을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) Pathosystem

이 절차의 전반적인 목표는 최적화된 주사기 침투 분석을 통해 애기장대 딜리아나 면역 반응을 정량적으로 특성화하는 것입니다. 이것은 먼저 주사기 침투를 사용하여 사다(sada)라고 하는 자연 구멍을 통해 잎으로 박테리아를 수동으로 전달함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 질병 증상이 나타난 후 감염된 잎 조직의 디스크를 채취하는 것입니다.

다음으로, 박테리아는 높은 처리량의 균질화를 통해 잎 디스크에서 추출됩니다. 마지막 단계는 연속 희석하고 박테리아 계수판에 스포팅하여 군체를 계수하는 것입니다. 궁극적으로 각 잎 디스 내의 박테리아 성장은 식물 면역 반응의 상대적 강도와 상관관계가 있을 수 있습니다.

이 방법은 생물 스트레스에 대한 방어 반응에 기여하는 유전자를 식별하는 것과 같은 식물 면역 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 감염된 식물 조직에서 병원체 성장을 정밀하게 정량화할 수 있고 다양한 발달 상태를 가진 잎 샘플링으로 인한 실험 오류를 방지하는 데 도움이 된다는 것입니다. 이 방법은 악성 박테리아 병원체 감염에 대한 식물 면역 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 살리실산 또는 면역 반응을 유발하는 미생물 관련 분자 패턴과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 조직 손상 없이 박테리아를 잎으로 전달하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 다음 절차를 시연하는 것은 박사 후 연구원 힌두교와 대학원생 shalu와 yali입니다. 곧 제 실험실에서 질병 감수성 향상에 대한 분석이 이 비디오에서 시연될 것입니다.

실험에 앞서, King's B 또는 KB 매체 플레이트를 준비하고, 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 1리터의 KB 고체 매체를 만든 다음, 자기 교반 플레이트에서 냉각시킵니다. 매체가 80% 글리세롤로 냉각되면 1몰, 황산마그네슘 및 스트렙토마이신을 매체에 붓고 두 가지 크기의 KB 매체 플레이트를 붓습니다. 더 작은 페트리 접시는 1차 박테리아 배양 플레이트 역할을 하고 더 큰 애완 동물 페트리 접시는 박테리아 계수 플레이트 역할을 합니다.

분석 2일 전에 플레이트를 섭씨 4도에서 보관하십시오. PSM ES 43 26. 섭씨 80도 음의 글리세롤에서 추출한 박테리아는 KB 연쇄상구균 배양 플레이트에 저장되고 다음 날 24-48시간 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.

스트렙토마이신(streptomycin) 1밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 4밀리리터의 액체 kb 배지가 있는 멸균 시험관에서 액체 배양을 시작합니다. 밤새 섭씨 28도에서 250rpm을 흔듭니다. 실험을 위한 애기장대 식물은 액체 박테리아 배양이 시작되는 당일에 프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 조건에서 재배됩니다.

5번과 6번 잎의 꽃잎에 뭉툭한 방수 마커를 표시하여 샘플링 시 감염된 조직을 쉽게 식별할 수 있습니다. STA의 개방을 향상시키고 병원체 용액이 잎 물에 쉽게 들어갈 수 있도록 합니다. 바닥에서 평평함을 20 분 동안 담그면 식물이 잘 자랍니다.

20분 후 여분의 물을 배출하십시오. 애기장대 식물의 감염이 수행됩니다. 액체 배양을 시작한 다음 날.

박테리아 배양액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 9, 600Gs에서 2분 동안 회전합니다. 실온에서 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 1밀리리터의 멸균 10밀리몰 염화마그네슘으로 재현탁시키고 50밀리리터 원심분리기 튜브에 10밀리몰 염화마그네슘 9밀리리터로 박테리아 현탁액을 희석합니다. 박테리아의 광학 밀도를 측정한 후 박테리아를 10밀리몰의 염화마그네슘으로 희석하여 0.0002의 최종 OD 600으로 만듭니다.

