Name: 을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) Pathosystem (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 배우세요 애기장대 면역 반응을 정량화하는 최적화된 주사기 침투 분석법을 통해 식물 병원성 박테리아 Pseudomonas syringae의 성장을 측정하는 방법을. 이 기법은 식물 면역학 연구에 필수적입니다.

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원고를 비평해 주신 Shahid Mukhtar 박사님과 샘플 데이터 분석 파일을 제공해 주신 Xinnian Dong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 KPM과 UAB 생물학과에 NSF-CAREER 상(IOS-1350244)을 수여했습니다.

다음 텍스트는 애기 장대에서 PSM ES4326 주사기 침투 분석을 최적화 수행하기 위해 단계적으로 프로토콜을 설명합니다. 이 분석 주요 절차는 단순화 된 플로우 차트 (그림 1)에 표시됩니다. 1. 식물 성장 조건 <ol><li> 소우 씨 <ol><li> 느슨하게 바닥 O에서 그들을 담가 토양과 물을 냄비 가득 2 냄비 (직경 4, 높이 3.75)를 준비 / N 여분의 물을 배수하기 전에. </li><li> 시트 나 다른 종이 무게 접힌 70mm 각 냄비, 50 ~ 100 애기 씨, 야생 형 골-0 또는 npr1-1 돌연변이를 뿌리고. </li><li> 80-90% (그림 2A)에 상대 습도를 높이기 위해 물을 뿌려 투명 돔이있는 냄비를 커버. </li></ol></li><li> 전체 계층화 및 동기 발아 수 있도록 72 시간 동안 4 ° C에서 냄비를 품어. </li><li> 표준 성장 조건에 냄비로 이동 (12 시간 빛/ 12 시간 어두운, 21 ° C, 빛의 세기 100 μmol / 평방 미터 / 초, 상대 습도 40 %)은 씨앗이 발아 할 수 있도록합니다. 물 응축을 방지하는 데 도움이됩니다 성장 방에 전송 직후 구멍에 2-3 생성 돔 균열. </li><li> 최초의 진정한 잎은 길이 2~3mm의 크기에 도달하면, 평면 흙으로 채워진 72 우물에 냄비에서 모종을 이식. <ol><li> 평면에서 토양 표면의 중앙에 1 깊은 함몰 만들 손가락 또는 1 ml의 피펫 팁을 사용한다. </li><li> 부드럽게 가능한 한 적은 루트 손상 개별 모종을 분리합니다. 조심스럽게 집게로 그대로 뿌리를두고 모종을 선택합니다. </li><li> 우울증에 이식 충격을 최소화하고 부드럽게 우울증을 채우기 위해 주변의 흙을 가볍게하기 위해 부착 된 흙 덩어리와 함께 하나의 분리 된 종묘를 놓습니다. 생물 학적 폐기물 용기에 여분의 모종과 토양을 취소하고 따라 폐기 할 것지역 생물 학적 폐기물 처리 지침. </li><li> 물은 상부로부터 모종을 옮기고 완전히 80~90% 습도를 유지하기 위해 물이 뿌려 투명한 돔 평평한 커버. 다음 4 일의 아침에 돔 균열 완전히 그 날의 말을 제거, 3 일간 돔에 보관하십시오. 주 : 파종 종자 대안 평면 토양 가득 72 웰 상 유리 피펫 2-3 종자를 전송 한 다음 4 ℃에서 48 시간 동안 1 ㎖의 0.1 % 한천을 함유하는 1.5 mL의 원심 분리 튜브에 층화 종자에 의해 수행 될 수있다. 플랫은 발아 후 1 주일 제거 될 수 투명 돔 커버 될 필요가있다. 여분 모종 잘 당 하나의 모종을 남길 수있다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 1 물에 아파트를 적시에 의한 워터 식물 매 2 일 후 여분의 물을 배수. 주 : 식물에 물을위한 시간 간격이 성장 실내 습도에 따라 결정하고, 결정된 염기 있어야사용자의 식물 성장 시설의 지속적인 관찰에 D. 그들이 잘 물결 무늬가 있는지 확인하기 위해 매일 식물을 확인합니다. 단지 몇 명소, 물 물총 병 상단에서 그 식물을 건조하는 경우. </li><li> 또는 성장 조건 (광주, 온도)에 따라 3-5 주 이전에 해당 발달 단계 # 3.50 (장미의 크기가 50 % 최종 크기), 근처에 식물 병원균 감염 분석 (단계 3-5)을 수행합니다. 꽃이 핌 출현 (스테이지 # 5)으로 인해 나이와 관련된 저항 (38, 39)의 발병 후 식물을 감염시키지 마십시오. </li></ol> 문화 미디어 및 플레이트 2. 준비 <ol><li> 왕의 B (KB) 액체 배지 1 L합니다. 부드럽게 1,000 ml의 가시적 펠릿 없다 2 O까지 탈 H와 자기 교반 막대를 사용하여 최대 20 g proteose 펩톤 2g 및 인산 칼륨 수화물을 교반한다. 20 분주기에 액 150 ㎖ 유리 병에 나누어지는 100 ㎖ 오토 클레이브. </li><li> 준비KB 고체 배지와 배양 플레이트. <ol><li> 부드럽게 20g Proteose 펩톤, 2g 칼륨 인산염 이염 수화물 1,000 mL를 15g의 한천이 탈 H 2 O를 저어 오토 클레이브. </li><li> 그것은 미래의 응축을 최소화하고 항생제의 저하를 방지하기 위해 터치 멋진 때까지 자기 볶음 접시에 매체를 냉각. 매체에 1 M 황산 멸균 18 ml의 멸균 80 % 글리세롤과 5 mL를 추가합니다. PSM ES4326 50 μg의 ml의 최종 농도로 냉각 매체를 추가 스트렙토 마이신, 스트렙토 마이신에 대해 저항성을 전달 감안할 - 1. </li><li> 접시를 붓는다. 100mm X 15mm 및 150mm X 15mm 배양 접시 : KB 미디어 판의 두 개의 서로 다른 크기를 준비합니다. 작은 페트리 접시 함유 배지는 기본 박테리아 배양 플레이트로서 기능하고, 세균이 플레이트를 계수로 큰 페트리 접시는 역할을한다. 주 : 플레이트 카운트 박테리아, 직사각형 플레이트는를 감소시키기 위해 사용될 수있다두 배 처리는 기존의 둥근 판에 비해 플레이트 당 플롯 할 수 있기 때문에 소모품 비용. <ol><li> 감염 실험을하기 전에 판을 따르십시오. 스트렙토 마이신, 황산 이후까지 2 ~ 3 개월 동안 4 ℃에서 보관 KB 매체 판은 점차 항생제 활동 (40)를 잃는다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 강화 된 질병 감수성 (EDS) <ol><li> 1 일 - 접시에 킬 박테리아 <ol><li> 이틀 EDS 분석하기 전에, 행진 PSM ES4326은 -80 C 글리세롤 재고 ° KB-연쇄상 구균 세균 배양 접시에와 24 ~ 48 시간 동안 28 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 제 2 일 - 액체 배양 물 식물을 시작 <ol><li> 28 ° CO / N을 1 스트렙토 마이신 250 rpm으로 흔들 - 50 μg의 용액을 포함하는 4 ml의 액체 KB 매체 멸균 시험관에 액체 문화를 시작합니다. 