2.6: 전체 마운트 In Situ 하이브리드화

whole-mount in situ hybridization은 과학자들이 배아 발달의 분자적 기초를 이해할 수 있도록 하는 강력한 기술입니다. "Whole-mount"는 조직 절편뿐만 아니라 전체 배아가 사용된다는 것을 나타냅니다. "In situ"는 "제자리에"를 의미하는 라틴어 문구입니다. 마지막으로, "혼성화(hybridization)"는 합성으로 생산된 RNA 분자가 유기체의 세포 내 mRNA 전사체에 상보적으로 결합하는 것을 의미합니다.

이 비디오는 발달 장애를 더 잘 이해할 수 있도록 이 기술의 절차, 예상 결과 및 선택된 응용 프로그램을 보여줍니다.

유기체 형태 형성의 기저에 있는 유전자는 배아 발달 과정에서 시간적, 공간적으로 제한된 패턴으로 발현됩니다.

리보프로브(riboprobe)라고 하는 합성으로 생산된 RNA 프로브는 상보적 결합을 통해 mRNA를 검출하는 데 사용됩니다. 리보프로브는 디니트로페놀(dinitrophenol), 비오틴(biotin) 또는 디옥시게닌(digoxygenin)과 같은 "haptens"를 포함하는 특수 뉴클레오티드로 표지됩니다. 합텐(haptens)은 더 큰 분자에 부착될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이므로 항체 결합의 표적입니다. 이러한 검출 항체는 양고추냉이 과산화효소 또는 알칼리성 인산가수분해효소와 같은 효소에 접합되어 형광 또는 유색 염료가 증착될 수 있는 화학 반응을 촉매합니다.

전통적인 in situ hybridization 기술은 내부 구조의 검출을 용이하게 하기 위해 배아의 조직 절편을 준비해야 합니다. 결과적으로, 유기체 전체의 유전자 발현에 대한 완전한 평가는 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 5-6μm 조직 절편에서 재구성되어야 합니다. 그러나 whole-mount 기술의 개발로 전체 배아 내에서 더 먼 거리에 걸친 유전자 발현 분석을 얻을 수 있습니다.

whole-mount in situ hybridization의 원리를 살펴본 후 실험적인 프로토콜을 단계별로 살펴보겠습니다.

이 절차의 첫 번째 단계는 조사할 모델 유기체에서 표적 염기서열을 식별하는 것입니다. 그런 다음 RNA 중합효소 개시 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 표적 DNA 염기서열을 증폭합니다. 증폭된 DNA 템플릿은 이제 hapten-labeled nucleotides를 사용하여 in vitro에서 전사됩니다. 이 hapten 표지된 리보프로브는 이제 혼성화 단계를 위한 준비가 되었습니다.

배아는 단백질을 안정화하고 RNase로부터 보호하는 가교 시약인 포름알데히드(formaldehyde)와의 고정을 통해 혼성화를 위해 준비됩니다. 고정 후, 포름알데히드는 Tween과 같은 소량의 세제를 함유한 인산염 완충 식염수로 배아를 여러 번 세척하여 제거합니다. 세포 지질을 제거하고 조직으로의 프로브 침투를 용이하게 하기 위해 배아는 등급이 매겨진 일련의 메탄올 세척(예: 25%, 50%, 75%, 100% 메탄올)으로 탈수됩니다. 배아는 -20°C에서 최대 1개월(또는 그 이상) 동안 100% 메탄올에 보존할 수 있습니다.

교잡을 위해 배아를 준비하려면 세척당 점진적으로 더 적은 메탄올로 단계적인 일련의 메탄올 세척으로 재수화해야 합니다. 그런 다음 배아를 프로테아제로 분해하여 리보프로브가 조직으로 확산되는 것을 용이하게 합니다. 표지된 리보프로브를 배아에 첨가하고 혼성화를 수행합니다.

비특이적 혼성화를 제거하기 위해 사후 혼성화 세척이 수행됩니다. RNase A 및 T1을 첨가하여 단일 가닥 RNA를 분해하여 불완전하게 혼성화된 프로브를 제거합니다. 혼성화된 프로브는 hapten-labeled riboprobes와 결합하는 항체-효소 접합체로 검출됩니다. 앞서 언급했듯이 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)와 같은 효소는 합텐 특이적 항체에 접합되며, 효소 기질을 추가하여 색상 변화를 유도하여 검출됩니다. 반응 생성물은 이 예에서 볼 수 있듯이 발현된 mRNA의 위치를 표시하는 짙은 자주색 침전물을 형성합니다.

이제 전체 마운트 현장 교잡을 수행하는 방법을 알았으므로 이 기술의 몇 가지 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

전체 마운트 현장 교잡은 과학자들이 말라리아, 뎅기열, 웨스트 나일병과 같은 치명적인 모기 매개 질병을 해결하는 데 도움이 되는 데 사용되었습니다. 모기의 번식과 발달에 관여하는 유전자를 특성화함으로써, 새로운 생물학적 또는 화학적 살충제는 질병을 옮기는 모기를 더 잘 표적으로 삼도록 설계될 수 있습니다.

이 기술의 또 다른 응용은 기형 유발 물질 또는 태아 발달을 방해하는 물질에 대한 노출과 관련된 유전자 발현 패턴 변화의 특성화를 포함합니다.

여기서, 태아 알코올 증후군의 제브라피시 모델에서 알코올에 노출된 후 발현 패턴이 변하는 유전자를 식별하기 위해 whole-mount in situ hybridization이 사용되었습니다. 이는 자궁 내 알코올 노출의 결과를 완화하기 위한 치료법 개발에 도움이 될 수 있습니다.

whole-mount in situ hybridization은 선천성 질환과 관련된 표현형 변화를 검증하는 데에도 사용할 수 있습니다. 바르데-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome)과 관련된 돌연변이는 합성으로 생산된 돌연변이 mRNA를 통해 제브라피시 배아에 도입되었습니다. 정해진 기간이 지난 후, 배아는 결함의 정도에 따라 그룹으로 나뉘었습니다. 돌연변이된 유전자의 다운스트림에 있는 유전자의 발현을 시각화하는 것은 표현형 변화를 검증하는 데 사용되었습니다. 따라서 표현형 채점(phenotypic scoring)과 함께 whole-mount in situ hybridization은 발달 결함의 기저에 있는 특정 돌연변이의 역할을 더 잘 이해할 수 있도록 촉진할 수 있습니다.

방금 전체 마운트 현장 하이브리드화에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이 기술은 유기체 내 유전자 발현의 정확한 시간적, 공간적 특성화를 가능하게 하는 강력한 도구입니다. Whole-mount in situ hybridization은 현재 다수의 모델 유기체에서 발달 중 유전자 발현 패턴의 atlas를 생성하는 데 사용되고 있습니다. 이러한 연구는 암을 포함한 인간 질병을 치료하기 위한 새로운 치료법의 개발을 촉진할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!