Name: AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포를 효율적으로 체외 배양하는 방법을. 소량의 전구 세포로 대량의 세포를 생성할 수 있어 자가면역질환 연구에 활용됩니다.

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우리는 박사에 감사드립니다. 시약을 제공 마르쿠스 만츠와 어빙 와이즈맨. 우리는 또한 각각 의학 및 NTU 병원의 국립 대만 대학에서 유세포 분석 및 우선의 셀 정렬 핵심 시설과 두 번째 핵심 연구소가 제공하는 서비스를 인정합니다. 이 작품은 과학 기술, 대만의 교육부에 의해 지원되었다 (가장 102-2320-B-002-030-MY3)과 국민 건강 연구소, 대만 (NHRI-EX102-10256SI과 NHRI-EX103-10256SI).

C57BL / 6 야생형 마우스 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만에서 구입 하였다. 모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 프로토콜 및 동물 사용 절차를 검토하고 의학의 국립 대만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 : 20120075)에 의해 승인되었다. 또한, 연구진은 실험을 수행하는 동안 동물에 고통, 고통, 또는 고통의 가능성을 줄이기 위해 모든 노력을했다. 장갑을 착용하는 동안 설명하는 모든 절차는 실온에서 수행되었다. AC-6 피더 세포의 제조 (1) 주 : AC-6.21 (AC-6 짧은) (I. 와이즈맨, 스탠포드 대학에서 제공) 기질 세포 라인 (18)하는 것은 RPMI에서 유지되어야는 15 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 피더 세포의 역할을하기 위해, AC-6 세포-γ 조사 3,000 방사선 (30Gy) 자신의 확산을 방지하기 위해 공동 문화 전에 일일와 있습니다. 참고 일그들의 통로 번호가 20 인 경우에 AC-6 세포는 유지 보수시 혼잡 방치하면 자신의 분화 지원 능력을 상실하는 경향이있다, 또는. <ol><li> 워시 AC-6 세포는 한 번에 1 ml의 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)와 열망에 의해 DPBS를 제거합니다. AC-6 37 O C 3-5 분 동안 0.8 ml의 트립신 용액 (0.05 % 트립신 및 DPBS 0.5 mM의 EDTA), 그 다음 5 % CO 2와 함께 세포 배양 배지의 10 볼륨으로 희석하여 반응을 정지 치료 단일 세포 현탁액을합니다. </li><li> 5.9x10에서 종자 AC-6 세포는 4 세포 / 웰로 12 웰 플레이트와 5 %, 37 ℃로 배양 CO 2 O / N. 주 : AC-106 세포의 밀도가 CDC 생성을 선호한다 저밀도 매우 중요하다. 5.9x10의 밀도로 시드 아니라 AC-6 CLP를에서 올라가고의 유도를위한 최적 다음날에 의해 포화 상태에 도달 할 수 / 4 셀. </li><li> γ-조사 장치를 이용하여 3000 RAD (30 Gy의)에서 AC-6 세포를 조사. 노트: AC-6을 조사하는 데 사용되는 투여 량에서 세포 증식을 방지하고, 또 CLP를 행 수지상 분화에 필요한 사이토 카인과 세포 - 세포 접촉을 제공하기에 충분히 오래 생존 그들을 유지하기 위해 최적화된다. </li><li> 대기음 매체 (10 % 열 - 불 활성화 FBS, 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신과 50 μM의 β-머 캅토 에탄올로 RPMI) 완전한 RPMI 1 ㎖로 대체합니다. </li></ol> 마우스 2. 