머리 고정 쥐의 수염-신호 Eyeblink 클래식 컨디셔닝

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생쥐의 유전적 발전과 수염 시스템에 대한 이해를 사용하여 학습과 기억을 연구하기 위한 번역 가능한 패러다임인 눈 깜박임 조건화의 신경생물학적 기초를 조사하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조작 마우스에서 칼슘 이미징 및 전기 생리학을 사용하는 동시에 컨디셔닝 중에 특정 수염을 자극함으로써 학습 및 기억의 기계론적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생쥐가 원통형 트레드밀에서 자신의 속도로 걸을 수 있도록 함으로써 스트레스를 최소화하면서 생쥐의 머리를 고정할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 정상적인 노화 및 알츠하이머병과 관련된 것을 포함하여 기억 장애에 대한 잠재적인 치료법으로 확장됩니다. 실린더와 휘스커 자극 시스템의 준비는 각각 텍스트 프로토콜에서 다룹니다. 이 섹션에서는 투구 준비에 대해 설명합니다.

헤드피스 스트립은 더 이상 상업적으로 제조되지 않는 Amphenol 221 시리즈 나일론 스트립을 모델로 한 3D 프린팅 7홀 스트립입니다. 3D 프린팅된 조각에서 스트립의 첫 번째 구멍을 0-80 인치 기계 나사로 탭하고 첫 번째 구멍 뒤에 한 구멍을 비워 둡니다. 그런 다음 바이스를 사용하여 나머지 5 개의 구멍에 5 개의 금도금 핀을 넣습니다.

플라스틱의 더 좁은 구멍을 통해 핀을 밀어 넣습니다. 다음으로, 열 스트리퍼를 사용하여 폴리이미드 코팅을 반 센티미터 벗겨냅니다. 그런 다음 벗겨진 끝을 핀에 구멍이 있는 핀 중 하나에 납땜합니다.

납땜된 와이어를 6mm에서 7mm 사이로 자르고 와이어를 약 2mm 정도 벗겨냅니다. 이제 이 과정을 반복하여 5개의 핀에 총 4개의 와이어를 연결합니다. 처음 두 개의 와이어는 눈꺼풀 EMG 반응을 기록하고 두 번째 두 개는 안와 주위 영역에 전기 자극을 전달합니다.

다섯 번째 핀에 절연되지 않은 5cm 스테인리스강 와이어를 납땜하여 전기 접지 역할을 합니다. 모든 연결을 한 후 멀티미터로 각각을 확인하여 전기적 연속성을 확인하십시오. 발가락 꼬집음으로 확인된 완전히 마취된 동물로 시작합니다.

진통제로 부프레노르핀 염산염을 주사합니다. 그런 다음 각막에 소량의 안과 연고를 바르고 동물의 머리 꼭대기를 면도합니다. 다음으로, 동물의 머리를 입체 안경틀에 고정하고 포비돈 요오드와 알코올을 번갈아 가며 세 번 문질러 두피를 소독합니다.

10번 또는 15번 메스 날로 두피의 정중선을 따라 절개하여 눈 앞쪽에서 두정골을 지나 두정골을 지나 두개골을 노출시킵니다. 6개의 마이크로클립으로 피부의 플랩을 집어넣어 옆구리와 등을 포함한 두개골을 최대한 많이 노출시킵니다. 다음으로, 메스를 사용하여 두개골에서 골막을 긁어냅니다.

그런 다음 3% 과산화수소로 두개골 상단을 세 번 청소합니다. 두개골이 마르면 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 34 크기의 역 원뿔 버로 두 개의 구멍을 뚫습니다. 브레그마 앞에 한 구멍을 놓고 오른쪽 눈을 컨디셔닝할 때 다른 구멍을 람다 앞, 정중선 왼쪽에 배치하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

이 구멍은 나사에 맞도록 조심스럽게 뚫어야 하며, 뇌를 손상시키지 않도록 많은 노력을 기울여야 합니다. 구멍에 전기 연결용 나사를 끼웁니다. 완전히 돌릴 때마다 나사가 0.28mm 낮아지므로 두 번 완전히 돌리면 충분합니다.

다음으로, 시멘트의 표면적을 늘리기 위해 두개골에 여러 개의 작은 divits를 만듭니다. 완성된 헤드피스에서 접지선을 두 개의 나사 주위에 8자 모양으로 감습니다. 헤드피스가 올바르게 배치될 수 있도록 접지선을 약간 느슨하게 두십시오.

이제 차가운 luting 시멘트를 바르십시오. 두개골과 나사를 넉넉하게 코팅하고 시멘트를 건조시킵니다. 시멘트가 마르면 핀이 두개골 위에 서도록 헤드피스를 수직으로 놓습니다.