참고 : EDS 감염 분석의 경우, 유전자형 추천입니다 당 6 식물을 사용하여에디션. STI와 MTI 분석의 경우, 처리 당 유전자형 당 6 식물 권장합니다. 박테리아 접종 들어, 0.3 내지 0.6의 λ 600 ㎚에서 광학 밀도를 갖는 신선한 배양액을 사용하는 것이 권장된다. </li><li> 마크 샘플링에 감염된 조직을 쉽게 식별 무딘 엔드 방수 마커 잎 번호 5와 6의 잎자루 (그림 1). 기공의 개구부를 강화하고 리프로 병원체 용액 입구를 촉진, 20 분 동안 바닥에서 평탄 담가 아니라 식물을 물, 그 여분의 물을 배수. 주 : 대안 적으로, 투명한 돔 평면을 커버하고 개구 기공을 증가 2-4 시간 동안 물에 담가. </li><li> 3 일 - 병원체 희석 주사기 침투 참고 : 아침 시간 동안 병원체 감염 취약 유전자형에서 가장 뚜렷한 질병 증상의 병원균의 증식 및 개발에 최적입니다. 감염되고 유지하기 위해 모든 노력을일관된 이온 타이밍 실험 복제 간의 변동을 줄이는 데 도움 주기성 리듬과 낮의 유전자 조절 (41, 42)의 영향을 제거한다. <ol><li> 실온에서 2 분 동안 9,600 XG에서의 microcentrifuge 1.5 ML 튜브의 박테리아 문화를 펠렛과 상층 액을 버린다. 멸균 10 1 ml의 밀리미터의 MgCl 2 세균성 펠렛을 재현 탁. 참고 : 마그네슘 양이온 (P)의 운동성 및 접착력을 향상시킬 수 있습니다 syringae (43). 또한, 같은 농도에서 황산을 사용합니다. 멸균 물은 마그네슘 염 솔루션에 대한 허용 대체합니다. </li><li> 50 mL의 원심 분리 튜브에 10 mM의의 MgCl 2 9 mL를 박테리아 현탁액을 희석 및 λ = 600 nm에서 분광 광도계로 세균의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 최종 OD600nm에서 10 밀리미터의 MgCl 2 = EDS 감염 분석을위한 0.0002와 박테리아를 희석. </li><li> 잎 침투희석 된 세균 용액을 포함 (일반적으로 인슐린 주사기로 알려짐) 1ml의 끝이 무딘 바늘 주사기. </li><li> 전체 용량의 주사기를 위로 기입하지 마십시오. 침투 과정에서 훨씬 더 잘 제어 할 수 있도록 0.5 ~ 0.6 ㎖로 그것을 입력합니다. </li><li> 집게 손가락의 위에 판의 하부면을 노출하고 부드럽게 손가락의 도움으로 잎 위치를 조정. 그 압력이 균일하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 잎 표면에 수직으로 주사기를 놓습니다. 잎 손상을 줄이기 위해 침투하는 동안 주맥 지역을 피하십시오. </li><li> 천천히 세균 솔루션을 침투하는 플런저를 밀어; 리프 어두운 색으로 표시된 바와 같이 잎 엽육에 액상 항목 가시화 될 것이다. 잎의 전체 표면을 침투 시도합니다. 이것은 하나의 시도에서 달성되지 않을 경우, 다른 침윤 스폿을 선택하고, 전체 잎 표면이 피복 될 때까지 상술 된 작업을 반복한다.</li><li> 완료되면, 부드럽게 별도의 병원체 용액을 제거 흡수 조직과 잎을시킨다. 시각적으로 손상 감염된 잎의 조직을 검사합니다. 참고 : 침투가 완료된 후 원형 주사기 인상은 볼 수 없습니다해야합니다. </li><li> 원래의 성장 조건으로 그들을 반환하기 전에 1 ~ 2 시간 동안 건조하기 위해 침투 식물을 남겨주세요. 다음, 물 맑은 돔 스프레이 커버 감염된 식물을 2 시간 동안, 다음 구멍에 2-3를 생성하고 감염 실험의 나머지 부분에 걸쳐 그것을 떠날 돔 균열. 참고 : P. 이후 syringae은 동일한 시설에서 배양 다른 식물에 감염 인자를 전파의 위험이없고, 공기 병원체 아니다. 그러나, 추가 예방 조치로, 인근에 감염된 식물과 다른 실험 식물 사이의 물리적 접촉을 피하십시오. 투명 돔 플랫 취재하면 병원체 독성을 증가시키고 질병의 진행을 가속화 할 것이다.커버링 기간이 단계 및 최적의 기간이 사용자의 식물 성장 설비의 습도에 기초하여 결정되어야 위해 필요하다. </li></ol></li><li> 5 일 - 미디어 판을 사전 건조 <ol><li> 냉장 유니트에서 150mm X 15mm의 KB 판을 가지고 접시에있는 기존의 물 응축을 건조. 약 24 시간 동안 실온에서 그들을 유지하여 건조 판. 이 프로세스의 속도를 높이려면 30 ~ 60 분 동안 금이 그들의 뚜껑 층류 후드에 배치합니다. 주 :이 단계는 다음 단계에서 판의 표면에 원형의 액적 형성에 중요하다. </li></ol></li><li> 6 일 - 병원균의 성장을 정량화 주 : 다음 병원체 정량화 과정이 동일한 양의 박테리아가 식물 잎의 형태를 변경 한 경우에, 특히, 리프로 전달 확인을 위해 감염 후 이전의 시점에서 수행 될 수있다. <ol><li> 출현 후 감염된 조직을 처리백화 현상의 감수성 유전자형에 감염된 조직의 황색으로 표시하지만, 괴사 성 병변의 개발 (그림 2B) 전에. 참고 : 추천 샘플링 시간이 삼일 병원균 접종 후입니다. 병원균의 성장이 환경 적 요인들에 따라 달라질 수 있기 때문에, 인큐베이션의 길이는 2 ½ -3- ½ 일의 범위 내에서 변화 및 ​​사용자의 식물 성장의 시설에서 감염의 진행에주의 관찰에 의해 결정될 필요가있다. <ol><li> 각각의 유전자형 (그림 1) 6 연마 튜브를 준비합니다. 한 스테인레스 스틸 연마 공을 놓고 각각의 튜브에 10 밀리미터의 MgCl 2 멸균 500 μl를 추가합니다. </li><li> 공장에서 감염된 잎을 분리하고 1 구멍 용지 펀치 (그림 1)과 잎 디스크를 펀치. 참고 : 샘플링 오차를 최소화 동일한 위치에서 각각의 표본 잎 펀치하려고. 상단에서 리프 디스크의 샘플링잎의 권장합니다. </li><li> 무작위로 집게를 사용하여 각 연마 튜브 (두 개의 서로 다른 식물에서) 2 잎 디스크를 넣습니다. </li><li> 상기 튜브를 밀봉하고 10 분 동안 최대 속도로 높은 처리량 모지 나이저 (분당 1,600 획)로 조직을 균질화. 조직이 잘 균질화하고 솔루션으로 인해 감염된 잎에서 엽록소 릴리스로 녹색으로 될 때까지 필요한 경우이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 균질화 기다리는 동안 멀티 채널 피펫 및 피펫 저장조를 사용하여 180 μL 된 10 mM의 MgCl 2를 96 웰 배양 플레이트의 제 6 행들을 채운다. </li><li> 분쇄 후, 96 웰 플레이트의 첫 번째 행으로 접지 조직 현탁액 20 μL를 전송하고 상기 액체를 위로 및 아래로 반복 피펫 팅에 의해 혼합한다. 