격리 BM 세포 <ol><li> CO 2 질식 자궁 전위에 의해 쥐를 희생. 해부 트레이에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 소독. 중반 복부에 절개를하고 하반신을 덮고있는 피부를 포함하여 마우스의 말단 부분에서 피부를 제거합니다. </li><li> 반 멸균 후드에서 쥐를 해부하다. 대퇴골과 경골을 해제하려면, 무릎 관절 아래 위의 대퇴골과 경골 클립. 가위를 사용하여 뼈에서 근육을 분리하고 RPMI을 완료 5 ㎖를 포함하는 6cm 페트리 접시에 뼈를 배치합니다. </li><li> 멸균 문화 후드로 이동합니다. 완전한 RPMI와 27G 바늘에 연결된 3 ML의 주사기를 채우십시오. 가위를 사용하여 뼈의 양쪽 끝을 잘라, 부드럽게 각각의 끝에서 완료되면 RPMI를 주입하여 뼈에서 골수를 플러시 27G 바늘을 삽입합니다. </li><li> 세포 상하 3-5 배 바늘없는 주사기를 사용하여 배양 접시에서 부드러운 피펫 팅에 의해 단일 ​​세포 현탁액을 제조. </li><li> 500 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 1 mL의 ACK 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA) 1 분 동안 배양하고 완전 RPMI 10 부피로 희석하여 반응을 정지와를 Lyse 적혈구. 세포가 중력에 의해 죽은 세포 덩어리 및 조직 파편을 펠렛하기 위해 5 분간 방치한다. 참고 :이 때문에 가능한 세포의 정착에 세포가 손실 될 수로 이상 5 분을 서 있지 마십시오. </li><li> 새로운 튜브 떠나 파편에 천천히 캔트 세포 함유 뜨는원래 튜브 뒤에. </li><li> 다음, 세포 펠렛 제거하고 상층 액을 버린다 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 총 BM 세포를 재현 탁 FACS 완충액 (1X PBS + 2 % FBS +를 1mM EDTA) 100 μL (전형적으로 4-6 X 107 BM 세포 한 마우스로부터 획득된다). </li></ol> 3. FACS 분석 및 CLP를의 정렬 <ol><li> 된 Fc 수용체를 차단하기 위해 1 ~ 2 분 동안 항 CD16 / 32 (하이 브리 도마 상층 액 10 클론 2.4G2, 50 μL / 반응 또는 1-2 μg의 / 반응) FACS 버퍼에 세포에 (단계 2.9)를 추가합니다. 주 : 안티 CD16 / 32 또한 과립구, 단핵구, 및 B 림프구를 비롯한 된 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 첨가 된 Fc 블록이라고 부른다. </li><li> 동시에 주변 광을 피하고, 얼음에 15 분 동안 (4 × 7 셀) 다음과 같은 형광 염료 표지 항체와 세포를 얼룩. 항체 : PE - 복합 혈통 마커 항 CD3 포함 (0.2 μg의 각) (17A2) 항 CD8 (53에서 6.7 사이), 항 B220 (RA3-6B2), 항 CD19 (eBio1D3), 항 -CD11b (M1 / 70), 안티 GR-1 (RB6-8C5), 안티 Thy1.1 (HIS51), 안티 NK1.1 (PK136), 안티 TER119 (TER-119), 및 안티 MHC-II (NIMR-4), 0.2 μg의 항 - C-KIT-를 PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg의 안티 무서-1-FITC (D7), 0.4 μg의 안티 - M-CSFR-APC (AFS98), 0.2 μg의 항 IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> 500 X g에서 5 분 동안 3 ML의 외과 버퍼와 세포 및 원심 분리기를 씻으십시오. </li><li> 300 ㎕의 FACS에 세포가 40 μM 셀 스트레이너 버퍼 및 필터를 통해 세포를 재현 탁. </li><li> 남아있는 세포를 복구하고 동일한 셀 스트레이너를 사용하여 튜브를 정렬 멸균 외과로 필터링 추가 100 μL FACS 완충액으로 튜브를 씻으십시오. </li><li> 신호 검출에 대해 적절한 필터 및 전압을 사용하여 염색 후 즉시 유세포 분석을 수행한다. PE- 및 PE-Cy7-labelded 항체 및 633 nm의 라스를 검출하기 위해 561 nm의 레이저, FITC-, Cy5.5를 PerCP - 표지 된 항체를 검출하기 위해 488 nm의 레이저를 사용하여ER은 APC 표지 항체를 검출한다. </li><li> 씨 - 킷트 INT 무서 INT-1의 M-CSFR - - + IL-7Rα (단계 3.2에서 염색 등) 셀 소터를 사용하여 정렬 밖으로는 CLP를 다음 마커에 따른 LIN. 쿠션 완전 RPMI 8ml의 함유 15ml를 튜브에 세포를 수집 정렬. </li><li> 런의 ​​끝에서 셀 소터와 같이 분류 세포의 절대 수를 기록한다. 통상적으로, 5 × 4 CLP를 한 마우스로부터 BM을 얻을 수있다. </li></ol> 4. 공동 배양 CLP를 및 AC-6 <ol><li> 500 XG에서 10 분 동안 단계 3.7에서 분류 세포를 원심 분리하고 상층 액을 5 × 104 세포 / ㎖의 주위 세포 밀도를 얻기 위해 충분히 완전한 RPMI과 세포 펠렛을 재현 탁. 씨앗 500 세포 / 웰로 단계 1.4에서 준비 피더 세포를 포함하는 12 웰 플레이트. </li><li> 추가 100 NG FL 19 ㎖ / (후-Flt3L-IG는 M. 만츠, Universi 의해 제공 발현 시스템을 이용하여 내부에서 생성 된타이 병원 취리히, 스위스), 37 O C, 현미경 DC 개발의주기적인 영상 감시와 5 % CO 2에서 품어. 참고 : 시판되는 재조합 인간 또는 마우스 FL FL은 DC의 개발을 지원하기 위해 후 - Flt3L-IG 대용으로 사용될 수있다. </li><li> 12 일에 뜨는에서 세포를 수집하고 결과 상층 액을 결합 RPMI 배지를 완료 ㎖로 0.5 회 우물을 씻는다. 셀 스크레이퍼로 부착 세포를 0.5 ml의에게 신선한 매체를 추가하고 스크랩. </li><li> 500 x g에서 5 분 동안 세포 함유 배지에서 두 부분을 결합하고 원심. </li><li> 50 μL FACS 버퍼에 가만히 따르다 뜨는에 resuspend 세포. 50 μL 항 CD16 / 32 하이 브리 도마 뜨는 추가 된 Fc 수용체를 차단하는 1-2 분 동안 품어. </li><li> 열거하고 다음 항체 (0.05 μg의 각) 항 중 CD11c-APC (N418), 항 -CD11b-FITC 및 항 B220-PE 모든 세포를 염색. </li><li> 설명으로 세척하고 원심 분리기 세포단계 3.3에서 D. </li><li> 중 CD11c의 + 100 μL FACS 버퍼 게이트에서 세포를 재현 탁하고 CDCS (중 CD11c + CD11b를 + B220 -)에 대해 분석하고 올라가고 (중 CD11c + CD11b를 - B220의 +) (17). </li></ol>

