Morpholinos를 사용한 유전자 침묵

유전자 침묵 기술은 발달 생물학의 분야에서 일반적으로 이용됩니다. Morpholino 기반 녹다운 접근은 연구원이 중요한 세포 프로세스에 관련시킨 유전자를 확인하고 특성화하는 것을 일상적으로 허용합니다. 안티센스 모르폴리노는 높은 효능, 높은 특이성 및 저렴한 비용으로 인해 쥐, 병아리 및 제브라피시를 포함한 많은 모델 시스템에서 널리 사용되고 있습니다.

이 비디오는 형태 항문 메커니즘 및 미세 주입 전략, 주요 실험 제어 및 형태소가 척추 동물 개발을 조사하기 위해 오늘날 실험실에서 어떻게 사용되는지에 대한 개요를 제공합니다.

Morpholinos는 살아있는 세포 및 유기체에 있는 RNA 전사체의 번역을 억제하는 쪽으로 처음으로 개발되었습니다. 일반적으로, 모르폴리노는 중전된 중전된 중고골에 의해 연결된 25개의 올리고뉴클레오티드로 구성된 합성 분자이다.

그러나 모르폴리노는 DNA같이 많이 보일 수 있더라도, 인산염 설탕 백본에서 찾아낸 설탕 단 대신에 모르포린 고리를 포함합니다. 이 간단한 변환은 세포의 모르폴리노 안정성을 증가시키고 생산 비용을 낮춥습니다.

세포 내부, 모르폴리노는 보완적인 염기 페어링에 의해 관심있는 RNA를 표적으로 합니다. 모르폴리노가 혼성화되는 RNA의 위치는 행동의 특정 메커니즘을 결정합니다.

스플라이스 차단 모르폴리노는 특정 접합에 결합하고 적절한 성적 증명서 처리를 억제하는 반면, 번역 차단 모르폴리노는 번역 시작 부위 근처의 유전자의 번역되지 않은 영역 내에 결합되어 리보솜 조립을 방지합니다. 두 가지 유형의 모르폴리노(morpholinos)는 기능성 표적 단백질의 발현을 감소시다.

모르폴리노를 사용하여 실험을 계획할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. Morpholinos는 여러 모델 시스템에서 사용할 수 있으므로 생물학적 문제를 해결할 수있는 모델을 선택하는 것이 중요합니다.

Morpholinos는 상업적으로 합성되고, 직업적인 디자인 지원은 연구원에게 무료로 유효합니다, 그러나 순서특정이기 때문에, 모든 특정 morpholino 표적을 위한 유전자 정보는 디자인의 앞에 공급되어야 합니다.

제브라피시 모델 시스템에서는 제브라피시의 진화조상에서 발생한 전체 게놈 중복 사건으로 인해 다른 척추동물에서 발견되는 단일 유전자의 두 개의 사본이 종종 있습니다. 따라서, 두 제브라피시 유전자의 녹다운은 인간 발달에 있는 단백질 결핍을 성공적으로 모델링하기 위하여 필요할 지도 모릅니다.

좋은 실험 컨트롤을 설계하는 것은 대상 모르폴리노를 설계하는 것만큼 중요합니다. 주어진 모르폴리노는 다른 유전자에 특정 순서에 결합할 수 있습니다. 관찰된 현상변 변화가 관심 유전자의 녹다운 에 기인한다는 것을 확인하기 위하여, 동일 유전자에 상호 보완하는 독립적이고, 비 겹치는 모르폴리노스를 사용하는 것이 좋습니다.

이제 모르폴리노 실험 디자인을 다루었으니, 모르폴리노가 제브라피시에 어떻게 도입되는지 살펴보겠습니다.

여기에서, 우리는 제브라피시로 모르폴리노 미세 주입을 설명할 것입니다. 미세 주입의 세부 사항에 대한 자세한 통찰력과 지침은 "Zebrafish 미세 주입 기술"이라는 JoVE 과학 교육 비디오를 참조하십시오.

Morpholinos는 전형적으로 노른자 또는 세포 세포질로 1- 및 4 세포 단계 사이 제브라피시 배아로 주입됩니다. 배아 세포 사이의 세포질 연결은 유기체 전체에 걸쳐 수용성 모르몰리노의 급속한 확산 및 유비쿼터스 전달을 허용합니다. 모르폴리노는 제브라피시 배아가 28.5°C에서 제기되기 때문에 세포에서 안정적입니다.