EDS 감염 분석용. 일반적으로 인슐린 주사기로 알려진 1밀리리터의 뭉툭한 끝 바늘 없는 주사기가 침투에 사용됩니다. 침투 과정에서 훨씬 더 나은 제어를 위해 0.5-0.6 밀리리터의 희석 된 박테리아 용액을 주사기에 채우고 주사기를 최대 용량으로 채우지 마십시오.

집게 손가락 위에 잎의 아래쪽 표면을 노출 한 다음 엄지 손가락을 사용하여 잎 위치를 부드럽게 조정하십시오. 주사기를 잎 표면에 수직으로 배치하여 압력이 고르게 분포되도록 하여 잎 손상을 줄입니다. 침투하는 동안 갈비뼈 중간부분을 피하십시오.

플런저를 천천히 밀어 박테리아 용액에 침투시킵니다. 잎 중간엽으로의 액체 진입은 더 어두운 잎 색상으로 표시된 대로 시각화되며, 여러 번 시도해야 하는 경우에도 잎의 전체 표면에 침투합니다. 침투가 완료되면 흡수성 조직으로 잎을 부드럽게 닦아서 여분의 병원균 용액을 제거합니다.

감염된 잎 조직에 손상이 있는지 육안으로 검사합니다. 침투 된 식물을 1-2 시간 동안 건조시키고 식물을 원래 성장 상태로 되돌립니다. 투명한 돔에 물을 뿌리고 감염된 식물을 2시간 동안 덮습니다.

그런 다음 돔을 깨서 2-3인치의 구멍을 만들고 보통 3일인 나머지 감염 실험 기간 동안 그대로 두십시오. 병원체 성장을 정량화하기 하루 전. 150mm x 15mm KB 미디어 플레이트를 사전 건조합니다.

접시를 실온에서 약 24시간 동안 보관하여 건조시킵니다. 감염되기 쉬운 유전자형에서 감염된 조직의 황변으로 나타나는 경화증이 출현한 후 감염된 조직을 처리하지만 괴사성 병변이 발생하기 전에 처리합니다. 각 유전자형에 대해 6개의 연삭 튜브를 준비합니다.

하나의 스테인리스 스틸 분쇄 볼을 놓고 각 튜브에 500마이크로리터의 멸균 10밀리몰 염화마그네슘을 추가합니다. 다음으로, 식물에서 감염된 잎을 분리하고 집게를 무작위로 사용하여 한 구멍 종이 펀치로 잎 디스크를 펀칭하고 두 개의 다른 식물에서 두 개의 잎 디스크를 각 분쇄 튜브에 넣습니다. 튜브를 밀봉하고 10분 동안 최대 속도로 고처리량 균질화기로 조직을 균질화합니다.

조직이 잘 균질화되고 기다리는 동안 감염된 잎에서 엽록소 방출로 인해 용액이 녹색으로 바뀔 때까지 필요한 경우 이 과정을 반복합니다. 균질화를 위해 96웰 배양 플레이트의 처음 6개 행에 있는 각 웰을 180마이크로리터의 10밀리몰 염화마그네슘으로 채웁니다. 20마이크로리터의 분쇄 조직 현탁액을 96웰 플레이트의 첫 번째 행의 각 웰로 옮기고 액체를 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 혼합합니다.

작은 조직 조각이 팁을 막은 경우 2-3mm 잘라서 플레이트 상단의 물방울이 다른 유전자형의 조직을 대체 줄에 놓을 수 있는 충분한 공간을 제공하기 위해 올바른 부피의 용액을 얻는 데 도움이 됩니다. 10배 연속 희석을 준비하려면 20마이크로리터의 조직 현탁액을 두 번째 줄로 옮기고 여섯 번째 희석까지 이 절차를 반복합니다. 분할된 피펫 팁을 사용하여 96 벽면 플레이트에서 20마이크로리터의 용액을 150mm x 15mm KB 플레이트로 옮깁니다.

