2.9: 유도 다능성

인간 배아 줄기 세포와 같은 유도 만능 줄기 세포는 신체의 거의 모든 세포로 분화할 수 있으므로 재생 의학 분야에서 큰 가능성을 가지고 있습니다.

인간 배아 줄기 세포(hESCs)는 착상 전 배아에서 얻고, 완전히 분화된 체세포는 iPSC라고도 하는 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 데 사용됩니다.

이 비디오에서는 iPSC 생성의 기본 원리, 분화된 세포에서 다능성을 유도하기 위한 단계별 프로토콜, 이 프로토콜의 많은 다운스트림 응용 프로그램 및 수정 사항에 대해 알아봅니다.

먼저 체세포 유형에서 iPSC를 생성하는 원리에 대해 논의해 보겠습니다.

피부 세포나 뉴런과 같은 분화된 세포는 운명을 결정하는 세포입니다. 그들은 특정 기능을 수행하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 반면에 만능 줄기 세포는 운명이 결정되지 않은 세포로 모든 종류의 세포로 분화 할 수 있습니다.

이미 분화된 세포의 정체성을 만능 상태로 바꾸는 과정을 세포 재프로그래밍(cellular reprogramming)이라고 합니다. 여기에는 세포 내 유전자 발현 패턴을 변경하는 것이 포함되는데, 세포가 생산하는 단백질의 수와 유형이 세포의 정체성을 정의하는 데 중요한 역할을 하기 때문입니다.

세포 재프로그래밍을 유도하는 방법 중 하나는 특정 전사 인자의 발현을 유도하는 것입니다. 전사 인자(transcription factor)는 유전자 내의 조절 서열에 결합하는 단백질입니다. 이러한 염기서열 중 일부는 "프로모터(promoters)"라고 불리며, 따라서 유전자의 전사를 촉진합니다. 몇 가지 전사 인자는 수많은 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 세포 정체성에 큰 영향을 미칩니다.

다능성을 유도하는 것으로 입증된 4가지 고전적인 전사 인자는 Oct4, Sox2, cMyc 및 Klf4입니다. 이러한 요인은 재프로그래밍 효과를 발견한 연구자의 이름을 따서 야마나카 요인(Yamanaka Factor)이라고도 합니다.

이러한 전사 인자의 발현을 유도하기 위해 여러 방법을 사용할 수 있습니다. 가장 일반적이고 효율적인 방법은 변형된 바이러스를 사용하여 전사 인자 유전자를 핵으로 전달하여 게놈에 통합하는 것입니다.

이 방법에서는 4개의 Yamanaka 인자를 암호화하는 유전자를 서로 다른 레트로바이러스에 개별적으로 패키징하여 분화된 세포에 첨가합니다. 세포가 변형된 바이러스에 노출되면 분화된 세포 중 작은 부분이 4가지 전사 인자 운반 바이러스에 모두 감염됩니다. 그들은 만능 줄기 세포의 큰 구형 클러스터가 형성될 때까지 역분화되기 시작합니다. 클러스터 형성은 iPSC가 in vivo 줄기 세포와 유사한 미세환경을 만드는 데 도움이 되므로 다능성을 유지하는 데 도움이 됩니다.

이제 iPSC 생성의 기본 원리를 이해했으므로 바이러스 형질도입 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 다능성을 유도하기 위한 일반적인 프로토콜을 살펴보겠습니다.

이 절차를 시작하기 전에 바이러스가 신체의 세포를 감염시킬 수 있으므로 안전 지침을 따르는 것이 매우 중요합니다.

transfection 프로세스를 시작하기 위해 고밀도의 MEF를 함유하는 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 세포를 완충 용액으로 세척합니다. 다음으로, 트립신과 같은 단백질 분해 효소가 들어 있는 용액을 첨가하여 접시 바닥에서 세포를 들어 올립니다. 그런 다음 배양 배지를 플레이트에 추가하고 분리된 세포를 원심분리 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후, 펠릿은 배양 배지에 다시 현탁됩니다. 다음으로, 세포를 계수하고 농도를 조정하여 다음날 최적의 세포 수가 바이러스에 감염될 수 있도록 합니다. 세포를 밤새 배양합니다.