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여기에서 우리는 CLP를 소수의에서, 특히 체외 배양 수지상의 강력한 생성을위한 시스템 및 올라가고을 설명합니다. 이 배양 시스템의 고유성은 피더로서 AC-106 세포, 간질 세포주의 이용에 기인한다. 이 방법은 예컨대 IL-7, SCF, M-CSF 및 FL 20뿐만 아니라 사이토 카인을 제공하기 위해 도시 한 내용뿐만 아니라, 필요한 세포 간 접촉 (21)은 DC 개발을 지원한다. AC-106 세포는 여러 선조 8,16,22에서 시험 관내 DC 개발 연구를 용이하게하기 위해 이전에 사용되어왔다. 우리는 CLP를 PDCS로부터의 효율적인 분화를 지원하는 AC-6 피더 세포의 최적의 농도를 시드하는 것이 중요하다는 것을 발견. 특히, PDC 개발에 적합 다음날, 포화 상태에 5.9x10 12 웰 플레이트 결과 4 γ-조사 AC-6 세포를 파종. 낮은 AC-6 세포 밀도 (3.9x10 4 / 웰 12 ...

수지상 세포 (DCS)는 면역 반응 1을 제어하는데 중요한 역할을 전문 항원 제시 세포이다. DC가 이종 있지만, 그들이 대체로 두 집단으로 분류 될 수 있고, 종래의 DC (CDCS) 및 형질 수지상 (PDCS) 2,3-. 림프 기관 외에 CDCS 및 PDCS 또한 폐, 소장, 피부 (2)를 포함한 조직에서 발견된다. CDCS 및 올라가고의 형태는 수상 돌기 모양의 돌기보다 형질 세포가 같은 것을 올라가고의 모양을 나타내는 CDCS으로 다르​​다. 또한, 일반적인 마우스 DC 마커, CD11c 양성은 더 높게 올라가고보다 CDCS에 표현된다. 올라가고 2보다 MHC 클래스 II의 높은 수준과 보조 자극 분자를 표현 둘 CD24 + CDCS, - CDCS와 CD11b를 - 또한, CDCS는 더는 CD11b + CD24로 나눌 수 있습니다. 성숙한 PDCS는 반면에, 선택적 Siglec-H 및 BST2 4를 발현하는 것으로 나타났다. 에프unctionally, CDCS는 올라가고보다 제시 세포보다 항원은; 그러나 올라가고 내가 바이러스 감염이나 염증 자극 5시 인터페론 유형의 광대 한 양을 생성 할 수 있습니다. 모두 CDCS 및 올라가고는 짧은 수명이며, 따라서 지속적으로 골수 (BM) 6,7 내 조상에서 보충해야합니다. 치명적-조사 된 마우스에 공통 골수 전구 세포 (CMP들) 및 일반 림프 조상 (CLP를)의 입양 전송 CDCS과 올라가고 양쪽 계통 8-10에서 생성 될 수 있음을 보여줍니다. 그러나, RAG1 / 2를 표현하고 고등학교의 궤적 (11, 12)에서 재 배열 DJ 세그먼트를 가지고 올라가고의 부분 집합이있다. 이 세포는 B220 마커의 발현, 핵산 감지 수용체 (TLR7 / TLR9) 및 전사 인자 (Spib 및 Bcl11a) (13)를 포함하는 B 림프구와 분자 유사성을 공유하고, 림프 혈통의 서명 될 것으로 모두가 있습니다. 따라서, CLPS 때문에 계보 유사성 올라가고의 체외 발생에 대한 좋은 선택 일 수있다. 인간 및 마우스 모두 CDCS 및 PDCS의 빈도가 매우 낮은 반면 6, 수지상 세포, 특히 CDCS는, (예를 GM-CSF 11,14 또는 FLT3 리간드와 같은 사이토 카인의 존재 BM 또는 전구 세포로부터 in vitro에서 생성 될 수있는 FL ) 공급 장치가없는 시스템 11,15,16를 사용하여. 불행하게도, 그러나, FL 11,15,16을 사용하여 시험 관내에서 PDC의 다수를 생성하는 것은 불가능하다. 이전에, 우리는 PDCS 효율적 AC-6 급전 시스템 (17)을 사용하여 시험 관내에서 CLP를 생성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 배양 시스템에서 AC-6 간질 세포주를 사용하는 장점은 세포 - 세포 접촉 CLP를 PDCS로부터 많은 수의 생성을 지원하는 사이토 카인의 분비를 제공한다는 것이다. 이 시스템으로 생산이 매우 강력하지만, 아래에 설명 된 절차에주의 복제 내가 필요합니다N 순서는 올라가고의 효율적 생성을 보장합니다.

<table><tbody><tr><td>안티-마우스 Ly6g/Ly6c (PE), 클론 RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>리니지 마커</td></tr><tr><td>안티-마우스 NK1.1 (PE), 클론 PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>리니지 마커</td></tr><tr><td>안티-마우스&nbsp; CD11b(PE), 클론M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>리니지 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD19(PE), 클론 eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>리니지 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 B220(PE), 클론 RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>리니지 마커/FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3(PE), 클론 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>리니지 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD8a(PE), 클론 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>계통 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 MHC-II(PE), 클론 NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>라이니지 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ter119(PE), 클론 TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>라이니지 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 Thy1.1(PE), 클론 HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>리니지 마커</td></tr><tr><td>안티 마우스 M-CSFR(APC), 클론 AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 c-Kit (PerCP / Cy5.5), 클론 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 Sca-1 (FITC), 클론 D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 IL-7Ra (PE / Cy7), 클론 A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11c (PerCP / Cy5.5), 클론 N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11b (FITC), 클론 M1 / 70</td><td>Biolegend</td><td></td><td>101206 FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>세포 분류기</td></tr><tr><td>FACS 분류 튜브&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>흐름 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