가장 희석된 현탁액에서 가장 농축된 현탁액까지 작업하므로 희석 사이에 피펫 팁을 변경할 필요가 없습니다. 뚜껑을 깨뜨린 상태에서 접시를 실온에서 말리십시오. 플레이트 표면에서 더 이상 액체가 관찰되지 않으면 뚜껑 반전을 닫고 플레이트를 실온에서 배양합니다.

군체가 보일 때까지 40-60시간 동안 플레이트를 배양합니다. 플레이트의 박테리아가 예측 가능한 10배를 반영하는지 확인합니다. 식민지 형성 단위를 드롭합니다.

박테리아가 과도하게 자라서 군체가 융합하기 전에 박테리아를 세십시오. 가장 낮은 희석액에서 겹치는 콜로니가 없는 박테리아의 수를 측정합니다. 일반적으로 계수되는 선호되는 희석액에는 10개에서 50개 사이의 콜로니가 포함되며, 이는 기술적 복제물에 따라 다를 수 있습니다.

박테리아 증식 수준을 계산하려면 이 공식을 사용하여 잎 디스크당 군집 형성 단위의 수를 결정하십시오. 여기서 R은 행의 수이고 T는 각 기술적 복제물 내의 박테리아 수입니다. 그런 다음 데이터를 사용하여 그래프를 생성합니다. 각 데이터 포인트는 로그 스케일에서 6개의 기술 반복실험의 평균으로 표시됩니다.

에어로바는 평균 강화 질환의 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. P-S-M-E-S 43 26에 대한 감수성은 OD 600이 0.0002인 접종에 의한 감염으로 평가되었다. 그 결과, 민감성이 높은 NPR one dash one 돌연변이체는 야생형 Columbia zero plants에 비해 약 2.5 log 또는 300배 더 많은 병원체 성장을 가지고 있음을 보여줍니다.

주사기 침투 분석은 다양한 층의 면역 반응을 평가하도록 수정할 수 있습니다. 살리실산이 유발한 면역을 평가하기 위해 살리실산나트륨의 외부 적용을 사용하여 면역 반응을 유발하며, 이는 병원체 성장에 의해 정량화됩니다. 살리실산 수용체와 살리실산 의존성 표적 유전자의 주요 전사 공동 조절로 기능하는 NPR R one의 손실은 살리실산 유도체의 외인성 적용에 대한 무감각으로 이어집니다.

미생물 관련 분자 패턴이 유발된 면역을 특성화하기 위해 식물은 두 가지 알려진 유발 요인으로 전처리되었습니다. FLAG 22 및 L 18, FLAG 22 처리된 야생형 Columbia zero 식물은 박테리아 개체군의 1log 또는 10배 감소를 지원한 반면 FLS 2개의 돌연변이 식물은 박테리아 성장 제한 효과를 유발하지 못했습니다. 유사하게, EFR 돌연변이 식물은 L 18 전처리에 둔감했습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 주사기 침투 분석을 통해 아랍 옵시스 면역 반응을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 질병 진행을 모니터링하고 코르시스가 출현한 후 조직을 샘플링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 슈도모나 파테르 쿨 콜라 S phos 3, 2, 6은 반위축성 병원체입니다.

따라서 신경 영양 단계로 전환하기 전에 샘플링을 수행해야 합니다. 이 절차에 따라 정량적 실시간 PCR 및 서양 혈액 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 특정 면역 신호 경로가 방해를 받는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 살아있는 박테리아와 함께 일하고 있다는 것을 잊지 마십시오.

슈도모나 센게는 인간에게 병원성이 없지만 이 절차를 수행하는 동안 오염된 소모품과 감염된 식물을 적절하게 처리하는 것을 잊지 마십시오.