피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 영양 공급이 없는 조건에서 인간 말초 T 세포로부터 유도 만능 줄기 세포 또는 IPC를 생성하는 것입니다. 이 방법은 IPS 세포를 임상에 적용하는 방법을 포함하여 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가능한 유해 리팩토링을 포함하지 않고 IPS 세포를 경화시킬 수 있어 병원성의 위험을 줄일 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 개발 IPS 세포를 정의되지 않은 병원체에 노출시킬 위험을 줄이는 것과 결합된 이 침습적 세포 샘플링으로 인해 세계적으로 임상적으로 관련된 IPS 세포 기반 치료법을 확장합니다. 따라서 이 방법은 IPS 서비스 임상 치료에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 질병 모델링 조건과 같은 다른 영역에도 적용할 수 있습니다.

헤파린화된 전혈 10ml를 DPBS 피펫 10ml로 희석하여 활성화된 인간 T 세포를 준비하기 시작합니다.15ml의 폴 용액을 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 튜브의 내벽을 따라 흐르는 희석된 혈액을 천천히 피펫으로 하여 용액 위에 겹을 이룹니다.

인터페이스를 방해하지 않도록 주의하십시오. 실온에서 400회 G로 튜브를 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 아래쪽의 투명한 층, 단핵 세포를 포함하는 얇은 흰색 층 및 위쪽 유백색 플라즈마 층을 포함한 세 개의 층을 관찰합니다.

맞춤 구멍 용액을 전달하지 않고 단핵 세포층을 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 이동합니다. 다음으로 DPBS를 추가하여 총 부피를 10밀리리터로 만듭니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 200배 G로 원심분리합니다.

상등액을 버리고 10ml의 DPBS로 세포를 세척하고 200배 G에서 튜브를 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거합니다. 그런 다음 1 밀리리터의 KBM 5 0 2 배지를 세포에 첨가하고 혈구 분석기를 사용하여 세포 배양 접시를 준비하고 PBS의 항 인간 CD 3 항체 용액 밀리리터 당 10 마이크로 그램으로 6 웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 최소 30분 동안 배양합니다.

배양 후, 플레이트 8로부터 항체 용액을 제거하고 PBS 시드로 단핵 세포를 2.5 곱하기 10 내지 평방 센티미터당 5 번째 세포의 총 부피에서 2 밀리리터의 KBM 5 0 2 배지 코팅된 6 웰 플레이트에서 배지를 변경하지 않고 3 내지 7일 동안 세포를 배양하고, 이 시점에서 T 세포는 3일에서 7일 후에 유창성에 도달해야 합니다. 활성화된 T-세포를 15ml 원뿔형 튜브와 200배 G로 5분 동안 원심분리하여 이동시킵니다. SNAT를 제거하고 새 KBM 5 0 2 매체 1ml를 추가합니다.

세포를 1.5 배 10 번 6 개의 세포에 6 개의 세포를 계산합니다 2 밀리리터의 KBM 5 0 2 매체를 안티 CD 3 항체 코팅 6 웰 플레이트의 각 웰에 다음 해동 OC 3 SOX 2, KLF 4 및 C-M-Y-C-H 및 L sendi 바이러스 용액을 각 엔지니어링된 센다이 바이러스에서 각 웰에 개별적으로 그리고 10의 감염 배수. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 피펫으로 감염된 세포를 모아 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

200배 G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 2ml의 새 KBM 5 0 2 배지를 추가합니다. 6웰 플레이트의 웰에 있는 세포를 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.

세포를 후퇴시키기 위해 먼저 기저막 매트릭스 용액을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 해동하고 0.2 밀리리터의 생각 용액을 10 밀리리터의 DMM F 12 중간 플레이트에 용해시키고 5 밀리리터의 기저 멤브레인 매트릭스 용액을 100 밀리미터 접시에 녹입니다. 세포를 파종하기 전에 매트릭스가 접시를 코팅할 수 있도록 플레이트를 최소 30분 동안 실온에 두십시오. 한편, SAI 바이러스에 감염된 T 세포를 15리터 원뿔형 튜브에 모아 200배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 1ml의 새로운 KBM 5 0 2 배지에 입천장을 재현탁시키고 30분의 배양 기간 후에 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다. 두 개의 플레이트에서 기저막 매트릭스 용액을 제거한 다음 다섯 번째 세포에 10 배 1 배, 6 개의 세포에 대해 별도로 1 배 10을 재현탁 시켜 ipsc에 대한 피더 무 세포 배양 배지 인 10 밀리리터의 새로운 M-T-E-S-R 배지에 재현탁합니다. 각 셀 현탁액을 별도의 100mm 플레이트에 피펫팅합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 20일에서 30일 후에 격일로 매체를 변경합니다. 배아 줄기세포 군집과 유사한 군체가 나타나야 합니다.

각 웰에 1ml의 기저막 매트릭스 용액을 실온에서 30분 동안 배양하여 IPSC 확장을 위한 6개의 벽판을 준비합니다. 한편, 실체 현미경으로 IPSC 콜로니가 포함된 배양 플레이트를 보고 20마이크로리터 피펫으로 긁어내어 개별 콜로니를 분리합니다. 각 군체를 우물과 20마이크로리터의 M-T-E-S-R 매체가 들어 있는 96개의 벽 플레이트로 옮깁니다.

콜로니를 옮긴 후 각 웰에 200마이크로리터의 M-T-E-S-R 배지를 추가하고 위아래로 피펫을 넣어 콜로니를 파괴합니다. 6개의 웰 플레이트에서 기저막 매트릭스 용액을 제거한 후, 개별 콜로니에서 각 웰로 세포를 옮긴 다음 2ml의 M-T-E-S-R 배지를 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 무공급 배양 및 무혈청 배지를 사용하여 격일로 배지를 교체하고, 인간 말초 T 세포로부터 ipsc를 생성하였다. 면역형광 염색을 통해 nano T three four SSEA four, TRA one 60 및 TRA 180 1을 포함한 전형적인 만능 세포 마커의 발현이 밝혀졌습니다.

이러한 파생된 IPSE 라인에서. 이 절차를 시도하는 동안 모든 중요한 무균 및 생물 안전 고려 사항을 모두 고려하여 모든 단계를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.