 포켓 속으로 완전히 부드럽게 밀어 넣습니다. 피부의 긴장이나 늘어남 없이 상처를 봉합할 수 있을 만큼 충분한 여유 공간이 있어야 합니다.펌프를 위치시킨 후, 절개 부위의 양쪽을 단단히 집어 펴서 가장자리가 맞닿게 한 다음, 한두 개의 상처 클립으로 피부를 폐쇄합니다. 절개 부위를 살펴 상처가 완전히 폐쇄되었는지, 그리고 펌프가 절개 부위를 직접적으로 압박하고 있지는 않은지 확인합니다. 그런 다음 깨끗한 면봉을 사용하여 해당 부위에 국소 리도카인 크림을 도포합니다.마지막으로, 마우스가 의식을 회복할 때까지 가열 패드 위로 옮긴 후 동물 케이지로 돌려보냅니다. 본 실험에서는 앞서 시연한 방식대로 이식한 펌프를 통해 4주 동안 angiotensin II를 주입한 후, 대동맥 확장을 시각화하기 위해 저밀도 지질단백질 수용체 결핍(low density lipoprotein receptor knockout) 마우스로부터 대동맥을 적출하였습니다. 이미지에서 관찰되는 바와 같이, 대동맥은 신상(Supra renal) 부위의 확장, 상행(ascending) 부위의 확장, 또는 두 부위 모두의 확장 등 여러 가지 서로 다른 특성을 보였으며, 마우스 한 마리는 육안상 정상적인 형태를 나타냈습니다.그 후, 상행 대동맥 확장을 측정하기 위해 빨간색 선으로 표시된 것처럼 신장 부위의 ex vivo 최대 너비를 측정함으로써 복부 대동맥의 확장을 정량화하였습니다. 그런 다음 대동맥을 그림과 같이 절개하여 핀으로 고정하였습니다. 내막 표면적은 상행 대동맥 부위에서 측정되었으며, 측정법을 숙달한 후 측정의 표준화를 보장하기 위해 이 이미지들과 이어지는 이미지들에 자를 포함하였습니다.이 절차는 질량당 완료하는 데 5분 이상 걸리지 않아야 합니다.

subcutaneous-angiotensin-ii-infusion-using-osmotic-pumps-induces

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

초음파 이미징 생쥐에서 흉부 및 복 부 대동맥 동맥 류의 luminal 크기를 결정 하는 일반적인 형식 되고있다. 이 프로토콜 생쥐에서 상승 하 고 복 부 대동맥의 안정적이 고 재현 가능한 2 차원 초음파 이미지 절차를 설명 합니다.

흉부 및 복 부 대동맥 동맥 류 크기를 결정 하는 쥐에서의 초음파 이미징

우리는 마우스에 있는 강력한 내림차순 흉부 대동맥류를 일관되게 유도하는 외과 프로토콜을 기술합니다. 절차는 왼쪽 흉부 절제술, 흉부 대동맥 노출, 대동맥 벽에 돼지 췌장 엘라스타제에 담근 스폰지의 배치를 포함한다.

국소 엘라스타아제의 뮤린 외과 모델은 내림차순 흉부 대동맥류를 유도

이 새로운 모델은 풍선 혈관 성형술, 엘라스타제/ 콜라주나아제 관류, 국소 엘라스타제 응용 및 콜라겐 교차 연결을 방해하는 경구 화합물 β-아미노프로피온리리리 투여의 조합을 사용하여 돼지에 강력한 관치 성 복부 대동맥류를 생성합니다.

돼지 모델 의 관막 복 대동맥류

본 프로토콜은 마우스에서 적외선 복부 대동맥의 출현에 엘라스타제의 직접 적용을 통해 엘라스타아제 유도 AAA 모델에 대한 표준화된 수술 방법을 기술한다.

엘라스타제의 혈관주위 적용에 의해 유도된 마우스 복부 대동맥류 모델

이 프로토콜은 반복적인 약물 치료를 위해 경정맥 카테터를 갖는 혈관 접근 포트의 아포리포단백질 E(ApoE) 결핍 마우스에서 안지오텐신 II 방출에 의해 복부 대동맥류를 유도하기 위한 삼투압 펌프의 연속 이식을 기술한다. 3D 초음파에 의한 동맥류 발달 모니터링은 등쪽 임플란트에도 불구하고 효과적으로 수행됩니다.

안지오텐신 II의 마우스 모델에서 중앙 정맥 카테터에 의한 약물 치료 유도 복부 대동맥류 및 3D 초음파에 의한 모니터링

이 프로토콜은 AAA의 병리학적 특징과 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인산칼슘 유발 복부 대동맥류(AAA) 마우스 모델을 설명합니다.

인산칼슘 유도 마우스 복부 대동맥류 모델

이 원고는 염화칼슘과 엘라스타제를 사용하여 생쥐 복부 대동맥류 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시하고 이전 모델링 방법의 장점을 결합합니다. 이 모델은 복부 대동맥류의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration에 의한 마우스 복부 대동맥류 모델

이 프로토콜은 엘라스타제를 대동맥에 직접 적용하고 음용수를 통해 ß-아미노프로피오니트릴을 투여하는 조합을 통해 마우스의 진행성 복부 대동맥류를 모델링하는 체계적인 외과적 접근 방식을 설명합니다.

국소 엘라스타제와 구강 ß-아미노프로피오니트릴의 조합에 의한 마우스의 고급 복부 대동맥류 모델링

이 프로토콜은 마우스의 흉부 대동맥 박리 유도를 위한 상세한 단계별 절차를 제공합니다. 구체적으로, 여기에는 β-아미노프로피오니트릴 및 안지오텐신 II의 필요한 용량의 정확한 계산, 삼투압 펌프 충전 절차 및 삼투압 펌프의 주입 기술이 포함됩니다.

경구용 β-아미노프로피오니트릴 및 피하 안지오텐신 II 주입에 의해 유도된 흉부 대동맥 박리의 쥐 모델

이 프로토콜은 면역 감작 성분을 포함한 AAA 모델로서, 엘라스틴 감작과 혈관 주위 엘라스타제 적용을 사용하여 C57BL/6 마우스에서 복부 대동맥류(AAA)를 반복 가능하고 신뢰할 수 있게 유도하는 방법을 제공합니다.

엘라스틴 감작과 혈관 주위 엘라스타제를 이용한 쥐 복부 대동맥류 모델의 신뢰성 높은 생성

학습하세요 삼투압 펌프를 이용한 피하 안지오텐신 II 주입법으로 쥐 대동맥류를 연구하는 방법을. 이 기술은 혈관 확장의 분자 메커니즘 규명에 활용됩니다.

삼투압을 이용하여 피하 안지오텐신 II 주입 쥐에서 유도 대동맥 동맥류 펌프

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