조직의 작은 조각이 팁을 방해하는 경우, 용액의 정확한 용적을 습득 2-3 mm 정도를 클립. <ol><li> 상단 O에 물방울을위한 충분한 공간을 제공하기 위해플레이트, 공간 다른 행에 다른 유전형의 조직 (그림 1) F. 10 배 연속 희석을 준비하기 위해, 두 번째 행에 20 μL의 액체를 전송하고 여섯 번째 희석 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 전사 나누어 피펫 팁 (도 1)를 사용하여 150mm X 15mm KB 플레이트 상에 96 웰 플레이트에서 용액 20 μL. 가장 집중에 가장 묽은 현탁액에서 작업 할 수 있습니다. 참고 : 번째로 희석 대부분에서 진행 것은 불필요한 희석 사이에 피펫 팁을 변경할 수 있습니다. 플레이트를 미리 잘 건조 된 경우 (일반적으로 15 ~ 30 분)에 흡수 될 때까지 전송 된 액체 방울은 매체의 위에 그대로 유지한다. 건조 시간 RT와 습도에 따라 달라집니다. </li><li> 뚜껑이 금이 실온에서 접시를 닦아냅니다. 더 이상 액체가 플레이트 표면에서 관찰 할 수 없습니다되면, 뚜껑, 반전을 닫고 실온에서 플레이트 또는 28 ° C 배양기를 품어. </li><li> 식민지가 표시 될 때까지 40 ~ 60 시간 동안 번호판을 품어. 판의 성장 단위 (CFU)를 형성 식민지의 예측 10 배 드롭 (그림 2C)를 반영하는지 확인합니다. 그들이 자라다과 식민지 융합 전에 박테리아를 계산합니다. 중첩 콜로니가없는 최저 희석 박테리아의 수를 결정한다. 일반적으로 선호 희석은 10 ~ 50 식민지 사이에 포함됩니다 계산합니다. 주 : 변화는 기술 복제 사이에 존재할 수있다; 따라서, 각 복제에 대한 최저 희석 따로 결정되어야한다. </li><li> 세균 증식의 레벨을 계산하기 위해, 로우 (R)뿐만 아니라, 서면으로 복제 기술 (T) 내의 세균 수의 수를 기록. 콜로니 형성 단위의 수를 결정합니다 - 식을 통해 CFU / 잎 디스크를 : CFU / 잎 디스크 = (T는 × 10 R / 20) 2분의 500 × </li><li> PRODU 다음 스프레드 템플릿에 데이터를 입력그래프 (도 1)에 세륨 (스프레드 시트 데이터 분석 템플릿 파일은 표 2 참조). 각 데이터 포인트는 대수 스케일에 여섯 복제 기술의 평균으로 표현된다. 오차 막대는 평균값의 95 % 신뢰 구간을 나타내는 (N = 6). 참고 : 95 % 신뢰 구간의 산출 수단에서, 기술의 복제 수에 기초하여 조절 될 필요가있다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. SA-트리거 내성 (STI) <ol><li> 주 1 : 단계 3.1에 ​​기재된 것과 동일한 절차를 수행. </li><li> 주 2 : 액체 세균 배양 (단계 3.2) 식물에 물을하고 시작하는 것 외에도, SA 파생 나트륨 살리 실 레이트 (21)의 외부 응용 프로그램에 의해 저항을 유도한다. 참고 : 순수 SA 가난한 물 용해도가 이전의 pH 조정이 필요, 따라서이 분석하지 않는 것이 좋습니다입니다. <ol><li> 피에 대한 SA-매개 방어를 유도하기 위해 syringae와 미래의 감염 (21)에 대한 주요 식물,(모의)을 벌금 1 mM의 나트륨 살리 실 레이트의 안개 또는 H 2 O 24, 스프레이 식물 병원균 감염 전에 16 ~ 24 시간. </li></ol></li><li> 주 3 : = OD600nm에서 0.001을 병원체 희석을 준비하고 주사기 침투 (단계 3.3)로 전체 잎 표면에 박테리아를 밀어 넣습니다. </li><li> 6 일 방법 : EDS 분석 (단계 3.4 및 3.5)에 기재 한 바와 같이 병원체 정량 및 계산 과정의 경우, 절차를 따르십시오. 접시와 카운트 H 2 O 및 나트륨 살리 실 레이트 - 별도 전처리 샘플. 전처리 된 식물 - 야생형 애기 장대의 경우, 병원균의 성장 1-2 log 감소는 나트륨 살리 실 레이트로 예상된다. </li></ol> 5. MAMP 트리거 면역 (MTI) 참고 :이 분석에서 우리는 애기 장대 야생형 골-0 및 돌연변이 fls2 및 EFR 식물을 사용합니다. FLS2 및 EFR 플라즈마 막 지역화 패턴 인식 수용체 (PRRS) flg22 및 elf18가 인식 할 수있는, respe 있습니다ctively 9, 10. PSM ES4326 외부 MAMP 전처리 및 주사기 침투 다음 돌연변이에 변경되지 않은 병원균의 성장에 의해 표시된다 MAMP의 특정 유형에 무감각 각 PRR 결과의 손실. <ol><li> 제 1 일 및 2 : 단계 3.1 및 3.2에 기술 된 것과 동일한 절차를 수행. </li><li> 주 3 : MAMP 전처리 및 병원체 감염 <ol><li> 의 MAMP 트리거 면역을 설정 플라 젤린 에피토프 flg22 또는 EF-화 에피토프 elf18과의 1 μm의 솔루션을 준비하기 위해 병원체 감염 (단계 3.3.3-3.3.6) 이전에 전체 잎 표면에 4 시간에 그것을 주사기를-침투. 이 피에 대한 MAMP 매개 방어의 유도를 허용합니다 syringae 프라임 미래 감염 6,37의 식물. 참고 : 공개 된 마이크로 어레이 데이터는 flg22 또는 elf18 처리 37,44 후 4 시간을 일 MAMP 응답 유전자의 최대 전사 재 프로그래밍을 밝혔다. 따라서, 4 시간은 좋습니다골-0 MAMP 처리 및 fls2 및 EFR 돌연변이 사이의 병원균 성장에 명확한 차이를 달성 초래 MAMP 사전 치료 기간. </li><li> 흡수성 티슈로 여분의 MAMP 솔루션을 제거하고 잎 내의 액체 흡수 과정을 속도를 폭로 식물을 둡니다. 주사기의 압력 침투의 부상 효과를 설명하기 위해, 제어 식물의 잎에 H 2 O를 침투. </li><li> 외경 600 ㎚에 병원균 희석을 준비 = 0.001 MAMP / H 2 O 전처리 주사기 침투하여 잎 (단계 3.3)의 전체 잎 표면에 박테리아를 밀어 넣습니다. </li></ol></li><li> 제 6 일 : 단계 3.4 및 3.5에 설명 된대로 병원균 정량 및 계산 과정의 경우, 절차를 따르십시오. 접시와 별도로 H 2 O와 MAMP 전처리 샘플을 계산합니다. 야생형 애기는 병원균 성장 1-2 log 감소는 다소 강한 더불어 MAMP 예비 처리 된 식물에서 예상flg22 의해 매개 ER 감소 elf18에 비해. </li></ol>