세포가 새 접시에 정착한 후 오래된 배지를 새 배지로 교체하고 원하는 전사 인자를 포함하는 조작된 바이러스를 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 세포는 감염이 일어날 수 있도록 충분한 시간 동안 바이러스와 함께 배양됩니다. 배양 후, 유리 바이러스를 함유한 배지를 제거하고 새로운 배아 줄기세포 배지로 교체합니다.

형질전환 후 2-3주 동안 세포는 37에서 성장해야 합니까? 인큐베이터에서 배양 배지는 매일 교체해야 합니다.

이 기간이 지나면 배아 줄기세포 집락과 유사하게 보이는 iPSC 집락이 채취될 수 있을 만큼 커져야 합니다. 군체는 적절한 성장 인자를 가진 배지를 함유한 새로운 플레이트로 옮겨질 수 있으며 더 성장할 수 있습니다. 다능성을 확인하기 위해, 세포 집단의 일부를 다능성 마커로 염색합니다.

지금까지 분화된 세포에서 iPSC를 생성하는 방법을 살펴보았으니, 이제 매우 유용한 이 방법의 몇 가지 다운스트림 응용 분야와 수정 사항을 살펴보겠습니다.

iPSC의 중요한 특징은 신체의 거의 모든 세포를 생성하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 예는 iPSC에서 심근세포(cardiomyocyte)라고 하는 심장 근육 세포의 생성을 보여줍니다. 이를 위해 iPSC는 비부착성 플레이트(non-adherent plate)로 전달되어 만능 줄기 세포의 응집체인 배아체(embryoid body)를 형성할 수 있습니다. 배아체는 혈청과 아스코르브산을 함유한 특수 배지에서 배양되어 심장 분화를 향상시킵니다. 성공적인 분화는 일부 세포가 박동하기 시작할 때 쉽게 관찰할 수 있습니다.

iPSC는 잠재적으로 모든 세포 유형으로 분화할 수 있기 때문에 쥐와 같은 전체 유기체를 형성할 수도 있습니다. 이것은 사배체 보체(tetraploid complementation)라고 하는 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다. 첫째, 4개의 염색체를 포함하는 배아인 사배체 배아(tetraploid embryo)는 전기장을 사용하여 초기 배아의 두 세포를 융합하여 형성됩니다. 사배체 배아는 배반포 단계까지 발달할 수 있습니다. 그런 다음 iPSC를 배반포에 주입한 다음 수혜자 암컷에게 이식하여 임신시킵니다. 사배체 세포는 태반과 같은 배아 외 구조만 형성할 수 있으므로 이 방법으로 생성된 동물은 전적으로 iPSC에서 파생됩니다.

일부 연구자들은 성공적으로 재프로그래밍된 세포를 식별하는 과정을 보다 효율적으로 만들기 위해 재프로그래밍 절차를 수정합니다. 예를 들어, 이 실험에서 Oct4 프로모터의 영향으로 녹색 형광 단백질을 발현할 수 있는 MEF는 연구자들이 다능성을 획득한 세포를 쉽게 식별하는 데 도움이 되었습니다.

유도 만능 줄기 세포 생성에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청하셨습니다. 이 동영상에서는 이 절차의 원리와 분화된 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 단계별 프로토콜을 검토했습니다. 또한 이 방법을 실험실 내 실험에 적용하거나 수정할 수 있는 방법을 검토했습니다.

iPSC의 발견은 퇴행성 질환을 치료하는 데 사용할 수 있는 치료법을 개발할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있기 때문에 줄기세포 생물학 분야에 큰 영향을 미쳤습니다. iPSC에 대한 많은 진전이 이루어졌지만, 여전히 넘어야 할 장애물은 암의 위험입니다. 현재의 재프로그래밍 절차는 암을 유발할 수 있는 조절되지 않은 세포 성장을 초래할 가능성이 있습니다. 따라서 iPSC를 실제로 임상적으로 사용하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!