ac-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

형질 수지상 세포 (올라가고은) 내가 감염 또는 염증 반응 동안 응답 활성화 (IFN-1) 생산 세포를 인터페론 강력한 유형입니다. 불행하게도, PDC 기능의 연구는 림프 기관에 낮은 주파수에 의해 방해하고, 체외 DC 생성을위한 기존의 방법은 주로 올라가고 이상 CDCS의 생산을 선호. 여기에 우리가 효율적으로 체외에서 일반적인 림프 전구 세포 (CLP를)에서 올라가고을 생성하는 독특한 접근 방식을 제시한다. 특히, 프로토콜은 골수로부터 CLP를 정화 및 FLT3 리간드의 존재하에 γ 조사 된 AC-6 피더 세포와 공동 배양함으로써 PDCS를 생성하는 방법을 자세히 설명했다. 이 문화 시스템의 고유 한 특징은 CLP를가 AC-6 세포 아래 마이그레이션 및 조약돌 영역 형성 세포, PDC의 확장을위한 중요한 단계가 될 것입니다. 형태 학적으로 별개의 수지상, 즉 올라가고 및 CDCS는 7 조성 후 약 2 주 생성 된최적 조건 하에서 0-90%의 PDCS. 일반적으로이 방법에 의해 생성 PDCS의 수는 대략 CLP를 시딩 수의 100 배이다. 따라서, 이것은 견고 이들 세포의 발달 및 기능에 추가 연구를 용이하게하기 위해 필요한 PDCS의 다수를 생성되는 신규 한 시스템이다.

4-6x10 7 BM 세포의 총 일반적으로 대퇴골 한 6 ~ 8 주령, 야생형 C57BL / 6 마우스의 경골에서 격리됩니다. CLP를 밖으로 정렬하려면, 총 BM 세포는 혈통 마커 (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b를, GR-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 및 MHC-II), 안티에 대한 PE - 복합 항체로 염색 -c-KIT-를 PerCP / Cy5.5, 안티 무서-1-FITC, 안티 - M-CSFR-APC 및 항 IL-7Rα-PE / Cy7는 분석하고 세포 분류기로 분류. CLP에 대한 선별 전략은 그림 1에 나타낸다. 일반적으로, 5 × 4 CLP를 한 C57BL / 6 마우스에서 얻을 수 있습니다. 더 CLP를 얻으려면 3-4 생쥐로부터 BM 세포를 결합 할 수 있고, 프로토콜이 정렬되기 전에 적절하게 조정. 5.9x10 6 AC-6 피더 세포와 50...