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<li>He, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+bacterial+suppressors+of+MAMP+signaling+upstream+of+MAPKKK+in+Arabidopsis+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cel%22%5BJournal%5D)">Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity.</a> Cel. 125, 563-575 (2006).</li>
<li>Gimenez-Ibanez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AvrPtoB+targets+the+LysM+receptor+kinase+CERK1+to+promote+bacterial+virulence+on+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio%22%5BJournal%5D)">AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants.</a> Curr Bio. 19, 423-429 (2009).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+PAMP-induced+MAP+kinase+cascade+by+a+Pseudomonas+syringae+effector+activates+plant+immunity+mediated+by+the+NB-LRR+protein+SUMM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microb%22%5BJournal%5D)">Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2.</a> Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).</li>
<li>Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions%3A+shaping+the+evolution+of+the+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cel%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response.</a> Cel. 124, 803-814 (2006).</li>
<li>Jones, D. A., Takemoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+innate+immunity+-+direct+and+indirect+recognition+of+general+and+specific+pathogen-associated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immuno%22%5BJournal%5D)">Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules.</a> Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).</li>
<li>Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+NB-LRR+signaling%3A+upstreams+and+downstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams.</a> Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).</li>
<li>Gassmann, W., Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-triggered+immunity+signaling%3A+from+gene-for-gene+pathways+to+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interac%22%5BJournal%5D)">Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks.</a> Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).</li>
<li>Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein+secretory+pathway+is+required+for+systemic+acquired+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Scienc%22%5BJournal%5D)">Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance.</a> Scienc. 308, 1036-1040 (2005).</li>
<li>Bednarek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+warfare+or+modulators+of+defence+responses+-+the+function+of+secondary+metabolites+in+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity.</a> Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).</li>
<li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitive+response-related+death%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Hypersensitive response-related death.</a> Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).</li>
<li>Fu, Z. Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+acquired+resistance%3A+turning+local+infection+into+global+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense.</a> Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).</li>
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<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+NPR1+protein+is+a+receptor+for+the+plant+defense+hormone+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Re%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid.</a> Cell Re. 1, 639-647 (2012).</li>
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<li>Nomura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+virulence+protein+suppresses+host+innate+immunity+to+cause+plant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scienc%22%5BJournal%5D)">A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease.</a> Scienc. 313, 220-223 (2006).</li>
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<li>Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Pseudomonas+syringae+pathovars+suggests+the+horizontal+gene+transfer+of+argK+and+the+evolutionary+stability+of+hrp+gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evo%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster.</a> J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).</li>
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<li>Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Arabidopsis+defense+genes+by+virulent+and+avirulent+Pseudomonas+syringae+strains+and+by+a+cloned+avirulence+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cel%22%5BJournal%5D)">Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene.</a> Plant Cel. 3, 61-72 (1991).</li>
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<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high%E2%80%90throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journa%22%5BJournal%5D)">A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).</li>
<li>Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+seedling+flood-inoculation+technique%3A+a+rapid+and+reliable+assay+for+studying+plant-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Method%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions.</a> Plant Method. 7, 32(2011).</li>
<li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microb%22%5BJournal%5D)">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).</li>
<li>Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSF-like+transcription+factor+TBF1+is+a+major+molecular+switch+for+plant+growth-to-defense+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio%22%5BJournal%5D)">The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition.</a> Curr Bio. 22, 103-112 (2012).</li>
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저자가 공개하는 게 없다.