프레임에서 팔에 부착된 홀더로 헤드피스를 고정합니다. 홀더에는 헤드피스의 핀을 수용할 수 있는 5개의 금도금 소켓이 있어야 합니다. 안와 위의 muscularis orbicularis oculi에 두 개의 EMG 와이어를 배치합니다.

그런 다음 두 개의 자극 와이어를 배치합니다. 벗겨진 끝을 눈 바로 꼬리 방향으로 2-4mm 피부 아래에 놓습니다. 그들의 끝이 서로 닿지 않도록하십시오.

철사가 너무 길어서 동물의 눈을 긁을 수 있다면 철사를 자르거나 뒤로 구부리십시오. 일부 노출된 전선은 노출된 상태로 유지되어야 합니다. 이제 철사의 바닥을 두개골에 조금 더 luting 시멘트로 시멘트를 바르고 건조시킵니다.

이전에 사용한 볼륨의 약 절반을 사용합니다. 계속하려면 마이크로클립을 제거하고 스킨의 위치를 변경합니다. 피부가 자연스럽게 안정되도록 하여 눈꺼풀이 뒤틀리고 깜박임을 방해하여 실험을 망칠 수 있는 피부의 긴장을 방지합니다.

피부가 안정되면 헤드피스 홀더를 제거하고 노출된 부분을 치과용 시멘트로 밀봉합니다. 시멘트가 눈이나 투구의 핀에 떨어지지 않도록 하십시오. 그런 다음 치과용 시멘트 솔벤트를 적신 면봉을 사용하여 필요에 따라 부분적으로 경화된 시멘트를 매끄럽게 조작합니다.

시멘트가 완전히 건조되면 입체 프레임에서 동물을 제거하고 따뜻한 표면에서 회복한 후 집 케이지로 되돌려 놓습니다. 쥐가 최소 5일의 회복 시간을 가진 후에 습관화를 시작하십시오. 마우스를 고정하려면 꼬리로 마우스를 잠시 제지하여 어깨 뒤로 꼬집습니다.

그런 다음 복부와 몸통 아래에서 마우스를 들어 올립니다. 그런 다음 헤드피스에 커넥터를 부착하고 잠금 나사를 돌립니다. 그런 다음 마우스를 실린더에 부드럽게 놓고 두 개의 나사를 사용하여 커넥터를 실린더 위의 막대에 고정하면서 마우스를 가만히 유지합니다.

그런 다음 마우스를 놓습니다. 처음 두 세션에서는 마우스가 컨디셔닝 세션과 동일한 시간 동안 실린더에 익숙해지도록 합니다. 습관화되는 동안 자발적인 깜박임 속도를 기록합니다.

또한 전기 자극을 가하지 않고 쥐를 휘스커 진동 자극기에 미리 노출시킵니다. 피에조 시스템이 조절된 쪽에 가깝게 하여 빗의 이빨을 개별 수염 위로 밀어 넣습니다. 모든 세션에 대해 동일한 수염을 선택합니다.

그런 다음 텍스트에 제시된 대로 고전적인 조건화 훈련을 진행하십시오. 8주에서 10주 된 수컷 C57 Black 6J 마우스는 헤드고정 원통형 트레드밀에서 추적 눈 깜박임 컨디셔닝으로 훈련되었습니다. 각 시험의 EMG 녹음을 취했습니다.

근전도를 수정하고 10밀리초 시간 상수로 통합한 다음 모든 시험에서 평균을 구했습니다. 10회의 훈련 세션에 걸쳐 조건화된 repsonses의 진화는 점차 반응의 진폭이 커지고 응답 대기 시간이 짧아지는 것을 보여줍니다. 이러한 진화는 자극이 무작위 순서로 제시되는 psuedoconditioned 마우스의 반응에서는 볼 수 없습니다.

시기적절하고 따라서 잘 학습된 조건화된 반응의 진화는 CS 발병 후 반응의 최고점까지의 시간 히스토그램에서도 볼 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 헤드피스를 준비하고, 헤드피스를 외과적으로 마우스에 이식하고, 헤드고정 눈 깜박임 컨디셔닝을 위해 원통형 트레드밀에 마우스를 올려놓는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 당신의 쥐는 컨디셔닝을 습득하면서 며칠에 걸쳐 좋은 학습 곡선을 보여야 합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동물의 고통을 관찰하는 데 주의를 기울이는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 동물에 대한 스트레스를 최소화하기 위해 적절한 조치를 취해야 합니다.