다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

이 절차의 전반적인 목표는 메즈칼 채널을 액적 계면, 이중층 시스템으로 기능적으로 재구성하고 고조파 기계적 자극에 대한 이러한 메카노 민감 채널의 반응을 조사하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 층 시스템에 의해 액적 계면으로 재구성 된 후 고조파 기계적 여기에 반응하여 V 23 T 메스칼 돌연변이의 메카노 전기 활성을 연구 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 패치 클램프 기술과 레이어 방법에 의한 액적 계면의 기술적 이점을 소형화할 수 있을 뿐만 아니라 멤브레인 각 측면의 화학 조성을 제어할 수 있는 기능을 활용

리포좀을 제형화하려면 동결건조 분말로 구입한 D-P-H-P-C 합성 지질 20mg에 10ml의 염화칼륨 완충액을 첨가하여 10mL의 2mg 지질 용액을 준비합니다. 지질 운반체와 완충 용액이 모두 완전히 혼합되었는지 확인하십시오. 혼합물은 모든 것이 용해될 때 균질하고 흐릿하게 보여야 합니다.

혼합물을 섭씨 영하 20도에서 동결하면 이제 새로운 지질 혼합물이 완전히 해동되어 혼합물이 가열된 환경이 아닌 실온에서 해동됩니다. 총 6번의 동결 해동 주기 후, 시판되는 압출기를 사용하여 먼저 0.4미크론 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 통해 전체 지질 현탁액을 강제로 주입한 다음 0.1미크론 멤브레인 필터를 통해 6회 밀어 지질을 압출합니다. 이 과정을 통해 직경이 100나노미터에 가까운 입자가 생성됩니다.

오일 저장소를 제조하려면 직경 2인치, 길이 1.5cm의 아크릴 실린더 벽을 통해 두 개의 반대 구멍을 뚫습니다. 구멍은 직경이 1mm, 바닥에서 1cm여야 합니다. 그런 다음 이전에 뚫은 1mm 구멍과 동심원으로 두 개의 4mm 구멍을 뚫습니다.

구멍의 깊이는 각각 1mm여야 합니다. 끝까지 뚫지 않도록 주의하십시오. 이 구멍은 고무 개스킷에 맞도록 만들어졌습니다.

기름이 새는 것을 방지하기 위해 더 큰 구멍에 내경이 1mm인 두 개의 고무 개스킷을 놓고 붙입니다. 그런 다음 실험 당일 다목적 에폭시를 사용하여 10cm x 10cm 두께의 아크릴 시트에 기계를 원통형으로 붙이고 2 250 미크론 직경의 은선을 7cm 길이로 자른 다음 팁을 표백제에 2 시간 동안 담그십시오. 염화은 코팅을 형성하기 위해 회색은 염화은 코팅이 형성되었음을 나타냅니다.

유리 절단기를 사용하여 10cm 길이의 외경 1mm와 내경 58mm의 포인트 인 규산염 유리 모세관을 두 개의 5cm 모세관으로 분할합니다. 18게이지 뭉툭한 팁 바늘이 있는 1ml 주사기를 사용하여 수화된 하이드로겔이 모세혈관 밖으로 팽창하는 것을 방지하기 위해 모세혈관을 P-E-G-D-M-A 하이드로겔로 채웁니다. 끝 부분에 3mm의 간격을 유지하고 모세혈관에 기포가 없는지 확인합니다.

은, 염화은 전극을 하이드로겔로 채워진 모세관에 삽입합니다. 유리기 광중합을 통해 P-E-G-D-M-A 하이드로겔을 경화 자외선 반점을 사용하여 1와트에서 2분 동안 자외선에 노출된 후 실험은 패치 증폭기의 접지 연결에 접지된 패러데이 케이지 아래에 설정됩니다. 마이크로 피펫 중 하나를 수 커넥터가 있는 직선 마이크로 전극 홀더에 부착합니다.

그런 다음 마이크로 전극 홀더를 헤드 스테이지에 연결합니다.tag패치 앰프의 le. 헤드 스테이지를 접지에 연결하려면 18 게이지 절연 구리선을 헤드 스테이지에 적합한 커넥터에 납땜하고 헤드 스테이지를 3축 수동 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 적절한 나사를 사용하여 실험실에서 만든 커넥터를 통해 두 번째 마이크로 피펫을 선형 액추에이터에 부착한 다음 두 번째 마이크로 매니퓰레이터에 둘 다 장착합니다.