인구 available 농지 감소와 증가함에 따라, 전 세계의 연구자들은 작물 개선을위한 긴급한 필요로하는 과제를 안고 있습니다. 수율은 매우 다양한 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 의해 영향을받을 수있다. 그 중에서도, 병원체 감염 단독 45 US에서 약 12 %의 손실에 대해 책임 작물 수확량 감소의 주요 원인 중 하나이다. 이 문제를 해결하려면, 대규모 연구는 모델 애기 장대에서 진행되고있다 - P. syringae의 pathosystem 종합적 성분과 식물 면역 반응의 조절 메카니즘을 특성화. 여기서는 최적화 P. 제시 syringae ES4326 주사기 침투 분석은 정량적으로 전체 공장 수준에서 식물 면역 반응에 미묘한 차이를 평가합니다. 여러 병원체 감염 분석은 식물 29,35 면역 반응을 특성화하기 위해 개발되어 왔지만, 주사기 침투 제공병원균의 같은 양이 감염된 조직에...

때문에 자신의 고착 자연, 식물은 지속적으로 다양한 라이프 스타일과 영양 전략 1을 나타내는 병원균의 과다에 의해 위협을 받고있다. necrotrophic 병원균 적극적으로 비밀 독소와 효소가 호스트 조직을 죽이고 죽은 세포 (1)에 공급하는 동안 첫 번째 근사, biotrophic 병원균, 영양분을 검색 할 수 살아 자신의 호스트를 유지한다. 병원균이라고 hemibiotrophs의 또 다른 그룹은 병원체의 축적 (2) 특정 임계 값에 도달시 necrotrophic 단계에 biotrophic 무대와 변화와의 감염 과정을 시작합니다. 효과적으로 이들 미생물로부터 자신을 방어하기 위해, 식물 병원체 공격을 검출 및 트리거하도록 여러 감시기구를 구비 한 복잡한 선천 면역을 진화 세포사 3뿐만 아니라 전신 획득 저항성 (SAR)을 4 프로그램 지역화. 현재의 연구는 필수 SIG의 특성에 초점을 맞추고naling 구성 요소와 식물 면역 체계 (5) 내에서 교차 회담. &quot;지그재그&quot;모델 5에 제시된 바와 같이, 식물 선천성 면역 반응의 제 1 층은 미생물의 침입을 검출하는 세포막 지역화 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 존재를 필요로한다. PRRS는 미생물 - 관련 분자 패턴 (MAMPs)를 인식하고 MAMP 트리거 면역 (MTI) 6을 설정할 수 있습니다. 항균 PR 단백질 7을 코딩하는 유전자의 전사 상향 조절을 유도 외에, MTI는 세포벽에 활성 산소 종의 생산 (ROS) 반응성 질소 종 (RNS) callose 증착 포함 병원균의 성장을 저지 다양한 이벤트에 이르게 뿐만 아니라 여러 키나제 시그널링의 활성화 경로로 8. 지금까지 여러 MAMPs 세균 flg22 9 포함, 애기 장대에서 MTI을 트리거 확인 된 </sup&gt; (편모로부터 유도 된 22 아미노산 단편)과 구조적 세포벽 성분 elf18 10 (박테리아 번역 연장 인자 화 18 아미노산) 11 펩티. 성공적인 감염을 확립하기 위해 어떤 특별한 병원체가 세포 내 또는 세포 내 공간으로 비밀 독성 이펙터 단백질하는 능력을 진화, 결과적 MTI을 억제하고 이펙터 트리거 감수성 (ETS) (12, 13)를 실행 하였다. 예를 들어, 독성 이펙터가 감염된 조직 내의 14-16 질병 발달을 유도하는 MTI의 유사 분열 촉진 인자 - 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 케스케이드 인산화를 비활성화 할 수있다. 호스트 및 병원체의 동적 공진화 동안 식물도 이펙터 단백질을 인식하고 병원체 병원성 17 분자 감쇠 역습 전략을 개발했다. 이 직간접 효과기 인식은 질병 저항 (R) 단백질 (18)에 의해 매개된다. T의 대부분밑단은 NB-LRR의 구성원 (염기 바인딩과 류신이 풍부한 반복) 가족 (19)이다. R 단백질에 의해 avirulent 이펙터의 인식은 이펙터 트리거 면역 (ETI) (20) 특징 강력하고 광범위한 면역 반응을 유도한다. 방위 유전자 21의 발현과 방위의 대사 (22)의 생산을 유도하는 것 외에도, ETI는 종종 인접 조직 (3) 내로 확산되는 병원균을 제한 과민 반응 (HR)라고도 급속한 국부 프로그래밍 된 세포 사멸을 이끈다. 프로그램 된 세포 사멸 국부 (23)에 더하여, 플랜트 (SAR) 4 전신 후천성 내성이라 장기 및 시스템 전체에 대한 면역 반응을 개시 할 수있다. biotrophic 병원체 공격시에, 식물 세포는 지방 조직과 조직 (24) 모두에서 내인성 phytohormone 살리실산 (SA)와 PR 단백질의 생합성과 축적을 발생시킨다. T를 통해그 공정은, 준비의 높아진 상태 병원균 (24)의 넓은 스펙트럼에 의해 후속 감염 동안 빠른 응답을 수비 장착 가능 비감염 나뭇잎에 달성된다. SA와 같은 합성 유사체 벤조 (1,2,3) 티아 디아 졸 -7- 카르 보 티오 S의 산 메틸 에스테르 (BTH) 및 2,6- dichloroisonicotinic 산 (INA) 살리실산 화학적으로 유도 할 수있다 (SA) 외부 응용 프로그램 24시 -Triggered 내성 (STI). 병원성 관련 유전자 1 (NPR1)의 Nonexpressor 로컬 전신 조직 21,25,26 모두 SA 매개 방어 반응 동안 중요한 전사 조절로서 SA 수용체 및 기능 중 하나가 될 것으로 제안된다. 그것은 결정적 NPR1은 SAR 확립에 필요하며 NPR1의 손실 슈도모나스 syringae 25 향해 극적인 감수성에 이르게하는 것이 입증되었다. 광범위 식물의 분자량 기여를 특성화식물 병원체 상호 작용 구성 요소들은 여러 생물 검정은 ROS 27 버스트를 포함한 특정 방위를 측정하는 이벤트들은 단백질 제품 (21)의 증착 callose 28 방어 유전자 발현 및 축적이 개발되어왔다. 이러한 개별 분석은 식물 면역 반응의 특정 형태에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그들 중 누구도하지만, 전체 공장의 수준에서 완전한 방어 반응을 나타낼 수 없습니다. 반대로, 감염 후 병원균 성장의 정량화는 유기체 수준에서 면역 반응의 전반적인 평가를 제공합니다. 따라서, 정확하고 높은 표준화 병원균 접종 분석법의 개발 및 최적화는 애기 면역 반응에 대한 연구 및 발견을 연료로 중요하다. 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae), 그람 음성 세균, Arabidops 포함한 공장 호스트의 범위에서 질병을 일으킬 수있는 것으로 확인되었다 phytopathogen(29)이다. 피 - 모델 식물 병원균 시스템, 애기 장대로 syringae 상호 널리 분자 메커니즘을 기초 식물 방어 반응 (29)을 이해하기 위해 적용되어왔다. 지금까지 50여 P. syringae의 pathovars는 다른 종의 식물 (30)을 감염시킬 능력을 근거로 확인되었다 . P. syringae 태양 광 발전. 토마토 DC3000 (PST DC3000) (31)와 P. syringae 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM ES4326) (32)는 두 개의 가장 널리 사용되는 광범위 특징 병원성 균주이다. 이외에도 식물에 의해 인식 및 MTI 응답을 트리거링되는 태평양 표준시 DC3000와 PSM ES4326은 MTI을 억제하고 병원균의 성장을 유리하게 31, 33 ETS를 트리거 이펙터 병원성 단백질을 분비 할 수있다. 기능적으로 애기 장대와 경찰 사이의 상호 작용을 해부하다 syringae, 여러0; 병원체 감염 방법은 병원체 전달 방식에 기초하여 개발되었다. 토양 재배 식물, 병원균은 주사기 침투, 진공 침투, 딥 접종 및 분무 접종 29,34에 의해 전달 될 ​​수있다. 최근 모 홍수 접종 분석이 조직 문화에 대형 스크린을 수행하기 위해 개발 된 젊은 애기 장대 식물 (35) 플레이트 성장. 주사기 침투는, 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나로서, 기공 (29)를 수동으로 불리는 천연 잎의 틈 사이로 apoplast으로 병원체를 제공한다. 경찰의 이러한 접근 방식을 통해, 동일한 양 syringae 감염된 잎 침투 할 수 있고, 식물 면역 반응의 강도는 반비례 병원균 성장 수준으로 상관된다. 따라서, 병원균의 성장의 정량화는 전체 공장 수준에서 면역 기능을 평가하기위한 최적의 방법 역할을합니다. 또한, 주사​​기의 침윤이 로컬 및 전신 조직을 구별 할 수있는 ㄴ 수SAR (36)의 기초가되는 분자 메커니즘의 특성에 해당하는 전자. 다음 프로토콜에서, 우리는 강화 된 질병 감수성 (EDS)에 대한 애기 장대 돌연변이 체를 선별 PSM ES4326에 최적화 된 주사기 침투 분석에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 두 애기 유전자형을 사용합니다 야생형 생태형 컬럼비아 - 0 (골-0) 식물 (제어) 및 npr1-1 기능 상실 돌연변이를 (hypersusceptible) 즉 병원성 균주 PSM ES4326 (37)에 감염됩니다. The npr1-1 돌연변이 티로신에 고도로 보존 된 히스티딘을 변경하고 25 비 기능 단백질을 렌더링하는 NPR1 분자의 ankyrin 반복 합의 시퀀스 내에서 점 돌연변이를 전달합니다. 또한, 주사​​기 침윤 분석의 변형의 수는 MTI 및 STI를 포함한 면역 반응의 특정 층에서의 결함의 정량화를 허용하는지 설명된다.

