셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 FUCCI 마우스로 알려진 형질전환 형광 유비퀴틴 세포 주기 마우스의 뇌실하구역에서 분리한 분류된 신경줄기세포와 그 후손 세포의 세포 주기 진행 과정을 추적하는 것입니다. 이는 먼저 성체 형질전환 마우스 뇌의 뇌실하구역을 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 파파인 처리를 통해 신경 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리하는 것입니다.

다음으로, 휴지기 신경 줄기세포, 활성화된 신경 줄기세포, 일시 증폭 세포, 그리고 미성숙 및 이동 중인 신경모세포를 식별하기 위해 항체를 사용하여 뇌실하구역의 서로 다른 신경발생 세포군을 표지합니다. 마지막 단계로 FACS를 사용하여 세포를 신선한 배양 배지로 직접 분리한 후 poly D lysine이 코팅된 플레이트에 도말합니다. 최종적으로, 다양한 형질전환 세포들이 세포 주기 동안 서로 다른 시점에 형광을 발하는 것을 이용해, 연속 시간 경과 비디오 현미경으로 도말된 세포의 세포 주기 진행 과정을 연구합니다.

세포 분리 기술과 Fuji 기술을 결합하면 하측 뇌실 구역(sub ventricular zone)의 서로 다른 세포 집단을 시각화하고 분리할 수 있어, 성체 뇌의 특성과 역동성을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 노화 및 뇌 병증과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 전날, 멸균된 검은색 벽의 96-웰 플레이트의 각 웰 바닥을 코팅하기 위해 10 µg/mL poly D lysine 용액 200 µL를 분주합니다. 플레이트의 덮개를 닫고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날.

poly D lysine 용액을 제거하고 멸균 증류수로 웰을 3회 헹군 후, 층류형 후드 내에서 최소 2시간 동안 플레이트를 건조시킵니다. 즉시 사용하지 않을 경우, 건조된 코팅 플레이트를 4°C에서 최대 7일 동안 보관하십시오.

다음으로, 파파인(Papain) 해리 용액을 준비하고 혼합물을 0.2 µm 필터로 여과하여 멸균합니다. 사용 전 용액을 37 °C로 예열하십시오. 또한, 멸균된 TM F 12 배지에 0.7 mg/mL의 trypsin inhibitor type two를 첨가하여 프로테아제 억제제 용액을 준비합니다.

0.2 micron 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 사용 전 용액을 37 °C로 예열합니다. 갓 해부한 성체 fucci red 마우스 뇌의 하심실구역(sub ventricular zone)을 0.6% Glucose가 포함된 PBS가 든 페트리 접시에 넣고, 큰 조각이 남지 않을 때까지 조직을 잘게 다집니다. 그 후 모든 내용물을 15 milliliter 튜브로 옮기고 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

조직을 펠렛화한 후, 상층액과 현탁액을 제거합니다. 0.01 mg/mL의 dna.One이 첨가되어 미리 데워둔 파파인 1 mL에 조직을 현탁합니다. 혼합물을 37 °C의 항온수조에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음 200 ×g에서 5분 동안 다시 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 효소 소화를 중단시키기 위해 미리 데워둔 OVO MOID 용액 1 mL를 첨가합니다. 이어서, P 1000 마이크로 피펫 팁을 사용하여 잘게 자른 조직을 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 해리시키기 위해 피펫팅하며 조심스럽게 20회 위아래로 섞어줍니다.

세포에 추가적인 스트레스를 줄 수 있으므로 혼합물에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 새로운 15 milliliter 튜브에 세포 현탁액을 넣고 멸균된 20 micron 필터로 여과하십시오. 세포 손실을 방지하기 위해 0.15%BSA가 포함된 PBS 2 milliliter로 세포 필터를 세척하십시오.

그 다음 세포 현탁액을 200 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 각 마우스에서 얻은 세포를 0.15% BSA가 포함된 100 µL의 PBS에 현탁하여 FACS 염색을 수행합니다.

동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 마우스 한 마리에서 얻은 세포의 1/10을 사용하여 네 가지 대조군 각각을 준비합니다. 세포 분리에 사용되는 각 튜브에 여기에 나열된 1차 항체를 첨가하고, 이 혼합물을 4°C의 암소에서 20분 동안 배양합니다. 1차 항체 배양 후, 0.15% BS, A가 포함된 PBS 1mL로 세포를 세척한 다음, 200 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다.