마이크로 피펫은 서로 마주 보고 정렬되고 수평으로 수평을 이루어야 합니다. 다음으로, 유리 바이알에서 0.1ml의 D-P-H-P-C 리포좀과 0.01ml의 V 23 T 메스칼 프로테아 리포좀 용액을 혼합합니다. 34 게이지 마이크로필 바늘을 사용하여 두 마이크로 피펫의 팁을 프로테오솜 용액으로 채웁니다.

저장소를 정립 현미경 위에 놓고 반대쪽 1mm 구멍을 통해 마이크로 피펫을 공급합니다. 그런 다음 용기를 표면의 헥사 데칸으로 채워 마이크로 피펫 끝에 구형 방울을 형성합니다. 세 번째 미크론 매니퓰레이터에 장착된 세 번째 10 미크론 직경의 규산염 보 유리 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 피펫의 팁에 희석된 V 23 T 메스칼 프로테아 리포좀 용액을 분배하고 액적을 형성합니다.

원하는 대로 부피를 줄이거나 늘려 액적의 크기를 조절하고 단층이 완전히 형성될 때까지 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 물방울을 층별로 접촉시킵니다. 형성은 1-2분 이내에 발생합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 소프트웨어 및 장비를 설정한 후 BNC 케이블을 사용하여 파형 발생기의 출력을 외부 명령 입력 전면 스위치에 연결합니다. 10Hz, 500밀리볼트 피크 토프 삼각형 파형을 헤드 스테이지로 보냅니다. 마이크로미터 매니퓰레이터 사용.

유리 마이크로 피펫을 수평으로 움직여 물방울이 약간 닿을 때까지 접촉시키고 이중층 얇아짐이 발생할 때까지 기다립니다. 이중층 형성 과정의 진행 상황은 현미경을 통해 시각적으로 볼 수 있으며 전류 측정으로 모니터링할 수 있습니다. 매니퓰레이터를 이용하여 액츄에이터에 장착된 액적의 위치를 제어하여 이중층 크기를 직경 약 250미크론으로 조정하면 현미경을 통해 이중층 크기를 시각적으로 추정할 수 있습니다.

이중층이 형성되고 안정되면 이중층에 통합된 메스칼 단백질을 자극하기 위해 함수 발생기를 사용하여 정현파 신호를 보내 액적을 자극합니다. 175미크론 피크 대 피크 진폭, 0.2헤르츠 주파수 및 50% 듀티 사이클을 가진 정현파 형태를 Pieto 전기 서버 컨트롤러로 보냅니다. 비정형 실시간 전류 기록이 여기에 표시됩니다.

이중층의 측정된 커패시턴스가 갑자기 증가하여 안정적인 상태에 도달하기 전에 이중층이 얇아지고 형성됨을 나타냅니다. 이중층은 DIB가 기계적으로 자극될 때 액적 위치를 변경하면서 멤브레인 전체에 일정한 DC 전위를 유지하여 제어할 수 있습니다. 메즈칼의 V 23 T 돌연변이는 주로 아전도성 상태와 때때로 완전 개방 이벤트를 포함하여 신뢰할 수 있는 활성을 생성합니다.

게이팅은 주로 피크 압축에서 발생하며, 이는 극좌표 플롯에서 볼 수 있듯이 이중층 장력의 증가와 관련이 있음을 나타냅니다. 여기서, 생체 분자의 다른 유형을 시험하기 위하여 이용되는 이 기술의 기능은 여기에서 강조됩니다. 전압 개폐 이온 채널인 Ethin은 DC 막관통 전위 One master의 적용 시 멤브레인 투과성을 증가시킵니다.

이 기술은 제대로 수행되면 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실수로 유리 모세관을 깨뜨리거나 다른 방법을 사용하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 설정을 다시 시작하고 개발 후 모든 전선이 연결되어 있는지 확인해야 합니다.

이 기술은 스트레치 활성화 채널 분야의 연구자들이 DIB 내장 메커니즘에 민감한 채널의 게이트로 외부 힘을 전달할 수 있는 새로운 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 층별로 액적 계면을 형성하고, 인공 멤브레인에 기계에 민감한 채널을 통합하고, 이러한 채널을 기계적으로 자극하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.