최적의 사출 농도 및 볼륨은 각 모르폴리노에 대해 경험적으로 테스트되어야 합니다. 전형적으로, 주입된 배아의 50-75% 이상에서 정의된 신뢰할 수 있는 표현형이 있는 가장 낮은 투여량은 배아 치사또는 원치 않는 오프타겟 효과를 피하기 위해 사용된다.

대부분의 모르폴리노 제브라피쉬 표현형은 수정 후 처음 3일 동안 확인되며, 유전자 침묵은 일반적으로 5일째까지 유효하다. 스플라이스 블로킹 모르폴리노의 경우 RT-PCR을 사용하여 원어민 및 변경된 성적증명서의 상대적 양을 식별할 수 있습니다. 번역 차단 모르폴리노의 경우, 유전자 녹다운 의 수준은 서양 얼룩에 의해 평가 될 수있다.

Zebrafish 배아의 급속한 외부 발달 및 투명성은 많은 초기 생물학적 과정을 쉽게 관찰할 수 있게 해줍니다. Morpholino 표현형은 일반적으로 밝은 필드 또는 형광 현미경 검사를 사용하여 형태를 분석하여 득점 할 수 있습니다, 뿐만 아니라 행동을 평가하여.

모르폴리노 표현형이 정의된 후, RNA 구조는 표적 특이성을 입증하기 위해 수행될 수 있다. 내인성 mRNA의 모르폴리노 녹다운에 이어, 합성 mRNA가 주입되어 동일한 단백질을 인코딩하지만 모르폴리노 표적 서열을 포함하지 는 않는다. 이 주입 된 RNA가 유기체의 야생 형 표현형을 복원 할 수 있다면, 관찰 된 모르폴리노 표현형이 특히 대상 유전자가 쓰러져 있기 때문이라고 결론을 내릴 수 있습니다.

이제 모르폴리노가 무엇이고 어떻게 조절된 모르폴리노 실험을 수행할 수 있는지에 대한 느낌이 들게 되었으므로 오늘날 생물학적 실험실에서 모르폴리노가 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다.

세포 생물학에서, 모르폴리노는 초기 발달 과정을 이해하는 데 사용됩니다. Kupffer의 소포에서 Cilia 생성 유체 흐름은 제브라피시의 왼쪽 오른쪽 패터닝을 제어하는 한 가지 예입니다. 유체 흐름은 제어 주입 된 배아에서 시계 반대 방향으로 실행되지만, 모양 세포 조직을 조절하는 유전자의 침묵은 유체 속도와 방향을 방해합니다.

Morpholinos는 또한 인간 유전 질병을 신속하고 안정적으로 모델링하는 데 매우 적합합니다. 기능 상실 표현형은 신장 낭종을 표시하는 인간 이형성증의 제브라피시 모델에서 볼 수 있듯이 단백질 발현을 조작하여 쉽게 재현할 수 있으며, 심근 부종 및 말린 꼬리. 추가적으로, 병원성 돌연변이는 형태소 질병 표현형을 구출하기 위하여 야생 형 또는 돌연변이 mRNA를 사용하여 생체 내에서 급속하게 분석될 수 있습니다.

모르폴리노는 다른 방법으로 살아있는 세포로 소개될 수 있기 때문에, 그(것)들은 기관 재생 및 발달을 공부에 있는 높게 평가됩니다. 특정 조직으로 모르폴리노의 전기 자극에 이어 미세 주입은 연구원이 성인 얼룩말피의 지느러미 성장과 망막 형성을 연구할 수 있게 해 주었으며, 그 뒤를 따랐다.

당신은 단지 모르폴리노와 유전자 침묵에 JoVE의 소개를 보았다. 이 비디오에서는 모르폴리노의 구조와 메커니즘, 사용하기 위한 일반적인 응용 분야 및 표적 유전자 침묵의 효능 및 효과를 평가하는 중요한 방법에 대해 논의했습니다. 설계가 용이하고, 매우 구체적이며, 비용 효율적이기 때문에, 모르폴리노는 역유전학 분야에서 중요한 역할을 할 것이며, 질병 및 발달에 관련된 유전자를 기능적으로 분석하는 데 도움을 줍니다. 시청해 주셔서 감사합니다!