뇌 하나당 0.15% BSA가 포함된 200 µL의 PBS에 세포를 재현탁하고 적절한 세포 분류용 튜브에 옮깁니다. 세포 분류용 튜브를 얼음에 두고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하기 위해 세포 분류 직전에 2 µg/mL 농도의 Hoechst 33258 염색약과 같은 생존 염색약을 세포에 첨가합니다.

다음으로, 음성 대조군 튜브의 세포를 유세포 분석기로 분석하고, 측방 산란(side scatter) 및 전방 산란(forward scatter) 파라미터를 사용하여 세포를 선택합니다. 음성 분획의 훅(hooks)만 게이팅하여 사멸 세포를 제외하고, 음성 분획의 펄스를 선택하여 더블렛(doublets)을 제외합니다. 단일 색상 대조군을 분석하고 필요한 경우 광전 증배관(photo multiplier tube) 전압을 조정합니다.

소프트웨어의 보정 창에서 색 보정을 수행하십시오. 세 가지 형광 마이너스 원(fluorescence minus one) 대조군을 실행하고 소팅 게이트를 설정하십시오. 모든 게이트 설정이 완료되면, 라벨링된 세포를 100 µL의 배양액에 직접 소팅하십시오.

갓 분리된 세포를 웰당 1000~3000 cells의 밀도로 poly-decyline 코팅된 96 well plate에 300 µL의 배양액과 함께 분주합니다. 배양 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

세포 부착을 위해, 부착된 온도 조절 챔버를 5% carbon dioxide 분위기 하에서 37 °C로 예열하여 공초점 레이저 주사 현미경의 이미징 준비를 마칩니다. 예열된 현미경 챔버 내부에 96-well 플레이트를 배치하고 첫 번째 well의 초점을 맞춥니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 열고 메인 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 acquire acquisition controls와 DEAC acquisition을 선택합니다.

TI 패드를 열고 다음으로 plan A PO VC 20 XDIC 대물렌즈를 선택하려면, acquire acquisition controls를 클릭한 후 타임랩스 옵션을 엽니다. 각 웰의 중심을 스테이지 위치로 설정하고, 대형 이미지 옵션을 7 by 7 mm²로 선택하십시오. 각 중심 주변의 모자이크 이미지를 관찰하십시오.

대형 모자이크 이미지의 오버랩을 5%로 설정하고, 24시간 동안 20분마다 사진이 촬영되도록 빈도를 설정합니다. One Plus 설정에서 메뉴 바에 나열된 각 형광에 대한 광전증폭관(photo multiplier tube) 전압 레벨을 선택합니다. 512 x 512 픽셀 형식의 고속 공진 스캐너(high speed resonance scanner)를 사용하여 이미지를 획득하도록 선택하고, DIC를 사용하여 세포를 시각화합니다.

그 다음 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. ND 획득 창에서 run now 버튼을 선택하여 획득을 시작하십시오. 모든 것이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 최소 한 번의 루프가 완료될 때까지 컴퓨터 작업 과정을 모니터링하십시오.

타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 G1기를 적색 형광으로 추적하기 위해 Fuji red 마우스를 사용하였습니다. 분리된 세포는 첫 번째 성장기 동안 적색 형광을 띠며, 합성 단계인 두 번째 성장기와 유사분열 동안에는 색상 목록에 따라 변화합니다. Lex 양성 eeg FR 양성 및 eeg.

젊은 성체 및 중년 쥐의 FR 양성 세포를 플레이팅하고 현미경을 통해 추적하였습니다. 젊은 쥐와 중년 쥐 모두에서 Lex 양성 EGFR 양성 세포와 EG FFR 양성 세포 간의 S기 및 G2/M기 길이는 차이가 없었습니다. 그러나 첫 분열부터 적색 형광이 사라질 때까지의 다음 성장기 길이는 G1기 길이의 증가로 인해 노화된 세포에서 더 긴 것으로 나타났습니다.

분주 5일 후 얻은 뉴로스피어(neurospheres)는 고령 쥐에서 얻은 Lex 양성 EGFR 양성 세포에서 더 작게 나타납니다. 12마리의 쥐를 대상으로 작업할 때, 해부 및 FACS 준비에 3시간, 세포 분류(cell sorting)에 3시간을 초과하지 않도록 전체 프로토콜을 구성해야 합니다. 같은 날 너무 많은 쥐를 대상으로 작업하면 세포 분류 시간이 길어져 세포 사멸이나 세포 분화가 증가할 수 있음을 유의하십시오.