<table><tbody><tr><td>메트로믹스 360&nbsp;</td><td>Grosouth</td><td>SNGMM360</td><td></td></tr><tr><td>대형 냄비</td><td>Grosouth</td><td>TEKUVCC10TC</td><td></td></tr><tr><td>12 x 6 인서트</td><td>Grosouth</td><td>LM1206</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 구멍이 없는 아파트</td><td>Grosouth</td><td>LM1020</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 구멍 있는 아파트</td><td>Grosouth</td><td>LM1020H</td><td></td></tr><tr><td>비닐 전파 돔</td><td>Grosouth</td><td>CW-221</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0122-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate 이염기성 삼수화물&nbsp;</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>151946</td><td></td></tr><tr><td>한천&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이</td>트 <td>Bio Basic Inc</td><td>SB0494</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>150 x 15 mm 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80150</td><td></td></tr><tr><td>직사각형 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-450&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahydrate</td><td>Bio Basic Inc</td><td>MB0328</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Bio Basic Inc</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; </td><td>Bio Basic Inc</td><td>MN1988</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9992493&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>연삭관&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>B1257</td><td></td></tr><tr><td>그라인딩 튜브용 캡</td><td>Denville Scientific</td><td>B1254</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 그라인딩 볼</td><td>Fisher Scientific</td><td>2150</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>소듐 살리실레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>s3007-1kg</td><td></td></tr><tr><td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td><td>유전자 주문</td><td></td><td></td>제작</tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>유전자 스크립트</td><td>주문</td><td></td>제작</tr> 홀 <tr><td>펀처</td><td>스테이플</td><td>146308</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>952000006</tr><tr><td>PowerGen High-Throughput Homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-503</td><td></td></tr><tr><td>Accu 스핀 마이크로 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 (10-100 &마이크로; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.043</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 (30-300 &micro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.060</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (20&마이크로; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3120 000.038</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>3552-HR</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie 영구 마커</td><td>스테이플</td><td>507130</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-890</td><td></td></tr></tbody></table>

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (pseudomonas syringae)</em&gt; pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

전문 모바일 면역 세포의 부재에서, 식물은 현지화 프로그램 된 세포의 죽음과 전신 획득 저항성이 병원균의 공격으로부터 자신을 방어하기 위해 사용한다. 전체 식물 면역 반응 애기 특정 유전자의 기여는 구체적 정량적으로 감염된 조직 내의 병원균의 성장을 분석하여 평가할 수있다. 지난 3 년 동안의 hemibiotrophic 세균은 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM의 ES4326)는 널리 애기 면역 반응의 기초가되는 분자 메커니즘을 조사하기 모델 병원체로 적용되었습니다. 잎 조직으로 병원균을 제공하는, 다중 접종 방법이 확립되어, 예를 들면, 주사기 침윤 접종 딥, 스프레이, 진공 침윤, 홍수 접종. 다음 프로토콜은 성인의 잎으로 병원성 PSM ES4326를 전달하도록 최적화 된 주사기 침투 방법을 설명하는데애기 장대 식물을 토양에서 재배하고 정확하게이 병원균으로 강화 된 질병 감수성 (EDS)을 선별. 또한,이 프로토콜은 상기 살리실산 (SA) -Triggered 내성 (STI)와 MAMP 트리거 내성 (MTI)를 포함한 식물 방어 다른 층 내의 특정 결함 면역 해부 여러 전처리를 보충 할 수있다.

우리가 여기서 설명하는 프로토콜 최적화 (P)를 나타냅니다 syringae 주사기 침투 분석은 정량적으로 애기 장대 식물의 면역 반응을 알아보고자 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, PSM ES4326 주사기의 침윤은 연속 희석 콜로니 열거 통해 병원균 추출 및 정량 따른다. 프로토콜 텍스트 내에서 3 단계에서 설명 된 바와 같이, ES4326 PSM에 대해 향상된 질환 감수성 (EDS)를 OD = 0.0002으로 접종하여 감염에 의해 평가 될 수있다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 고도로 민감한 npr1-1 돌연변이는 야생형 골 -0- 식물에 비해 약 2.5 로그 (300 배) 이상의 병원체의 성장이있다. 실험 조건에 따라 npr1-1 식물 1.5-2.5 로그의 범위 내에서 가장 일반적인 결과, 골 ...