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

본 절차의 전반적인 목표는 이들의 발달 연구를 위해 형질세포양 수지상세포(plasma cy dendritic cells) 또는 PDC를 생성하는 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 PDC 발달이 어떻게 조절되는가와 같은 면역 지방 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 수의 전구 세포를 사용하여 다량의 PDC를 효율적으로 생성할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 전신성 루푸스, 무정형 운동증 및 건선과 같은 PDC 관련 자가면역 질환의 치료에 적용됩니다. 오늘 시연할 절차는 실험실의 훌륭한 학생의 사례입니다. 골수 세포 수확 전날, 12-웰 플레이트의 개별 웰에 AC6 기질 세포주 세포를 5.9 × 10⁴ cells/well의 밀도로 분주하고, 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, AC6 세포에 3000 rad의 감마선을 조사하고 배양액을 1 mL의 완전 배지로 교체합니다.다음으로 적절한 수의 성체 야생형 C 57 black six 마우스를 해부 트레이에 놓고 70% ethanol로 동물을 멸균합니다. 그런 다음 트레이를 반멸균 후드로 옮기고, 각 동물의 복부 중앙에 절개선을 넣어 하지를 포함한 원위부의 피부를 제거하여 대퇴골과 경골을 노출시킵니다. 무릎 관절 위쪽의 대퇴골과 아래쪽의 경골을 절단하고, 뼈를 수집함과 동시에 가위로 뼈에서 근육을 분리합니다. 수집한 뼈를 5 mL의 완전 RPMI가 들어 있는 6 cm Petri dish에 넣고, Petri dish를 멸균 배양 후드로 옮깁니다.이제 27 gauge 바늘이 장착된 3 mL 주사기에 complete RPMI를 채우고, 가위를 사용하여 각 뼈의 양 끝단을 절단합니다. 바늘을 각 뼈에 삽입하고 양 끝에서 complete RPMI를 부드럽게 한 번씩 주입하여 골수를 씻어냅니다. 그런 다음 바늘을 제거한 상태에서, 배양 접시 내의 세포를 3~5회 부드럽게 흡입 및 분주하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.세포를 원심 분리한 후, 1 mL의 CK buffer로 적혈구를 용해시키고 10배 부피의 complete RPMI를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 1분 후, 죽은 세포 덩어리와 잔해물이 5분 동안 가라앉도록 둔 다음 상층액을 새 튜브에 조심스럽게 따라냅니다. 그 후 세포를 다시 원심 분리하고, 전체 골수 세포를 100 µL의 fax buffer에 현

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

이 비디오는 성체 쥐의 골수에서 수지상 세포(T 세포를 활성화하는 핵심 항원 제시 세포)를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

골수 유래 수지상 세포 생성: 마우스 골수에서 수지상 세포를 생성하는 방법

출처: Cruz-Adalia, A., et al. T 세포는 수지상 세포에서 이식을 통해 박테리아를 포획합니다. J. Vis. 경험. (2016).이 비디오는 항원 특이적 T 세포-수지상 세포 상호작용을 통한 박테리아 형질감염을 보여줍니다. 난아알부민 펩타이드를 나타내는 박테리아에 감염된 수지상 세포는 직접 또는 막으로 분리된 T 세포와 함께 배양됩니다. 직접 접촉은 면역학적 시냅스 형성을 가능하게 하여 박테리아 전달을 가능하게 하는 반면 막은 상호 작용을 방지합니다. 그런 다음 세포외 박테리아를 제거하기 위해 겐타마이신 처리가 수행됩니다.

면역학적 시냅스 형성을 통한 T 세포의 시험관 내 세균 이식

이 동영상은 일반적인 림프구 전구 세포(CLP)에서 형질세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)를 생성하는 체외 분석을 보여줍니다. Fms-like tyrosine kinase-3 ligand(FL)가 있는 상태에서 γ조사된 공급 세포와 함께 정제된 CLP를 공동 배양하면 CLP는 비부착성 pDC로 분화되며, 유세포 분석을 사용하여 그 존재를 확인합니다.

In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

미성숙 수지상 세포는 내성과 내성 사이의 균형을 조절하기 위해 내성 또는 성숙 수지상 세포로 선택적으로 분화될 수 있습니다. 이 연구는 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(moDC), 체외 내성 및 성숙한 moDC(대사 표현형이 다른 moDC)를 생성하는 방법을 제시합니다.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

여기에서 우리는 창자 호밍 조절 T 세포 유도의 생체 내 확대를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 수지상 세포는 활성 비타민 D (1,25-디하이드록시 비타민 D 또는 1,25 [OH]2D) 및 활성 비타민 A (레티노산 또는 RA) 드 노보의 고농도를 국부적으로 생산하도록 설계되었습니다.

내장 호밍 규제 T 세포 유도의 생체 내 확대

배우세요 AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포를 효율적으로 체외 배양하는 방법을. 소량의 전구 세포로 대량의 세포를 생성할 수 있어 자가면역질환 연구에 활용됩니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

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