AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

본 절차의 전반적인 목표는 이들의 발달 연구를 위해 형질세포양 수지상세포(plasma cy dendritic cells) 또는 PDC를 생성하는 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 PDC 발달이 어떻게 조절되는가와 같은 면역 지방 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 수의 전구 세포를 사용하여 다량의 PDC를 효율적으로 생성할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 함의는 전신성 루푸스, 무정형 운동증 및 건선과 같은 PDC 관련 자가면역 질환의 치료에 적용됩니다. 오늘 시연할 절차는 실험실의 훌륭한 학생의 사례입니다. 골수 세포 수확 전날, 12-웰 플레이트의 개별 웰에 AC6 기질 세포주 세포를 5.9 × 10⁴ cells/well의 밀도로 분주하고, 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, AC6 세포에 3000 rad의 감마선을 조사하고 배양액을 1 mL의 완전 배지로 교체합니다.

다음으로 적절한 수의 성체 야생형 C 57 black six 마우스를 해부 트레이에 놓고 70% ethanol로 동물을 멸균합니다. 그런 다음 트레이를 반멸균 후드로 옮기고, 각 동물의 복부 중앙에 절개선을 넣어 하지를 포함한 원위부의 피부를 제거하여 대퇴골과 경골을 노출시킵니다. 무릎 관절 위쪽의 대퇴골과 아래쪽의 경골을 절단하고, 뼈를 수집함과 동시에 가위로 뼈에서 근육을 분리합니다. 수집한 뼈를 5 mL의 완전 RPMI가 들어 있는 6 cm Petri dish에 넣고, Petri dish를 멸균 배양 후드로 옮깁니다.

이제 27 gauge 바늘이 장착된 3 mL 주사기에 complete RPMI를 채우고, 가위를 사용하여 각 뼈의 양 끝단을 절단합니다. 바늘을 각 뼈에 삽입하고 양 끝에서 complete RPMI를 부드럽게 한 번씩 주입하여 골수를 씻어냅니다. 그런 다음 바늘을 제거한 상태에서, 배양 접시 내의 세포를 3~5회 부드럽게 흡입 및 분주하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

세포를 원심 분리한 후, 1 mL의 CK buffer로 적혈구를 용해시키고 10배 부피의 complete RPMI를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 1분 후, 죽은 세포 덩어리와 잔해물이 5분 동안 가라앉도록 둔 다음 상층액을 새 튜브에 조심스럽게 따라냅니다. 그 후 세포를 다시 원심 분리하고, 전체 골수 세포를 100 µL의 fax buffer에 현탁하여 유세포 분석법으로 공통 림프구 전구세포(CLPs)를 분석합니다.

다음으로 anti CD 16 to 32를 사용하여 1~2분 동안 세포를 FC 블록킹하고, 이어서 적절한 항체 칵테일로 세포를 동시에 염색합니다. 얼음 위에서 15분 후, 3 mL의 FACS 버퍼로 세포를 세척하고 펠릿을 300 µL의 신선한 FACS 버퍼에 재부유시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 40 µm 스트레이너로 여과하고, 적절한 필터와 전압을 사용하여 유세포 분석기로 즉시 세포를 분리합니다.

8 mL의 완전 RPMI가 들어 있는 15 mL 튜브에 대상 세포를 수집합니다. 고도로 농축된 PDCM 집단을 생성하려면, Z6 feeder 시스템을 이용한 체외 배양을 위해 수확한 골수 세포에서 적절한 CLP 집단을 분리하는 것이 매우 중요합니다. 분리 작업이 끝나면 세포를 원심 분리하고, CLP 세포 펠렛을 충분한 양의 완전 RPMI로 재부유하여 세포 밀도가 약 5 × 10⁴ cells/mL가 되도록 합니다.

다음으로, AC six 피더 세포가 포함된 12-웰 플레이트의 각 웰에 500개의 세포를 파종하고, 100 ng/mL의 FL three 리간드를 추가하여 공동 배양하고, 현미경으로 수지상 세포(DC)의 발달 과정을 주기적으로 관찰하며 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양합니다. 12일째에 공동 배양 상층액에서 세포를 회수하고, 각 웰을 0.5 mL의 완전 RPMI 배지로 한 번 세척한 후, 회수된 상층액과 세척액을 모두 모읍니다. 그다음 각 웰에 0.5 mL의 신선한 배지를 넣고 셀 스크래퍼를 사용하여 부착된 세포를 분리합니다.

분리된 세포를 부유 세포와 합친 후, 생성된 세포 현탁액을 원심분리합니다. 펠렛을 50 µL의 fax buffer에 다시 현탁합니다. 그 다음 세포 수를 측정하고, FC blocking 후 CD 11 C, CD 11 b 및 B two 20 발현을 염색합니다.

앞서 시연한 바와 같이, 공배양된 세포를 분석하여 전형적인 CD11c 양성, CD11b 양성, B220 음성 및 형질세포양 CD11c 양성, CD11b 음성, B220 양성 수지상세포(DC) 집단이 총 4~6 x 10⁷개 존재 하는지 확인할 수 있습니다. 골수 세포는 일반적으로 6~8주령의 야생형 C57BL/6 마우스의 대퇴골과 경골에서 분리하며, 1마리의 C57BL/6 마우스에서 통상적으로 5 x 10⁴개의 공통림프구전구세포(CLP)를 얻습니다. 앞서 시연한 유세포 분석 기반의 분류 후, AC6 피더 세포와 3~4일간 공배양하면 cobblestone area 형성 세포(cobblestone area forming cells)가 나타나기 시작하며, 둥근 모양의 형질세포양 수지상세포(Plasmacytoid DC)가 cobblestone area 형성 세포 위에 부유한 상태로 관찰됩니다.

8일째까지, plasmacytoid DC의 수는 12일에서 14일 사이에 정점에 도달하며, 이 시점에서 세포들은 완전히 발달한 후 세포사멸(apoptosis)을 일으키기 시작하여 그 수가 점차 감소합니다. Conventional DC 콜로니는 더 늦은 6일에서 8일 사이에 나타나며, 더 크고 방추형인 형태를 띠며 부착됩니다. 유세포 분석 결과, 공동 배양액의 91%는 CD11c 양성, CD11b 음성, B220 양성인 plasmacytoid DC였으며, 6%는 CD11c 양성, CD11b 양성, B220 음성인 conventional DC로 나타나, 이 방법을 통해 원래의 CLP 집단으로부터 plasmacytoid DC의 수가 100배 확장되었음을 보여주었습니다.

이 절차를 수행할 때는 현상 후 clp를 추가하기 전에 a c six cell의 상태가 양호하고 C 밀도가 적절한지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 수지상세포(DC) 생물학 연구자들이 서로 다른 투사체로부터 DC 발달을 연구할 때 적은 수의 투사체를 사용해야 했던 제한 사항을 극복할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, C six BEAT 시스템을 사용하여 CLP로부터 체외(in vitro)에서 PC를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.