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

본 절차의 전반적인 목표는 최적화된 주사기 침투 분석법을 통해 Arabidopsis diliana의 면역 반응을 정량적으로 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 주사기 침투를 이용하여 기공이라 불리는 자연 개구부를 통해 잎 내부로 박테리아를 수동으로 주입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 질병 증상이 나타난 후 감염된 잎 조직의 디스크를 얻는 것입니다.다음으로, 고처리량 균질화를 통해 잎 디스크에서 박테리아를 추출합니다. 마지막 단계는 군락 수를 측정하기 위해 박테리아 계수 플레이트에 연속 희석 및 점적하는 것입니다. 최종적으로, 각 잎 디스크 내의 박테리아 성장은 식물 면역 반응의 상대적 강도와 상관관계를 가질 수 있습니다.이 방법은 생물적 스트레스에 대한 방어 반응에 기여하는 유전자를 식별하는 것과 같이 식물 면역 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 감염된 식물 조직 내의 병원균 성장을 정밀하게 정량화할 수 있으며, 발달 단계가 서로 다른 잎을 샘플링함으로써 발생하는 실험 오차를 방지할 수 있다는 점입니다. 본 방법은 강독성 박테리아 병원균 감염에 대한 식물의 면역 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 살리실산이나 미생물 연관 분자 패턴(MAMP)에 의해 유도되는 면역 반응과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 조직 손상 없이 박테리아를 잎으로 전달하는 데 어려움을 겪습니다. 다음 절차의 시연은 제 연구실의 박사 후 연구원 Hindu와 대학원생 Shalu, Yali가 맡게 됩니다. 이번 영상에서는 질병 감수성 증진 분석법에 대해 시연하겠습니다.실험 전, King's B 또는 KB 배지 플레이트를 준비합니다. 프로토콜 본문에 설명된 대로 KB 고체 배지 1L를 제조하고 마그네틱 교반기 위에서 식힙니다. 배지가 손으로 만질 수 있을 정도로 식으면 80% glycerol, 1M magnesium sulfate 및 streptomycin을 배지에 첨가합니다. 두 가지 다른 크기의 KB 배지 플레이트에 배지를 붓습니다. 작은 페트리 접시는 1차 박테리아 배양 플레이트로 사용하고, 더 큰 페트리 접시는 박테리아 계수 플레이트로 사용합니다.분석 스트리킹 2일 전에 플레이트를 4°C에서 보관하십시오. -80°C 글리세롤 스톡의 박테리아를 KB 스트렙 박테리아 배양 플레이트에 스트리킹하고, 다음 날 28°C에서 24~48시간 동안 배양하십시오.스트렙토마이신 50 µg/mL이 포함된 액체 KB 배지 4 mL를 멸균 시험관에 넣어 액체 배양을 시작합니다. 28 °C에서 250 RPM으로 하룻밤 동안 진탕 배양합니다. 실험에 사용할 Arabidopsis 식물은 액체 박테리아 배양을 시작하는 당일에 프로토콜 본문에 상세히 기술된 조건에서 재배합니다.샘플링 시 감염된 조직을 쉽게 식별할 수 있도록 5번과 6번 잎의 꽃잎을 뭉툭하고 방수되는 마커로 표시합니다. STA의 개구부를 넓혀 병원균 용액이 잎의 수분 속으로 쉽게 들어갈 수 있도록, 화분 바닥을 20분 동안 담가 식물에 충분히 물을 공급합니다.20분 후, 과잉의 물을 제거합니다. 애기장대 식물의 감염 절차가 수행됩니다. 액체 배양 시작 다음 날에 진행합니다.박테리아 배양액을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 9,600 Gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 상온에서 상층액을 제거하고 1 milliliter의 멸균된 10 millimolar 염화마그네슘으로 박테리아 펠렛을 재현탁합니다. 50 milliliter 원심분리 튜브에 10 millimolar 염화마그네슘 9 milliliter를 가하여 박테리아 현탁액을 희석합니다. 박테리아의 광학 밀도를 측정한 후, 10 millimolar 염화마그네슘을 사용하여 최종 OD 600이 0.0002가 되도록 박테리아를 희석합니다.EDS 감염 분석을 위한 과정입니다. 침투 조작을 위해 흔히 인슐린 주사기로 알려진 1mL 뭉툭한 끝단 무침 주사기를 사용합니다. 침투 과정 중에 훨씬 더 정밀하게 제어할 수 있도록 주사기에 희석된 박테리아 용액을 0.5에서 0.6mL만 채우고, 주사기 용량을 끝까지 채우지 마십시오.검지 손가락 끝으로 잎의 뒷면을 받치고, 엄지손가락을 이용하여 잎의 위치를 조심스럽게 조정합니다. 잎의 손상을 줄이기 위해 압력이 균일하게 분산되도록 주사기를 잎 표면에 수직으로 배치합니다. 침투 과정 동안 중맥 부위는 피하도록 하십시오.플런저를 천천히 밀어 박테리아 용액을 침투시킵니다. 잎의 색이 더 어둡게 변하는 것을 통해 액체가 잎의 엽육으로 유입되는 것을 확인할 수 있으며, 여러 번 시도하여 잎의 전체 표면에 침투시켜야 합니다. 침투가 완료되면 흡수성 티슈로 잎을 가볍게 닦아내어 과잉의 병원균 용액을 제거합니다.감염된 잎 조직의 손상 여부를 육안으로 확인합니다. 침투시킨 식물을 1~2시간 동안 건조시킨 후, 원래의 생육 조건으로 되돌립니다. 투명한 돔 내부에 물을 분무하고 감염된 식물을 2시간 동안 덮어줍니다.그 다음 돔을 깨뜨려 2~3인치 정도의 구멍을 만들고, 보통 3일 정도 소요되는 나머지 감염 실험 기간 동안 그대로 둡니다. 병원체 성장을 정량화하기 하루 전, 150mm x 15mm KB 배지 플레이트를 미리 건조시킵니다.플레이트를 실온에서 약 24시간 동안 유지하여 건조합니다. 감수성 유전자형에서 감염 조직의 황화 현상으로 나타나는 경화 현상이 발생한 후, 괴사 병변이 발달하기 전에 감염된 조직을 처리하십시오. 각 유전자형당 6개의 분쇄 튜브를 준비합니다.각 튜브에 스테인리스 스틸 그라인딩 볼 1개를 넣고 멸균된 10 millimolar 염화마그네슘 500 µL를 첨가합니다. 다음으로, 식물에서 감염된 잎을 떼어내고 핀셋을 사용하여 1공 펀치로 잎 디스크를 무작위로 펀칭한 뒤, 서로 다른 식물에서 얻은 두 개의 잎 디스크를 각 그라인딩 튜브에 넣습니다. 튜브를 밀봉하고, 고효율 균질기를 사용하여 최대 속도로 10분 동안 조직을 균질화합니다.대기하는 동안 조직이 충분히 균질화되고, 감염된 잎에서 엽록소가 방출되어 용액이 녹색으로 변할 때까지 필요한 경우 이 과정을 반복합니다. 균질화를 위해, 96웰 배양 플레이트의 처음 6개 행의 각 웰에 10 mM 염화마그네슘 180 µL를 채웁니다. 분쇄된 조직 현탁액 20 µL를 96웰 플레이트의 첫 번째 행의 각 웰로 옮기고, 액체를 반복적으로 피펫팅하여 혼합합니다.작은 조직 파편으로 인해 팁이 막힌 경우, 팁 끝을 2~3mm 정도 잘라내어 용액의 정확한 부피를 취할 수 있도록 합니다. 플레이트 상단의 드롭렛을 위한 충분한 공간을 확보하기 위해, 서로 다른 유전자형의 조직을 교차 행에 배치하십시오. 10배 연속 희석액을 준비하려면, 조직 현탁액 20 µL를 두 번째 행으로 옮기고 이 과정을 여섯 번째 희석 단계까지 반복합니다. 분할 피펫 팁을 사용하여 96-웰 플레이트의 용액 20 µL를 150 mm x 15 mm KB 플레이트로 옮깁니다.희석 단계 사이마다 피펫 팁을 교체할 필요가 없도록 가장 희석된 현탁액부터 가장 농축된 현탁액 순으로 작업하십시오. 뚜껑을 약간 열어둔 상태로 플레이트를 실온에서 건조시키십시오. 플레이트 표면에 더 이상 액체가 보이지 않으면, 뚜껑을 닫고 플레이트를 뒤집어 실온에서 배양하십시오.콜로니가 보일 때까지 플레이트를 40~60시간 동안 배양하십시오. 플레이트 위의 박테리아가 예상된 10배 단계적 감소의 콜로니 형성 단위(CFU)를 반영하는지 확인하십시오.박테리아가 과하게 증식하여 콜로니가 융합되기 전에 수를 측정하십시오. 콜로니가 서로 겹치지 않는 가장 낮은 희석 배수에서의 박테리아 수를 결정하십시오. 일반적으로 계수하기에 가장 적절한 희석 배수는 10개에서 50개 사이의 콜로니를 포함하며, 이는 기술적 반복 실험(technical replicates)마다 다를 수 있습니다.박테리아 증식 수준을 계산하려면, R을 행의 수, T를 각 기술적 반복 내의 박테리아 수로 정의한 다음, 이 공식을 사용하여 잎 디스크당 콜로니 형성 단위 수를 결정합니다. 이후 이 데이터를 사용하여 그래프를 생성합니다. 각 데이터 포인트는 로그 스케일로 표시된 6회 기술적 반복의 평균값으로 나타냅니다.오차 막대는 평균 질병 증가의 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. P-S-M-E-S 43 26에 대한 감수성은 OD 600이 0.0002인 접종액을 이용한 감염으로 평가되었습니다. 결과에 따르면, 고감수성 NPR 1-1 돌연변이체는 야생형 Columbia 0 식물에 비해 병원균 성장량이 약 2.5 log 또는 300배 더 많음을 보여줍니다.주사기 침투 분석법(syringe infiltration assay)은 면역 반응의 서로 다른 층을 평가하기 위해 수정될 수 있습니다. 살리실산(salicylic acid)에 의해 유도되는 면역력을 평가하기 위해, 나트륨 살리실레이트(sodium salicylate)를 외부에서 처리하여 면역 반응을 유도하며, 이는 병원균의 성장을 통해 정량화됩니다. 살리실산 수용체이자 살리실산 의존적 표적 유전자의 주요 전사 공조절 인자로 작용하는 NPR R one이 결손되면, 외부에서 처리한 살리실산 유도체에 대해 무감각해집니다.미생물 연관 분자 패턴(microbe associated molecular pattern)에 의해 유도되는 면역 반응을 특성화하기 위해, 식물을 두 가지 알려진 유도제로 전처리하였습니다. FLAG 22와 L 18을 사용하였으며, FLAG 22를 처리한 야생형 Columbia 0 식물에서는 박테리아 개체 수가 1 log 또는 10배 감소한 반면, FLS2 돌연변이 식물에서는 박테리아 성장을 억제하는 효과가 유도되지 않았습니다. 마찬가지로, EFR 돌연변이 식물은 L 18 전처리에 반응하지 않았습니다.이 영상을 시청하신 후, 주사기 침윤 분석법을 통해 Arabic opsys의 면역 반응을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 질병의 진행 상황을 모니터링하고 corsis가 나타난 후 조직을 샘플링하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6은 hemi atrophic 병원균입니다.따라서 샘플링은 신경영양 단계(neurotrophic stage)로 전환되기 전에 수행되어야 합니다. 이 절차 이후에는 정량적 실시간 PCR(quantitative real time PCR) 및 웨스턴 블럿 분석(Western blood analysis)과 같은 다른 방법들을 통해 어떤 특정 면역 신호 전달 경로에 이상이 생겼는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 살아있는 박테리아를 다루고 있다는 점을 잊지 마십시오.Pseudomonas Senge는 인간에게 병원성을 띠지 않지만, 본 절차를 수행하는 동안 오염된 소모품과 감염된 식물을 적절하게 폐기하시기 바랍니다.

bacterial-leaf-infiltration-assay-for-fine-characterization-plant

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Nicotiana benthamiana 공장에서 PTI에 대한 세포 죽음 기반 분석을 설명합니다.

병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작​​은 이전에 보고된 최소화합니다.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

출처: Lee, H. et. al., 감염 중 박테리아로부터 전달되는 이펙터를 시각화하기 위한 녹색 형광 단백질 시스템 분할. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경과 결합된 분할 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 상보를 사용하여 식물 세포에서 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 숙주 세포 세포질로의 이펙터 전좌를 정확하게 시각화할 수 있습니다.

식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

출처: 루피안, J. S., et.al. 식물 조직 내 슈도모나스 시링기 유전자 발현의 단세포 분석. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 아라비도시스 식물 잎에 박테리아 병원체를 주입하는 진공 침투 방법을 시연합니다. 이 방법은 준비된 박테리아 현탁액과 진공 펄스를 사용하여 기공을 균일하게 통과시켜 잎 감염을 통제합니다.

진공 침투를 통한 애 기장대 잎에 박테리아 병원체를 접종하기

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

우리는 시간의 연장된 기간 동안 형광 라이브 이미징 애기 thaliana 잎을 수행 하기 위한 간단 하 고 다재 다능 한 방법 보고. 우리는 식물 면역 반응의 spatiotemporal 이해에 대 한 예를 들어 면역 관련 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 유전자 변형 애기 식물을 사용 합니다.

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을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석

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